甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的mmachc基因突变分析

2020-01-17 来源：小侦探旅游网

甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的

MMACHC基因突变分析

摘要

研究背景

甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）又被称为甲基丙二酸尿症（methylmalonicaciduria），是氨基酸与有机酸代谢异常疾病中最常见的一种，是支链氨基酸代谢途径异常，属于常染色体隐性遗传性有机酸血症性疾病。MMA主要由于甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷及其辅酶-5’脱氧腺苷钴胺素（维生素B12）（Ado-Cbl）合成代谢障碍，导致甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等异常蓄积，造成多个脏器功能受到损伤，尤其是神经系统的损伤。Ado-Cbl代谢异常包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG、cblH 8个亚型，其中cblC最常见。

cblC病患者可以显示出广泛的临床表现，跨越了产前阶段到成年后期。而同型半胱氨酸浓度增加和甲基代谢障碍可能有助于疾病相关的并发症，黄斑和视网膜变性的特点，并且每个不同个体发病时的临床表现各不相同：嗜睡、反复呕吐、喂养困难、肌张力低下、低体温、呼吸窘迫，惊厥反复发作或惊厥持续状态、严重的酮症酸中毒，高氨血症，高乳酸血症，肝功能损失、肾脏损失，眼科异常、皮肤异常、巨幼红细胞性贫血、中性粒细胞减少和血小板减少，脑水肿、脑出血，严重时可导致死亡。

cblC病的致病基因为MMACHC基因，该基因位于1号染色p34编码区域，编码cblC蛋白，功能是在细胞胞浆内催化还原脱氰反应和合成腺苷钴胺素反应。当其发生基因突变时，编码cblC的蛋白不能够发挥其正常的生理功能，从而导致疾病发生。

本文中3例甲基丙二酸血症根据其典型的临床症状、生化特征进行总结，对疾病能够早期发现，早期明确诊断，并进行有效的治疗，改善患者预后提供

帮助。同时，积极对其先证者及父母进行基因检测，了解先证者疾病发生的遗传方式（自身基因突变或遗传自父母），并对其提供相应的遗传咨询信息，在新生儿疾病筛查的早期检测，并仔细评估cblC病治疗方法，为该类疾病患者提供新的改善预后的机会，产前进行诊断可减少该类遗传性疾病的发生，补充相关基因的突变信息，完善MMACHC基因突变类型。

目的

1．总结来自3个家系，共3例MMA患者的临床症状、生化特征、治疗效果；

2．研究MMA患者发病的分子遗传学方式，明确诊断，了解MMACHC基因突变所发生的情况，推断其相关性，为患者提供遗传咨询及产前诊断。

方法

1．收集来自3个家系，共3例MMA患者的住院情况包括临床症状、生化特征、治疗效果；

2．样本采集：在研究对象签署送检同意书的情况下，采集研究对象及父母、50例正常健康体检患者晨起空腹的外周静脉血液各5ml；

3．基因组 DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取提取血液样中的基因组DNA；

4．引物设计：根据人类基因组数据库中设计MMACHC基因序列的引物，采用聚合酶链反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）法扩增目的基因，

5．产物回收：采用PCR产物回收试剂盒进行产物回收；

6．上机测序：对PCR产物直接进行DNA测序，在人类基因组数据库 GenBank中原始的基因序列进行对比并分析，获得基因突变位点。

结果

1．PCR扩增产物与预计扩增片段长度大致一致，无非特异性扩增片段，可进型步进行纯化和测序；

2．家系1中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第3外显子c.394C>T的杂合无义突变，第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变。父亲第3外显子c.394C>T杂合无义突变；母亲第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变；

3．家系2中先证者MMACHC 基因发现：第4外显子 c.609G>A的纯合无义变异。受检者其父母均为第4外显子 c.609G>A杂合无义突变；

4．家系3中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第1外显子c.80A>G的杂合错义突变，第4外显子c.609G>A的杂合无义突变。父亲第1外显子c.80A>G杂合错义突变；母亲第4外显子c.609G>A杂合无义突变。

结论

1．收集的3个家系中先证者均符合MMACHC的临床及生化特征，诊断明确，早期临床干预治疗，预后均有明显改善；

2．家系1中先证者的分子遗传学基础是c.394C>T和c.656_658del复合杂合突变的组合，经查询基因库，c.656_658del变异的致病性尚未见文献报道，高度怀疑是1个新的遗传突变。父母再次妊娠时可以行遗传咨询并对胎儿进行基因测序来根据结果做出产前诊断；

