真核生物启动子的研究及应用

生物技术通讯

Vol．21No．2Mar．,2010

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doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．02．031

综述

真核生物启动子的研究及应用

黄玉1,2，杨波1，迟小华3，刘丽宏3，李薇2，卢学春1

1．解放军总医院南楼血液科，北京100853；2．吉林大学第一医院血液肿瘤中心，吉林长春130021；3．解放军第二炮兵总医院药剂科，北京100800

［摘要］

随着基因工程的发展，常常需要构建能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平

影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此，研究启动子的克隆方法，对探讨基因表达调控和构建表达载体至关重要。近年来有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功。我们简要综述启动子克隆方法及应用，阐述了启动子的一般特点，介绍了研究启动子功能的常用方法及在肿瘤治疗中的应用前景，为肿瘤靶向治疗提供理论依据及探索新的治疗途径。［关键词］

启动子；真核生物；功能研究

［中图分类号］

Q78［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)02－0275－05

InvestigationandApplicationofPromotersofEukaryoticOrganism

HUANGYu1,2,YANGBo1,CHIXiao－Hua3,LIULi－Hong3,LIWei2,LUXue－Chun1

1．DepartmentofGeriatricHematology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853;2．HematologyandOncolo-gyCenter,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021;3．DepartmentofPharmacy,ChinesePLASecondArtillerymanGeneralHospital,Beijing100800;China

［Abstract］

Itoftenneedstobuildahigh－levelexpressionofheterologousproteinexpressionvectorwiththede-Promotermakesagreatinfluenceontheexpressionlevelsofexogenousprotein

Therefore,

theinvestigationsonpromoter

velopmentofgeneticengineering．

asanimportantcomponentofexpressionvectoringeneticengineering．manyimprovementsonpromotercloningmethodsinrecentyears．

cloningmethodsareessentialtolearngeneexpressionregulationandconstructexpressionvectors．Sofar,thereare

Thisreviewintroducedcloningmethodsandap-plicationofpromoterwithanemphasisonpromoterfunctioninvestigationandapplicationintheaspectofcancertherapytoprovideatheoreticalbasisandexplorenewtherapeuticapproachesforcancertargetedtherapy．

［Keywords］

promoter;eukaryoticorganism;functionstudy

启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达程度，像“开关”一样，通过与转录因子结合控制基因的活动。启动子分为三类，即rRNA基因启动子（Ⅰ型）、mRNA基因启动子（Ⅱ型）和tRNA基因启动子（Ⅲ型）。Ⅰ型和Ⅲ型启动子位于转录起始位点的上游，结构相对简单。真核生物启动子属于Ⅱ型启动子，该型启动子相对复杂，位于结构基因5＇端上游，能够指导全酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，并启动基因转录。Ⅱ型启动子主要包括TATA框、起始子、GC框、CAAT框等，其中TATA框和起始子又称为核心启动子[1]，对转录的正确起始可能起重要作用。TATA框一般位于－26～－34bp处，绝大多数在（－31±2）bp处，其一致性序列为TATAWAW（W代表A或T）。TATA框在真核生物中并不是一成不变的，对果蝇205个

核心启动子中TATA框的分析表明，有43％的结构基因的启动子中有TATA框[2]。另有一项对2541条真核生物启动子的生物信息学分析表明，23．85％的真核生物启动子序列中至少有1个TATA框[3]。已知作用于TATA框的转录因子有6种，分别为TFⅡ

A、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH。GC框一

般位于TATA框上游，在转录起始位点前－23～－128

bp的区域内分布比较集中，一致性序列为GTGGGCGGGGCAAT。有47．3％的真核生物启动子序列中至少有1个GC框[3]，它是调节蛋白SP1的结合之处。CAAT框在真核生物启动子上的分布与

［收稿日期］［基金项目］［作者简介］［通信作者］

2009－11－04

国家自然科学基金（30772597，30873086）黄玉（1983－），女，硕士研究生

卢学春，（E－mail）luxuechun＠126．com；刘丽宏，（E－mail）hongllh＠yahoo．com．cn

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GC框相似，主要分布在转录起始位点前－159～－51bp的区域内，其保守序列为GGCTCAATCT。有42．35％的真核生物启动子序列中至少有1个CAAT框[3]，与CAAT框结合的蛋白称为CBF，由CBF－A、CBF－B和CBF－C组成，三者形成三聚体才能结合CAAT序列。研究显示[4－6]，启动子的另一个

