(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110568176 A(43)申请公布日 2019.12.13
(21)申请号 201910865034.X(22)申请日 2019.09.09
(71)申请人 潍坊市康华生物技术有限公司
地址 261023 山东省潍坊市经济开发区月
河路699号(72)发明人 杨致亭 田永帅 金宇婷 隋振国
杨锋斌 葛玮 (74)专利代理机构 潍坊正信致远知识产权代理
有限公司 37255
代理人 李聚坤(51)Int.Cl.
G01N 33/53(2006.01)G01N 33/535(2006.01)G01N 33/543(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页
(54)发明名称
一种抗体和磁珠定向偶联的方法(57)摘要
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种抗体和磁珠定向偶联的方法，包括(1)磁珠预处理；(2)S-NHS处理；(3)EDC处理；(4)加入抗体。采用本发明的方法抗体和磁珠可实现定向偶联，大大提高了有效抗体的得率，进一步提高了检测实际的灵敏度和准确度。
CN 110568176 ACN 110568176 A
权 利 要 求 书
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1.一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)磁珠预处理：取MES缓冲液，加入磁珠母液，振荡均匀，磁分离后弃上清，再加入MES缓冲液，振荡均匀后备用；
(2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的S-NHS溶液，振荡混匀，调节反应体系pH值为酸性；
(3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的EDC溶液，振荡混匀，调节反应体系pH值为酸性，置于恒温恒湿箱中，旋转混匀反应一段时间，磁分离后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀；
(4)加入抗体：向步骤(3)中加入抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱中，旋转混匀反应一段时间，磁分离后弃上清，加入TRIS缓冲液，振荡均匀，弃上清，在磁珠标记反应物中加入磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱中，静置反应一段时间，磁分离后弃上清，再加入磁珠标记缓冲液A，振荡均匀，弃上清，加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(1)中所述磁珠母液为羧基磁珠母液，磁珠母液的加入量为10-15mg，MES缓冲液第一次的加入量为0.5-1ml，MES缓冲液第二次的加入量为1-2ml。
3.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(2)中所述S-NHS溶液的浓度为10mg/mL-20mg/mL，所述S-NHS溶液的加入量为50μL。
4.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(2)中调节反应体系pH值为5.0-6.5。
5.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(3)中所述EDC溶液的浓度为8-12mg/mL，EDC溶液的加入量为50μL。
6.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(3)中调节反应体系pH值为5.0-6.5。
7.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(3)中恒温恒湿箱中的温度为26±1℃，旋转反应的时间为20-40min。
8.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(4)中抗体的加入量为200μg-500μg，旋转混合反应的时间为120-150min，TRIS缓冲液的加入量为1mL-2.5mL，磁珠标记缓冲液A的加入量为1mL-2.5mL，静置反应的时间为60-90min。
9.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(4)中磁珠标记缓冲液A的配方为6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、5g的BSA、0.5g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
10.根据权利要求1所述的一种抗体和磁珠定向偶联的方法，其特征在于：步骤(4)中磁珠保存液的配方包括以下组分：6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、10g的BSA、1g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
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说 明 书
一种抗体和磁珠定向偶联的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种抗体和磁珠定向偶联的方法。背景技术
[0002]化学发光免疫诊断技术以化学发光剂、催化发光酶等物质标记抗原或抗体，当被标记的抗原或抗体与相应抗体、抗原相结合后，发光底物受发光剂、催化酶等物质作用，发生氧化还原反应。反应中释放出的可见光最后由配套设备进行采集与处理，获取测定物浓度，从而达到测定目的。相较于传统免疫技术，化学发光具有自动化程度高、特异性好、精确度高、检测范围广等优势。
[0003]磁微粒化学发光试剂开发与制备过程中，抗体与磁珠微球的偶联方法众多，但是都存在一个问题，即抗体在连接到微球上的方向存在很大的随机性，无法控制。抗体与抗原结合的区域位于抗体的F(ab)片段上，若在偶联过程中与微球相连的是抗体的F(ab)片段，那么向外伸展的就是与抗原没有结合活性的Fc片段，这就导致这一偶联抗体为无效抗体，无效连接抗体的存在使得抗体的利用率不高，并大大降低试剂最终的灵敏度。
[0004]目前已有的定向偶联方法为全长抗体还原打开位于Fc段的重链间的两对二硫键，获得一条重链和一条轻链通过二硫键连接的抗体片段，并利用形成的自由巯基进行定向偶联。但通过使用不同种类的还原剂、不同的还原时间以及不同的还原条件进行抗体还原方案的筛选，最终目的产物得率均不超过25％，标记效率极低。另外该方法易造成类风湿因子(RF)的干扰，降低试剂的灵敏度和特异性。发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种抗体和磁珠定向偶联的方法，该方法操作简单，而且可实现抗体和包被物的定向偶联，大大提高了检测试剂的灵敏度和特异性。
[0006]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：[0007]一种抗体和磁珠定向偶联的方法，所述方法包括以下步骤：[0008](1)磁珠预处理：取MES缓冲液，加入磁珠母液，振荡均匀，磁分离后弃上清，再加入MES缓冲液，振荡均匀后备用；[0009](2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的S-NHS溶液，振荡混匀，调节反应体系pH值为酸性；[0010](3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的EDC溶液，振荡混匀，调节反应体系pH值为酸性，置于恒温恒湿箱中，旋转混匀反应一段时间，磁分离后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀；[0011](4)加入抗体：向步骤(3)中加入抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱中，旋转混匀反应一段时间，磁分离后弃上清，加入TRIS缓冲液，振荡均匀，弃上清，在磁珠标记反应物中加入磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱中，静置反应一