3．家系2和家系3中先证者的分子遗传学基础c.609G>A纯合突变、c.80A>G 及c.609G>A复合杂合突变的基因突变位点均已报道过，存在致病性，与既往报道一致。

关键词：甲基丙二酸血症，同型半胱氨酸血症，基因突变

III

Mutational analysis of MMACHC gene in cohorts of patients with CblC type methylmalonicacidemia

Abstract

Research background

Methylmalonic acidemia (methylmalonicacidemia, MMA) is also known as methylmalonic aciduria (methylmalonicaciduria), is one of the most common diseases of amino acid and organic acid metabolism abnormal, is a branched chain amino acid metabolism pathway, is an autosomal recessive inherited disease of organic acidemias. MMA is mainly due to two methyl coenzyme A (methylmalonyl coenzyme A, MMCoA) mutase (methylmalonyl-CoA mutase, MCM) defect and coenzyme -5 'deoxyadenosyl cobalamin (vitamin B12) (Ado-Cbl) synthesis lead to metabolic disorders, methylmalonic acid, propionic acid and methylcitrate abnormal accumulation, causing multiple organ function by injury, especially the nervous system damage. Ado-Cbl metabolic abnormalities include cblA, cblB, cblC, cblD, cblE, cblF, cblG, and cblH 8 subtypes, among which cblC is the most common.

Patients with cblC disease can exhibit a wide range of clinical manifestations, spanning the prenatal stage to the late adulthood. Increased homocysteine concentration and methyl metabolism may contribute to disease related complications, characteristics of macular and retinal degeneration, and different clinical manifestations at the onset of each individual is different: lethargy, repeated vomiting, feeding difficulties, hypotonia, low body temperature, respiratory distress, recurrent seizures or status epilepticus severe ketoacidosis, lactic acidosis, hyperammonemia, liver function, kidney damage loss, eye abnormalities, skin abnormalities, megaloblastic anemia, neutropenia and thrombocytopenia, cerebral edema, cerebral hemorrhage, severe cases can lead to death.

The pathogenic gene of cblC disease MMACHC gene, the gene is located on chromosome 1 p34 encoding region, encoding cblC protein, function of catalytic reduction reaction and cyanide removal of deoxyadenosylcobalamin synthesis reaction in the cytoplasm. When a gene mutation occurs, the protein that encodes cblC fails to function properly and leads to disease.

In this paper, 3 cases of methylmalonic acidemia were summarized according to its typical clinical symptoms, biochemical characteristics, the disease can be found early, early diagnosis and effective treatment, help to improve the prognosis of patients. At the same time, the first positive permit and parental genetic testing, genetic methods of understanding disease (genetic mutation or genetic parents), and provide information for genetic counseling, reduce the genetic diseases, gene mutation of related information, improve the MMACHC gene mutation type.

Objective

1．The clinical symptoms, biochemical features and treatment effects of 3 patients with MMA from 3 families were summarized；

2．to study the pathogenesis of MMA in patients with molecular genetics, a clear diagnosis, understanding of the occurrence of MMACHC mutations, to infer the relevance of genetic counseling and prenatal diagnosis.

Method

1．A total of 3 patients with MMA from 3 families were included in the study, including clinical symptoms, biochemical characteristics, and treatment outcomes;

2．sample collection: the research object for consent signed in the case of collecting the research object and the parents, 50 healthy patients with fasting blood 5ml;

3．Genomic DNA extraction: genomic DNA extraction kit was used to extract genomic DNA from blood samples;

4．Primer design: according to the human genome database design MMACHC gene sequence primers, polymerase chain reaction (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplification of the target gene;

5．Product recovery: PCR product recycling kit for product recovery;

6．sequencing: the PCR products were directly sequenced by DNA, and the original gene sequences in the human genome database GenBank were compared and analyzed.

Result

1．the product of PCR amplification was approximately the same as the length of the amplified fragment, and it was no longer the specific amplified fragment;

2．Among the 1 probands of pedigrees, the MMACHC gene found a heterozygous heterozygous nucleotide mutation: third heterozygous heterozygous mutations in exon c.394C>T, and a heterozygous mutation in deletion of the nucleotide sequence of exon fourth of c.656_658del. Heterozygous mutations in the exon third of the father c.394C>T heterozygous nonsense mutation and deletion of the c.656_658del nucleotide sequence of the mother's fourth exon;

3．In pedigree 2, proband MMACHC gene found: fourth exon c.609G>A homozygous null mutation. The parents of the subjects were fourth exon c.609G>A heterozygous null mutations;

4．Among the 3 probands of pedigrees, the MMACHC gene found a heterozygous heterozygous nucleotide variant: first heterozygous missense mutations in exon c.80A>G, and heterozygous nonsense mutations in exon fourth of c.609G>A. Heterozygous missense mutation in father first exon c.80A>G; heterozygous mutation in mother fourth exon c.609G>A.