显著特点是富含A－T区，A／T易解链，有利于转录起始，其既可以作为正调控因子，也可以扮演负调控因子的角色。一些与A／T区域结合的蛋白质及其序列特征也已被确定[7－9]。启动子上还存在着一些与反式作用因子相互作用的正负调控序列。

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基础，杨波等[13]构建了含有糖皮质激素受体（GR）、

cAMP结合蛋白（CREB）和雌激素受体（ER）反应调

控元件的人ID4基因启动子pGEM－TEasy表达载体，为研究地塞米松、cAMP和雌激素调控ID4启动子活性及ID4基因的表达打下了基础。可见，采用生物信息学的综合分析方法，是进一步研究靶基因表达调控的基础，是一条方便快捷、实用的途径。

2启动子的实验研究

用生物信息学初步预测和分析启动子序列后，

进一步通过实验确定启动子上的顺式元件及其功

1生物信息学分析与预测

利用生物信息学对获得的启动子序列进行初

能，通常是将启动子片段与报告基因融合构建表达载体转化离体培养细胞，检测报告基因在离体细胞中的表达情况，具体分析启动子功能，明确顺式作用元件的作用。目前，研究启动子功能的实验方法主要有瞬间转化分析、突变分析，以及近年发展起来的凝胶阻滞实验、DNA印迹实验等。

步预测与分析，可为进一步确定其功能奠定基础。常用的真核启动子预测相关数据库和软件资源包括：①EPD数据库，这是目前惟一一个源自实验数据的真核生物启动子数据库，是常用的预测软件测评的手段之一；②PLACE数据库，只包括维管植物的信息，其他与植物顺式作用元件同源的非植物模体也同时被收录，并且所收录信息根据实验最新进展随时得到更新；③转录调控区域数据库TRRD，其数据均来源于已发表的科学论文，包含特定基因各种结构与功能特性，包括转录因子的结合位点，启动子、增强子、沉默子的位置，以及基因表达调控模式等；④转录因子数据库TRANSFAC，这是一个真核顺式作用元件和反式作用因子的数据库，数据搜集的对象包括从酵母到人类。

卢学春等[10－11]成功地利用生物信息学方法预测了ID4基因的表达调控机制，并通过实验室工作进行了证实。在此基础上，卢学春等[12]又利用TESS和

2．1转化分析

对某些基因，可将其启动子序列连接上报告基

因，通过载体主要是质粒介导转化离体细胞，分析检测离体细胞中报告基因的表达，结合构建不同的缺失序列，从而确定启动子的不同片段的不同功能，常用的是构建一系列5＇缺失片段和报告基因融合表达载体，以进一步明确顺式作用元件的具体位置。卢学春等[14]用PCR方法扩增了LRP16启动子全长，构建了一系列5＇缺失－萤光素酶融合表达载体转化

HeLa细胞，萤光素酶活性分析结果显示该启动子是一个典型的Ⅱ型启动子，其活性在－200～－600bp区

域最强。

2．2瞬间表达分析

由于构建载体和转化基因检测启动子的特性周

Genomax等在线启动子分析软件，在人类转录因子数据库中搜索可能存在的顺式结构，利用SAGE和GEO数据库对影响ID4基因表达的相关因素进行分析，结果表明ID4基因具有Ⅱ型启动子，在5＇－非翻译区的－45bp处有1个典型的TATA框。在长度为1300bp的ID4启动子区存在多个顺式结构，其中包括Sp1、c－Myb、abaA、C／EBPalpha、GR、ERE和Zeste，可能具有正向调控作用，认为ID4基因的表