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段时间，磁分离后弃上清，再加入磁珠标记缓冲液A，振荡均匀，弃上清，加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。
[0012]作为一种改进的技术方案，步骤(1)中所述磁珠母液为羧基磁珠母液，磁珠母液的加入量为10-15mg，MES缓冲液第一次的加入量为0.5-1ml，MES缓冲液第二次的加入量为1-2ml。
[0013]作为一种改进的技术方案，步骤(2)中所述S-NHS溶液的浓度为10mg/mL-20mg/mL，所述S-NHS溶液的加入量为50μL。[0014]作为一种改进的技术方案，步骤(2)中调节反应体系pH值为5.0-6.5。[0015]作为一种改进的技术方案，步骤(3)中所述EDC溶液的浓度为8-12mg/mL，EDC溶液的加入量为50μL。
[0016]作为一种改进的技术方案，步骤(3)中调节反应体系pH值为5.0-6.5。[0017]作为一种改进的技术方案，步骤(3)中恒温恒湿箱中的温度为26±1℃，旋转反应的时间为20-40min。
[0018]作为一种改进的技术方案，步骤(4)中抗体的加入量为200μg-500μg，旋转混合反应的时间为120-150min，TRIS缓冲液的加入量为1mL-2.5mL，磁珠标记缓冲液A的加入量为1mL-2.5mL，静置反应的时间为60-90min。[0019]作为一种改进的技术方案，步骤(4)中磁珠标记缓冲液A的配方为6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、5g的BSA、0.5g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
[0020]作为一种改进的技术方案，步骤(4)中磁珠保存液的配方包括以下组分：6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、10g的BSA、1g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。[0021]采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：[0022]本发明采用EDC/NHS两步偶联方式，通过调整pH,将EDC/NHS两步偶联时的pH环境调节至5.0-6.5，在此pH环境中，抗体Fab端与Fc端都带正电，因此都有可能通过静电吸附附着在PS微球表面。并且此时，Fab端的氨基处于质子化状态(NH3+)，反应优先级被降低，Fc端虽然带正电荷，但是其带电量要明显低于Fab端，其水化层更薄，疏水性更强，更易于参与反应。两步法反应中，第二步抗体偶联反应pH降低，NHS酯水解速度更慢，氨基-羧基的反应速度也较慢，为抗体在羧基表面调整方向提供了时间，采用本方法通过调整pH使得抗体定向偶联在PS微球表面，提高了有效抗体的得率，大大提高了试剂灵敏度。具体实施方式
[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0024]实施例1
[0025]一种采用本发明定向偶联方法制备的用于检测VEGF的试剂盒，包括以下组分：包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液(磁珠微球的工作浓度为0.1mg/ml-0.35mg/ml，磁珠微球表面包被的VEGF抗体浓度为10-50ug/mg)、VEGF参考品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品
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稀释液配制而成，VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；)、VEGF质控品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL)、VEGF酶结合物(VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释；)、浓缩洗涤液(为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。)和发光底物液(发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g、对位碘酚0.007-0.008g、氢氧化钠4-40g，工作液pH为10-13；发光底物液B的成分为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。)、参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15g EDTA、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。)、酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。[0026]其中抗体与磁珠定向偶联方法(即包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的制备)包括以下步骤：[0027](1)磁珠预处理：取0.5-1ml MES缓冲液，加入10mg磁珠母液(羧基磁珠母液)，振荡均匀1min，磁分离1min后弃上清，重复3次，再加入1ml的MES缓冲液，振荡均匀1min后备用；[0028](2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为10mg/mL的S-NHS溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为5.0；[0029](3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为5.0，置于恒温恒湿箱中(26±1℃)，旋转混匀30min，磁分离1min后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀1-3min；[0030](4)加入抗体：向步骤(3)中加入350μg的抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，旋转混匀反应120min，磁分离1min后弃上清，加入1ml的TRIS缓冲液，振荡均匀1min，重复3次后弃上清，在磁珠标记反应物中加入1ml磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，静置反应60min，磁分离1min后弃上清，再加入1ml磁珠标记缓冲液A，振荡均匀1min弃上清，重复3次，最后加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。
[0031]其中步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中MES缓冲液的配方包括9.76g的MES、9gNaCl、0.5gPC300，采用双蒸水将上述组分定容至1L，并用3MNaOH调pH至5.8。[0032]步骤(4)中磁珠标记缓冲液A的配方为6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、5g的BSA、0.5g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。[0033]步骤(4)中磁珠保存液的配方包括以下组分：6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、10g的BSA、1g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