Conclusion

1．Among the 3 families, the proband was consistent with the clinical and biochemical characteristics of MMACHC. The diagnosis was clear and the prognosis was improved by early clinical intervention;

2．The molecular genetic basis for 1 families in the proband is a combination of c.394C>T and c.656_658del compound heterozygous mutations, the query gene pool, pathogenic c.656_658del mutation has not been reported, 1 new genetic mutations suspected. Parents can have genetic counseling when they are pregnant again, and gene sequencing of the fetus is used to make pre production diagnosis based on the results;

3．The molecular genetic basis of pedigree 2 and pedigree 3 probands, c.609G>A homozygous mutations, and c.80A>G and c.609G>A heterozygous heterozygous mutation loci have been reported, and their pathogenicity is consistent with previous reports.

Key words：Acidemia, Homocysteine, Gene Mutation

VII

正文部分

中英文缩略词表 .................................................................................................... I 甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的MMACHC基因突变分析 ............ 1 1 引言 .................................................................................................................. 1 2 对象和方法 ...................................................................................................... 4 3 结果 ................................................................................................................ 10 4 讨论 ................................................................................................................ 11 5 结论 ................................................................................................................ 14 参考文献 .............................................................................................................. 15 附图 .................................................................................................................. 18

综述部分

甲基丙二酸血症研究进展 .................................................................................. 22 参考文献 .............................................................................................................. 40

附录部分

个人简历、在学期间发表的论文 ...................................................................... 46 致谢 .................................................................................................................. 47

中英文缩略词表

英文缩写

英文全称

中文全称甲基丙二酸血症同型半胱氨酸血症甲基丙二酰辅酶A 甲基丙二酰辅酶A变位酶钴胺素

线粒体钴胺素还原酶线粒体钴胺素腺苷转移酶支链氨基酸支链酮酸 5’-三磷酸腺苷黄素单核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸蛋氨酸合成酶还原酶 S-腺苷甲硫氨酸

MMA methylmalonicacidemia HCY Homocysteinemia MMCoA methylmalonyl coenzyme A MCM methylmalonyl-CoA mutase CBL cobalamin CblA CblB BCAA BCKA

mitochondrial Cbl reductase

mitochodrial cobalamin adenosyltransferase branch chain amino acid branch chain ketotic acid

ATP adenosine triphosphate FMN FAD MSR SAM

flavin mononucleotide flavin adenine dinucleotide methionine synthase reductase S-adenosyl methionine

甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的

MMACHC基因突变分析

研究生：李婉婉导师：罗强教授郑州大学第一附属医院儿内科

河南郑州 450003

1 引言

甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）又称甲基丙二酸尿症（methylmalonicaciduria）是氨基酸与有机酸代谢异常中最常见的病种,常染色体隐性遗传性疾病。氨基酸代谢病是由于酶的缺陷导致正常的代谢途径发生障碍，进而引起生化反应的异常，导致组织或体液内环境中氨基酸异常堆积，引起相应的组织器官功能障碍，并出现相对应的各种临床症状。先天性氨基酸、有机酸代谢异常患者出生时一般无临床表现，经数日的哺乳后因生化反应过程中酶的缺陷导致代谢途径阻滞，即可出现受累的氨基酸异常蓄积，血中此种氨基酸水平明显增高，继续增高超过肾阈值时，出现氨基酸有机酸尿现象。另外，由于正常的氨基酸代谢途径出现障碍，堆积的氨基酸将由其他的代谢途径进行代谢，并导致其旁路的代谢分解产物也异常增多，可由尿液中排出体外。测定血液和尿液中异常增多的氨基酸或尿液中明显增多的代谢产物，可做出明确诊断。生化反应的改变逐渐引起临床症状的表现，并造成组织器官的功能损失，故早期检测氨基酸及代谢产物，可以在组织器官功能受到损失及临床症候表现前给予明确的诊断，并根据诊断进行对症及有效的治疗，可预防其临床症状的出现，避免不可逆转的不良后果。

MMA主要由于甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷及其辅酶-5’脱氧腺苷钴胺素（维生素B12）（Ado-Cbl）合成代谢障碍，导致甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等异常蓄积，造成多个脏器功能受到损伤，尤其是神经系统的损伤。Ado-Cbl代谢异