达可能受糖皮质激素、雌激素、甲状腺素和卵泡刺激素等多种活性物质的调控。在7篇有关ID4基因表达调控的文献中，一共提及了地塞米松、cAMP、

期长，比较费时，近年又发展了启动子瞬间表达分析，最常用的是启动枪转化法。Biegalke与Hermis-

ton等[15－16]曾先后用瞬间表达分析法证明在人巨细胞病毒US3启动子上游有一段顺式抑制序列，介导

负性转录调节。我国学者齐春辉等[17]利用基因枪转化法将连接有GUS基因的35S启动子转入日本结缕草中，并获得了转基因植株。

2．3点突变分析

点突变分析是研究启动子的特定核苷酸序列常

用的方法，一般是利用转座子插入突变或限制性酶切除去某一特定启动子元件，并把该缺失启动子转化生物来确定特定序列的功能。此方法是最常用的研究启动子的方法。TATA框、CAAT框的结构及功

FSH和甲基化等几种因素和条件对ID4基因表达

的影响，证实了数据库分析结果的准确性。以此为

黄玉等：真核生物启动子的研究及应用

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中stathmin蛋白的表达，流式细胞分析显示其可将

能即是应用点突变的方法确定的。Isomura[18]等应用点突变方法使HCMV启动子的不同区域突变，从而确定了－10bp和－9bp区域对于CMV的RNA转录、连接起重要作用。

HeLa细胞阻滞在G2／M期。启动子RNAi载体避免了反向互补序列的长片段DNA，节约费用，而且小片段DNA与载体的高效连接更有利于载体的快速

构建。

2．4其他实验方法

其他方法主要包括凝胶阻滞实验和DnaseⅠ足

3．2在进化研究中的应用

启动子结构序列的保守性反映了物种间的同源

迹实验。前者用于研究启动子与蛋白的结合，从中寻找确定启动子中的顺式作用元件。DNA足迹实验不仅能找到与特异DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。Futterer等[19]分离了RTBV基因启动子片段，DNA足迹实验分析显示有2种水稻核蛋白能够与RTBV基因启动子＋

关系。以前的研究资料表明，酵母和哺乳动物的转录因子结合序列在调控基因表达上并无明显区别。这意味着，在进化中，启动子在保证稳定的调控功能的前提下能够快速地沿不同的方向进化，从而产生了启动子在进化上的关系，可以确定物种间亲缘关系远近的准确定位。另外，进化过程中产生的新元件，只要能与启动子相互作用而不干扰基因原有的表达调控体系，并能使物种保持进化上的优势，即可在物种基因组中固定下来，并且通过与原有的元件协同作用，新元件还可优化基因的表达，赋予物种选择优势。

50～＋90bp区特异结合；采用凝胶阻滞实验，在＋1～＋90bp区又发现了至少2种新的DNA－蛋白质复合

物，其中一种蛋白质来源于水稻的根。提示＋1～＋90

bp区段与蛋白质的特异结合是RTBV基因启动子

组织特异表达所必须的。

3

3．1

启动子研究的应用及进展

RNA干扰载体的启动子

3．3促进生物信息学的发展

近年来，随着人类基因组计划和各种模式生物

测序工作的相继完成，出现了另一种大规模简便快速查找基因序列的方法———序列比较法[26]，其依据的原理是，人类基因组中大多数已知调控元件（例如启动子）在脊椎动物中具有高度的保守性。通过物种间DNA序列比较，已在不同物种基因组的非编码区发现大量的高度保守序列，这些序列可能具有基因表达调控相关的潜在功能。因此，可将物种间序列保守性比较作为寻找未知序列的第一步，之后，再结合转基因动物模型等技术，对候选序列进行功能分析与鉴定。Loots等第一次将序列比较成功地用于未知基因序列的查找，通过物种间序列比较，在细胞因子基因IL－4和IL－3之间发现一段保守序列，后经转基因小鼠基因缺失研究证实，该序列为调控IL－4、

RNA干扰（RNAi）技术，即以内源或外源双链

RNA（dsRNA）特异性结合互补链抑制细胞内特定基因的表达，或通过dsRNA引发转录后基因沉默，诱

使出现特定基因表型缺失。dsRNA为21～25bp的小干扰RNA（siRNA），传统方法为利用病毒或质粒载体内源性表达siRNA，筛选稳定表达株，从而在细胞中持续抑制靶基因的表达[20]。但表达siRNA需要合成较长的序列，且序列中的发卡结构给后续退火、连接带来一定难度。2003年，Tran等[21]利用2个相对排列的U6启动子构建RNAi载体，可在体内直接转录生成siRNA，并具有较高的抑制活性。随后