[0034]实施例2
[0035]一种采用本发明定向偶联方法制备的用于检测VEGF的试剂盒，包括以下组分：包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液(磁珠微球的工作浓度为0.1mg/ml-0.35mg/ml，磁珠微球表面包被的VEGF抗体浓度为10-50ug/mg)、VEGF参考品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品
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稀释液配制而成，VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；)、VEGF质控品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL)、VEGF酶结合物(VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释；)、浓缩洗涤液(为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。)和发光底物液(发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g、对位碘酚0.007-0.008g、氢氧化钠4-40g，工作液pH为10-13；发光底物液B的成分为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。)、参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15g EDTA、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。)、酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。[0036]其中抗体与磁珠定向偶联方法(即包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的制备)包括以下步骤：[0037](1)磁珠预处理：取1ml MES缓冲液，加入10mg磁珠母液(羧基磁珠母液)，振荡均匀1min，磁分离1min后弃上清，重复3次，再加入2ml的MES缓冲液，振荡均匀1min后备用；[0038](2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为15mg/mL的S-NHS溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为6.0；[0039](3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为6.0，置于恒温恒湿箱中(26±1℃)，旋转混匀30min，磁分离3min后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀3min；[0040](4)加入抗体：向步骤(3)中加入500μg的抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，旋转混匀反应150min，磁分离1min后弃上清，加入2.5ml的TRIS缓冲液，振荡均匀1min，重复3次后弃上清，在磁珠标记反应物中加入2.5ml磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，静置反应60min，磁分离1min后弃上清，再加入1ml磁珠标记缓冲液A，振荡均匀2min弃上清，重复3次，最后加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。
[0041]其中步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中MES缓冲液的配方包括9.76g的MES、9gNaCl、0.5gPC300，采用双蒸水将上述组分定容至1L，并用3MNaOH调pH至6.0。[0042]步骤(4)中磁珠标记缓冲液A的配方为6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、5g的BSA、0.5g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。[0043]步骤(4)中磁珠保存液的配方包括以下组分：6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、10g的BSA、1g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
[0044]实施例3
[0045]一种采用本发明定向偶联方法制备的用于检测VEGF的试剂盒，包括以下组分：包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液(磁珠微球的工作浓度为0.1mg/ml-0.35mg/ml，磁珠微球表面包被的VEGF抗体浓度为10-50ug/mg)、VEGF参考品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品
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稀释液配制而成，VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；)、VEGF质控品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL)、VEGF酶结合物(VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释；)、浓缩洗涤液(为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。)和发光底物液(发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g、对位碘酚0.007-0.008g和氢氧化钠4-40g，工作液pH为10-13；发光底物液B的成分为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。)、参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15g EDTA、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。)、酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。