常包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG、cblH 8个亚型，其中cblC最常见。MMA患病率在不同国家和地区存在着很大的差异[1]，美国为1：48000；意大利为1：61775，德国为 l：169000，日本为1：50 000，我国台湾地区约为1：85000。

维生素B12是一个重要的辅因子,它参与硫、支链氨基酸、奇数链脂肪酸和胆固醇代谢。甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症即cblC病，是细胞内维生素B12代谢异常引起，属常染色体隐性遗传，致病基因为MMACHC基因[2]，该基因位于1号染色p34编码区域，全长总共约10.8kb，编码一个包括了282个氨基酸的cblC蛋白，该cblC蛋白的功能是在细胞胞浆内催化还原脱氰反应和合成腺苷钴胺素反应。当MMACHC基因发生基因突变时，编码cblC的蛋白不能够发挥其正常的生理功能，从而导致疾病发生。该病病理生理学尚不完全清楚，目前同型半胱氨酸浓度增加、甲基代谢受损、氧化应激3个病理因素导致疾病的发生及并发症的产生[3.4]。

目前为止[5]，国内外共有250种不同的基因突变类型，不同的国家和民族MMACHC基因突变的位点有差异性，如c.331c > T突变多于法国、加拿大国家患者多见；c.394c > T突变常见在亚洲的印度/巴基斯坦/中东地区。

欧美国家cblC病患者最常见的突变类型是c. 271 dupA[6]，其中Lemer.EHis等[7]通过对366例cblC病患儿基因分析发现了60个突变位点，c.271dupA突变率高达占42%，该位点纯合突变的患儿均发病较早。Augoustides Savvopoulou等人的报道[8]，2姐妹基因检测分析：确诊甲基丙二酸血症，存在 c.271dupa和c.394C >T复合杂合突变，姐姐在新生儿期即有癫痫发作，发育延迟，逐渐进展为痉挛性截瘫，，死亡于13岁。妹妹9岁以前无临床表现，之后逐渐出现生长迟缓、癫痫发作。在相同的突变位点中出现早发型和迟发型2中不同的情况，存在显著的家庭内表型的异质性。

现症状，可合并多系统损伤[9-10]。cblD型患儿发病较晚，无血液系统异常表现。cblF型患儿新生儿期出现口腔炎、肌张力低下和面部畸形，部分有血细胞形态异常[10-11]。VitB12无效型：是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由于变位酶缺陷引起。出生时可无临床表现，迅速进展为嗜睡、呕吐并有脱水，继而出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下并发脑病[9,12]。Mut0型患儿比其他类型更早出现症状，尤其是神经系统损伤， 80%出生第一周发病，且症状较严重，预后较差[10,,12]。此外，也有报道一些无症状的“良性”甲基丙二酸血症患者，尿中甲基丙二酸排泄轻度增加，其长期预后以及临床表现型还有待进一步研究[13]。

cblC病的治疗原则是减少代谢毒物的生成及加速其清除，目前临床上以药物治疗为主[14]：1.维生素B12：增加突变蛋白酶的亲和力，有利于反应中所需辅酶的合成；2.甜菜碱：甲基供体存在，同型半胱氨酸蛋氨酸通过甜菜碱提供甲基合成半胱氨酸甲基转移酶，绕过甲基钴胺素依赖蛋氨酸合酶途径；3.左旋肉碱：有利于丙酸的排泄和防止肉碱缺乏症。

为了进一步了解MMA疾病的分子遗传学基础，总结其临床特征、生化特点、了解其MMACHC基因的突变位点情况，本文收集了3个家系中3列先证者及其父母的静脉血液，进一步明确基因诊断及遗传方式，完善MMACHC基因突变库。MMACHC基因的变异性可以方便产前和cblC病的早期诊断，通过扩大新生儿筛查，提高cblC病的生存质量。

2 对象和方法

2.1 研究对象

研究对象来自3个家系，共3例（均为散发），患者临床症状、生化、辅助检测及基因检测均支持甲基丙二酸血症的诊断，并收集患者及父母及来自我院100名健康体健对照者的静脉血，采血前均征得所有受试者及监护人同意。