Kaykas及Jian等在此基础上构建了H1－U6双启动

子，大大提高了载体的稳定性，并应用其构建随机

IL－3以及与之相距更远的IL－5基因表达的增强

子。目前，该方法已相对成熟，可广泛地应用于筛查组织特异性表达基因两侧大范围区域的调控元件，更进一步促进了生物信息学的发展。

RNAi文库，进行高通量筛选，拓展了此类载体在基

因规模化功能研究中的应用[22－23]。基于以上思路，张莹莹等[24]以pEGFT－C1为原始载体，插入相向排列的HI－U6启动子表达框，构建了双启动子RNAi载体，并利用此载体从HUBE2W的5个候选RNAi靶点中筛选出2个有效靶点。结果显示，无论在mRNA水平还是蛋白质水平，这2个有效靶点均能降低

3．4在临床治疗中的应用

目前研究较多的是肿瘤靶向治疗中启动子的应

用。利用组织特异性启动子来介导目的基因，从而限制目的基因只在靶细胞中表达，是肿瘤靶向性基因治疗的一条有效途径，它减轻了对正常组织的损伤。现有不少的组织或细胞的特异性启动子被用于基因的靶向治疗,如癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、

HUBE2W的表达。王燕等

[25]

以pSilencer4．1－CMV

neo为原始载体，插入Survivin启动子表达框，构建了启动子RNAi载体，并将其转染HeLa细胞，RT－PCR结果显示所构建的载体可有效封闭HeLa细胞

EB病毒启动子等。激酶插入域受体（KDR）启动子引

278

入自杀基因治疗体系，既靶向肿瘤血管内皮细胞，又靶向肿瘤细胞，从而高效放大自杀基因靶向治疗的疗效。众多实验研究表明，KDR基因启动子可调控自杀基因靶向性作用于肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞[27－29]。Pierce等[30]通过实验证实，在p53缺失的情况下可以诱发小鼠皮肤肿瘤的发生，证明E2F1与肿瘤的发生有关。而Obama利用寡核苷酸竞争

[31]

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E2F1启动子针对肿瘤细胞的选择性。近年，人端粒

酶逆转录酶（hTERT）基因启动子因其无争辩的高肿

瘤特异性、较强的活性及广泛存在性，而成为肿瘤靶向性基因治疗中首选的启动子[32]。Gu等[33]通过体外实验，以CMV启动子作为对照，采用萤光素酶实验检测hTERT启动子的活性，发现在肿瘤细胞中，

highlycon-

servedfamilyofsequence－specificDNAbindingproteins[J]．

hTERT启动子的转录活性和CMV启动子相比，差别为5～20倍，而在正常细胞中其差别约为500倍。Koga等[34]在端粒酶阳性的前列腺癌、恶性胶质瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌等10种肿瘤细胞中，以hTERT基因启动子调控Caspase－8的表达，诱导细

胞发生凋亡，其效果与SV40启动子所驱动基因的对照载体相差无几；不过，后者在正常细胞中，其凋亡指数与肿瘤细胞相当，而前者在正常细胞中未检测到基因的表达和凋亡。这表明hTERT基因启动子不但有很高的肿瘤特异性，而且有较强的转录活性。

综上，启动子介导目的基因实现肿瘤的靶向性基因治疗是一种很有前景的策略。但是，由于缺乏大规模的临床实验，其疗效及副作用仍须进一步研究。例如少数人肿瘤细胞没有端粒酶活性，而正常人生殖细胞和造血干细胞等存在端粒酶活性，在应用hTERT启动子治疗肿瘤过程中有可能失效或对造血干细胞造成损伤，这成为hTERT启动子运用于肿瘤靶向性基因治疗的困扰[32]。

总之，启动子通过应答一种或多种基因转录因子而调控基因的表达。对启动子结构的详尽阐明，可以帮助我们更深入地理解启动子序列结构、转录因子结合位点和基因表达系统网络中启动子调控作用之间的对应关系，并可以尝试人工合成启动子序列，研究其功能，从而实现启动子对单基因和多基因网络表达的特定目的的人工调控，更好地服务于研究和开发。

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