[0046]其中抗体与磁珠定向偶联方法(即包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的制备)包括以下步骤：[0047](1)磁珠预处理：取1ml MES缓冲液，加入15mg磁珠母液(羧基磁珠母液)，振荡均匀1min，磁分离1min后弃上清，重复3次，再加入2ml的MES缓冲液，振荡均匀1min后备用；[0048](2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为20mg/mL的S-NHS溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为6.5；[0049](3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为5.0，置于恒温恒湿箱中(26±1℃)，旋转混匀30min，磁分离1min后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀1-3min；[0050](4)加入抗体：向步骤(3)中加入200μg-500μg的抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，旋转混匀反应120min，磁分离1min后弃上清，加入1ml的TRIS缓冲液，振荡均匀1min，重复3次后弃上清，在磁珠标记反应物中加入2.5ml磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，静置反应60min，磁分离1min后弃上清，再加入2ml磁珠标记缓冲液A，振荡均匀1min弃上清，重复3次，最后加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。[0051]其中步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中MES缓冲液的配方包括9.76g的MES、9gNaCl、0.5gPC300，采用双蒸水将上述组分定容至1L，并用3MNaOH调pH至6.5。[0052]步骤(4)中磁珠标记缓冲液A的配方为6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、5g的BSA、0.5g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。[0053]步骤(4)中磁珠保存液的配方包括以下组分：6.05g的Tris、9g的NaCl、0.5g的PC300、10g的BSA、1g的吐温-20,采用双蒸水将上述组分定溶至1L，并用1M的Hcl调pH至7.3-7.5。
[0054]其中实施例1、实施例2和实施例3中的TRIS缓冲液配方见下表1：[0055]表1
[0056]
Tris厂家Sigma
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用量6.05g
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说 明 书
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Tris-HCISigma6.59gNaCl国药化学试剂9.00gPC300Sigma0.5g1MHCI国药化学试剂调制pH7.4±0.1ddH2O/定容至1L
[0057]为了更好的证明采用本发明定向偶联方法制备的用于检测VEGF的试剂盒和现有的非偶联的试剂盒相比具有更好的检测效果，以下给出了两个对比例。[0058]对比例1
[0059]市售建平金星产品。[0060]对比例2
[0061]与实施例3的试剂盒组分相同，唯一的不同在于抗体与磁珠偶联方法：
[0062]包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液(磁珠微球的工作浓度为0.1mg/ml-0.35mg/ml，磁珠微球表面包被的VEGF抗体浓度为10-50ug/mg)、VEGF参考品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；)、VEGF质控品(VEGF参考品由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL)、VEGF酶结合物(VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶标记的VEGF单克隆抗体，VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释；)、浓缩洗涤液(为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。)和发光底物液(发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g、对位碘酚0.007-0.008g、氢氧化钠4-40g，工作液pH为10-13；发光底物液B的成分为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。)、参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15g EDTA、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。)、酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
[0063]其中抗体与磁珠定向偶联方法(即包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液)包括以下步骤：[0064](1)磁珠预处理：取1ml PBS缓冲液，加入15mg磁珠母液，振荡均匀1min，磁分离1min后弃上清，重复3次，再加入2ml的MES缓冲液，振荡均匀1min后备用；[0065](2)S-NHS处理：向步骤(1)中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为20mg/mL的S-NHS溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为7.8；[0066](3)EDC处理：向步骤(2)的反应体系中加入用MES缓冲液配制的50μL且浓度为10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀1min，调节反应体系pH值为7.8，置于恒温恒湿箱中(26±1℃)，旋转混匀反应30min，磁分离1min后弃上清，加入MES缓冲液，振荡均匀3min；[0067](4)加入抗体：向步骤(3)中加入500μg的抗体，将磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，旋转混匀反应120min，磁分离1min后弃上清，加入1ml的TRIS缓冲液，振荡均匀1min，重复3次后弃上清，在磁珠标记反应物中加入2.5ml磁珠标记缓冲液A，混合均匀，将
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磁珠标记反应物置于恒温恒湿箱(26±1℃)中，静置反应90min，磁分离1min后弃上清，再加入2ml磁珠标记缓冲液A，振荡均匀1min弃上清，重复3次，最后加入磁珠保存液，置于4℃环境中保存备用。
[0068]其中PBS缓冲液配方见下表2。[0069]表2
厂家用量KH2PO4国药0.24gNa2HPO4国药1.44NaCl国药化学试剂9.00gPC300Sigma0.5g3MNaOH国药化学试剂调制pH7.8ddH2O/定容至1L
[0071]将本发明中采用定向偶联技术制备的试剂盒(实施例1-3)和对比例1、对比例2中的试剂盒对对50例肿瘤患者样本进行VEGF检测，具体检测结果见表3。[0072]表3
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通过表3数据可以发现，使用定向偶联技术制备的试剂盒比市售建平金星产品以
及对比例2中的试剂盒检测时检出率高20％,而非使用定向偶联技术的实施例与市售建平金星试剂检出率一致。
[0076]本发明需要说明的本发明实施例1-3以及对比例2中的试剂盒，其中除了试剂盒的组分——包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液(即抗体与磁珠定向偶联方法)不同外，其余的试剂盒组分相同。
[0077]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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