家系1 先证者，女，3月，因“反复呕吐、喂养困难”入院，自出生后反复呕吐、喂养困难，生长发育落后（出生时体重3Kg，3月龄时体重3.9Kg，较标准体重低12%），智力发育落后（3月龄儿不追物、对外界声音及光刺激反应较差、四肢肌张力低下、眼神转动不灵活）。院外查头颅CT示：1.两侧额、顶叶局部脑白质密度减低，2.两侧额、颞、顶叶脑外间隙增宽。一般检查、肝肾功能、粪常规、叶酸、维生素B12检查未见异常。患儿父母体健，非近亲结婚。患儿系G1P1、足月、剖产，无窒息、感染、产伤史，患儿母孕期间体健，未服用特殊药物，无放射性物质接触史，家族中无类似病史。多次血常规：HB：95-105g/L（正常范围110-160g/L），MCV：98-103fl, （正常范围82-95fl）。乳酸5.4mmol /L↑

（正常值＜4 mmol/L），血氨50µmol/L（正常对照20-60μmol/L）尿液中同型半胱氨酸

25.4 umol/L（正常对照＜5umol/L），血浆同型半胱氨酸161.17umol/L（正常对照4-10umol/L）。GC-MS分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。LC-MS/MS分析血液中Gln：Cit，Glu：Cit，C3，C3/C0,C3/C2增高，Met，Met/Phe，C0降低，诊断为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症。

家系2 先证者，男，2月，因“嗜睡、精神差”入院，自出生后出现嗜睡、吃奶无力、四肢肌张力低下，抽搐（表现：强直发作、2-3次/天）。其母第一胎时因同样的表现于6月龄时死亡。头颅MRI示：右侧额颞部硬网膜积液，蛛网膜下腔隙增宽。EEG：右枕、右颞、右额减慢波散在发放。一般检查、肝肾功能、叶酸、维生素B12检查未见异常。尿液中同型半胱氨酸28 umol/L，血浆同型半胱氨酸187umol/L，GC-MS分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。LC-MS/MS分析血液中C3，C3/C0,C3/C2增高，Met，Met/Phe降低。

家系3 先证者，男，2岁，因“反应差、发育迟滞”入院，2岁龄行走不稳，反应差，与人交流差不会说话。一般检查、肝肾功能、叶酸、维生素B12检查未见异常。G1P1、足月、剖产，家族中无类似病史。多次血常规：HB：85 -100g/L（正常范围110-160g/L），MCV：100-105fl, （正常范围82-95fl）尿液中同型半胱氨酸23 umol/L，血浆同型半胱氨酸98umol/L（正常对照4-10umol/L）。GC-MS分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。LC-MS/MS分析血液中，C3，C3/C0,C3/C2增高，Met降低。

2.2 实验材料

2.2.1 主要试剂及试剂盒

DNA提取试剂盒 PCR扩增试剂盒 DNA Marker 琼脂糖

PCR产物回收试剂盒

上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司西班牙Biowest公司

上海生工生物工程股份有限公司

2.2.2 主要仪器

普通冰箱 -20℃冰箱普通台式离心机紫外分光光度计 PCR扩增仪凝胶成像系统电子分析天平

海尔公司海尔公司美国SIGMA公司美国STARTORIUSG公司美国BIO-BAD公司美国St公司

日本SHIMADZU公司

2.3 方法

2.3.1 血浆标本的留取

患者及辅酶空腹血液标本于EDTA抗凝管中，离心后取上层血浆500µl至 -80℃超低温冰箱保存。

2.3.2 外周血白细胞DNA提取

采用1ml血液基因组DNA提取试剂盒对标本进行提取外周血基因组DNA，步骤如下：

（1）将冻存血置于37℃恒温振荡器中150rpm复融，充分混匀至没有血凝块；（2）取750µl FG1 Buffer到1.5ml的离心管中，再加300µl全血并来回颠倒离心管5次，充分混匀（如果血样难溶解，SBP混匀仪混匀10min）；（3）10,000rpm离心20s；

（4）倒掉上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上2min；

（5）加入150µl的FG2/QIAGEN蛋白酶Buffer，盖上离心管，混合至颗粒完全溶解；

（6）将离心管低速离心3-5s，65℃温育5min；（7）加入100%异丙醇150µl，SBP混匀仪颠倒混匀；（8）10,000rpm离心3min；

（9）倒掉上清液，短暂倒置离心管在干净的吸水纸上；（10）加入70%乙醇150µl，漩涡混合5s；（11）10,000 rpm离心3min；

（12）倒掉上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上（至少5min）；（13）重复步骤9.10.11一到两次；

（14）风干DNA颗粒，直到所有液体蒸发（至少5min）；（15）加入200µl FG3 Buffer，低速漩涡混匀5s，65℃温育 1h；（16）经Nanodrop定量后，存放-20℃备。

以上操作均在冰上进行。（注：提取血液中基因组时，加入各试剂的比例如表1、表2）

表1 BufferFG2/蛋白酶配制

体积（ul）

BufferFG2 10 QIAGEN蛋白酶 0.1

表2 提取正常血液中基因组时，加入各试剂的比例

全血体积（ul）

全血体积（ml）

试剂（ul） 200 300 400 500 试剂（ml） 1 2 3 4 BufferFG1 500 750 1000 1250 BufferFG1 BufferFG2/蛋白酶 100 150

200 250 BufferFG2/蛋白酶

2.5 5.0 7.5 10.00.5 1.0 1.5 2.0

异丙醇 100 150 200 250 异丙醇 0.5 1.0 1.5 2.0 70%乙醇 100 150 200 250 70%乙醇 0.5 1.0 1.5 2.0 0.4BufferFG3 200 200 200 250 0.4BufferFG3

0.2 0.2 0.3 0.4

2.3.3 NDA质量检测

（1）取5ul基因组DNA置于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，检测基因组DNA片段的位置和亮度。

（2）DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

2.3.4 PCR扩增

（1）扩增MMACHC基因4个外显子片段的引物序列由上海生工生物技术有限公司设计合成。F：forward primer（正向引物），R：reverse primer（反向引物）。引物序列如表3。

表3 扩增MMACHC基因外显子序列的引物序列及扩增片段的长度外显子 1

引物序列

F：5'-GGGATCAATATGGTCTACGC- 3' R：5'-GAACCCACATACCCTACTGCG -3' F：5'-TCATGACATAGTGCTGAGGA -3' R：5'- TCACAGGGTTAGGGCCTCGC-3'

F：5'-GACAGGACCATGTTCACACACA-3' R：5'-AGGGAGAGGCCTTTACCAGTCT-3' F：5'-CACCCAGAAAACCTCATGACTG-3' R：5'-ACCACCATAAATCAGGGTCCAC-3'

产物大小（bp） 554 465 565 643

（2）配制25ul反应体系，如表4。

表4 PCR扩增：25ul反应体系

试剂组分

体积（µl）

H2O 4 2*GC Buffer І 12.5 dNTP 4 LA Tap

0.5

Primer 2 DNA 2

（3）PCR反应条件：94℃预热变性3min，接着94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min共30个循环，后接着72℃终延伸5min。

2.3.5 PCR扩增结果

（1）溶解曲线：扩增反应完成后，通过逐渐上升温度同时监测每一步的荧光信号产生溶解曲线，扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰可以将特异性产物与其它产物区分开。

（2）每份标本的PCR反应扩增产物各取5ul加在1%的含EB琼脂糖凝胶相邻加样孔上电泳，电压为80v，电流为60ms左右，时间约20-30分钟。在紫外投射仪下观察结果。

2.3.6 PCR产物的纯化

酒精/EDTA/NaAc法(25µL体系)：

（1）每管加入2 µL 125 mM EDTA，2 µL 3 M NaAc，加到管底；（2）加入50 µL 100% 酒精，转移至1.5mL EP管，14000g 离心3min；（3）倒立EP管于吸水纸，甩干；

（4）加入70 µL 70% 酒精，14000g 离心3min；（5）倒立EP管于吸水纸，甩干；（6）重复70% 酒精洗涤1次；

（7）让残余的酒精挥发干，加入1０µL Hi-Di甲酰胺，震荡溶解。

2.3.7 PCR产物测序

将PCR产物委托北京康旭生物公司采用ABI-PRISM3730测序仪器进行测序。

2.3.8 测序结果分析

读取测序峰图，将MMACHC基因的测序结果与GenBank中的原始序列进行对比分析。

3 结果

3.1 PCR扩增反应

PCR扩增产物与预计扩增片段长度大致一致，无非特异性扩增片段，可进型步进行纯化和测序。

3.2 扩增产物ＤＮA的直接测序

本文中3个家系中3名先证者，均为散发，3名先证者及其各自父母的MMACHC基因突变位点结果如下：

家系1中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第3外显子c.394C>T（编码区第 394 号核苷酸由C变为T）的杂合无义突变，第4外显子c.656_658del（编码区第656_658号核苷酸缺失）核苷酸序列缺失的杂合突变。父亲第3外显子c.394C>T杂合无义突变；母亲第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变；

家系2中先证者MMACHC 基因发现：第4外显子 c.609G>A（编码区第 609 号核苷酸由 G 变为 A）的纯合无义变异。受检者其父母均为第4外显子 c.609G>A杂合无义突变；

家系3中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第1外显子c.80A>G（编码区第 80 号核苷酸由A变为G）的杂合错义突变，第4外显子c.609G>A（编码区第609 号核苷酸由G变为A）的杂合无义突变。父亲第1外显子c.80A>G杂合错义突变；母亲第4外显子c.609G>A杂合无义突变。

4 讨论

维生素B12为含钴的维生素，正常人每日需要量为1ug，主要由动物性食物提供，肠道微生物亦能合成少量，其在体内因结合基团不同，有多种形式存在，如氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素，后两者是维生素B12的活化形型，也是血液中存在的主要形式。药用维生素B12必须在体内转化为活性形式才能被组织所利用。维生素B12是细胞分裂和维持神经组织髓鞘完整所必需。B12主要参加下列代谢过程：1、同型半胱氨酸甲基化生成蛋氨酸反应，催化这一反应的蛋氨酸合成酶（或称甲基转移酶）的辅基为维生素B12，它参与甲基的转移。B12缺乏时，导致蛋氨酸生成受阻，同时影响四氢叶酸的再循环，影响嘌呤、嘧啶的合成，最终导致核酸合成障碍，产生巨幼红细胞性贫血。因此B12缺乏会同时引起叶酸缺乏症和同型半胱氨酸（堆积）血症。2、5-脱氧腺苷钴胺素是L-甲基丙乙酰CoA变位酶的辅酶，催化L-甲基丙乙酰CoA转化为琥珀酰CoA，进入三羧酸循环。当B12缺乏时L-甲基丙乙酰CoA大量堆积，影响脂肪酸的正常合成，从而影响髓鞘转化，髓鞘退化，进行性脱髓鞘。

本研究中的3例先证者均得到明确诊断，给予甲钴胺注射液肌肉注射，后给予甜菜碱、左旋肉碱治疗，临床症状明显改善，实验室指标趋向正常，总结如下：

1、家系1先证者给予肌肉注射甲钴胺后呕吐症状好转，饮食可，四肢肌张力渐好转，生长发育及智力发育渐趋向同龄正常儿童。治疗后多次测尿液中同型半胱氨酸2-4 umol/L（正常对照＜5umol/L），血浆同型半胱氨酸33-43umol/L，虽偏高，但较治疗前明显下降（正常对照4-10umol/L）。GC-MS分析尿液中甲基丙二酸、甲基枸橼酸均正常范围。LC-MS/MS分析血液中C3，C3/C0,C3/C2均降至正常范围。

2、家系2先证者精神症状明显好转，给予抗癫痫药物治疗癫痫发作部分控制，由2-3次/天较少至3-4天发作1次，甚至间隔时间更长。实验室检查指标均趋向正常范围。

3、家系3先证者生长发育逐渐趋向正常同龄正常儿童，实验室检查指标均趋向正常范围。

我国的cblC型患者中 c. 609G > A 位点突变频率最高 ( 48 %~ 67%)，其次是 c. 658 _ 660 delAAG, 该位点的突变频率为 7 .1 %~13 .9 %[15-16]。这两种类型的突变均会导致截短的 cblC 蛋白。有文献报道，携带 c. 609 G > A 与 c. 658 _ 660 delAAG两个热点突变的患儿均发病较早，且症状较严重，预后较差[15]。

本研究中3个家系中的先证者及正常成员的MMACHC基因分析，其中均发现有发现有MMACHC基因不同位点的突变，突变与cblC病的发病有相关性，总结如下：

1、家系1先证者：复合杂合突变：（1）第3外显子c.394C>T的杂合无义突变：该位点位于钴胺素结合区，可影响钴胺素的结合[16]；（2）第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变：该位点位于c-末端结构区中，可能影响钴胺素转运所需的质子泵能量转化；（3）2个突变位点的复合杂合突变可能使钴胺素结合及转运的代谢过程受累，造成患者体内VitB12无法利用，出现血尿中甲基丙二酸及血中同型半胱氨酸增多，导致一系列临床症状及巨幼细胞性贫血；（4）经查询基因库，c.656_658delAGA变异的致病性尚未见文献报道，高度怀疑1个新的遗传突变。

2、家系2先证者：第4外显子 c.609G>A的纯合无义变异：（1）该位点位于c-末端结构区中，纯和突变可能影响钴胺素转运所需的质子泵能量转化[16、17]；（2）该突变位点的纯和杂合突变提前终止密码子，使MMACHC表达的蛋白翻译提前终止，导致其表达的结果及功能发生变化，影响腺苷钴胺素和甲基钴胺素的产生，体内蓄积大量甲基丙二酸及同型半胱氨酸，尿液中也出现大量及甲基丙二酸，进而导致一系列临床症状[17-18]；（3）该变异的致病性已经有文献报道；（4）该患者在新生儿时发病表现：吃奶无力、喂养困难、生长发育迟滞、精神智力发育迟滞、反复惊厥发作、嗜睡。文献报道携带 c. 609 G > A致病基因突变发病年龄较早，且症状较严重[17]。

3、家系3先证者：复合杂合突变：（1）第1外显子c.80A>G的杂合错义突变：该位点位于钴胺素结合区，可影响钴胺素的结合，使编码的谷氨酰胺→精氨酸，造成蛋白质分子结构的异常[19]；（2）2个突变位点的复合杂合突变可能使钴胺素转运合成的代谢过程受累，出现血尿中甲基丙二酸及血中同型半胱氨酸增多，导致一系列临床症状及巨幼细胞性贫血；（3）该变异的致病性已经有文献报道。

甲基丙二酸血症早期发现和预防重症酮症酸中毒发作是决定预后的关键，

酮症酸中毒反复发作会引起生长发育落后、智力低下、早期能开展饮食疗法和药物治疗可改善预后。目前治疗以药物为主[14、19-21]：急性期治疗：1.输液：纠正酸中毒。2.甲钴胺治疗：剂量：0.33mg/Kg/day，随着病情的稳定，频率可减少，治疗剂量可以大剂量高达30mg/ml治疗，可以有效的预防并发症的进展，文献报道，高剂量的甲钴胺治疗存在血栓性微血管病的并发症的cblC病提供了更好的代谢控制[22]。3. 甜菜碱[14、23]：是一种有效的甲基供体，同型半胱氨酸蛋氨酸通过甜菜碱提供甲基合成半胱氨酸甲基转移酶，绕过甲基钴胺素依赖蛋氨酸合酶途径。甲钴胺和甜菜碱的协同效应是改善血浆总半胱氨酸水平和蛋氨酸正常化。剂量：无水甜菜碱粉末在液体中稀释，250mg/Kg/day，分两次口服。耐受性较好，副作用少，但对某些患者来说气味不能接受。文献报道[24]，甜菜碱可降低总半胱氨酸水平，增加血浆蛋氨酸浓度。甜菜碱的不利影响已导致高蛋氨酸血症情况报告[25]，但患者不是cblC病。4. 左旋肉碱：（左卡尼汀）：剂量50–200mg/Kg/day。它有利于丙酸的排泄和防止肉碱缺乏症[26]。肉碱的从头合成取决于蛋氨酸可以降低患者cblC。然而，随着cblC病患者补充左旋肉碱效果尚未被证实[27]。5. 亚叶酸钙：叶酸作为cblC病的辅助治疗。叶酸被频繁使用，因为它穿过血脑障壁比叶酸更有效[28]，从降低蛋氨酸合成酶活性结果旁路[29]。6.血液透析：当发生严重的代谢性酸中毒或高氨血症不能改善的情况下，迅速开始血液透析和持续过滤透析。

综上所述，本研究中c.394C>T、c.609G>A变异是一种常见突变，c.656_658del变异的致病性尚未见文献报道，丰富了MMACHC基因突变的类型，同时在进行中国人甲基丙二酸血症基因诊断或产前诊断时，除参考国际已报道的突变点外，应注意这一新的突变的的可能性。未来的治疗包括基因或细胞治疗，将对疾病的治疗是有效的cblC仍有待研究。

5 结论

1. 本研究中c.394C>T、c.609G>A、 c.80A>G突变致病性文献已有报道。 2. c.656_658delAGA突变的致病性尚未见文献报道。

3. 所有已报道过的突变及本研究发现的新的突变位点均有助于建立基因诊断筛查系统，并可进行携带者的检测及先证者家系的产前诊断。

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附图

390 400

C T A C T A C C A A |T G A C A A G A T G T

图1 家系1中先证者MMACHC基因：第3外显子394位C>T杂合无义突变 390 400

C T A C T A C C A A |C G A C A A G A T G T

图2 家系1母亲MMACHC基因：第3外显子394位未见基因突变

100 110

T C A G A A G A G C |A G A A C G A C T T C A G A A G G C C T A C A G G C C T A C T T C

图3 家系1先证者MMACHC基因：第4外显子c.656_658del杂合突变

100 110

T C A G A A G A G C |A G A A C G C C T A C

图4 家系1父亲MMACHC基因：第4外显子c.656_658未见缺失

90 100 G G C G T G A T T G |A A C T T A C C G G G

图5 家系2先证者MMACHC基因：第4外显子c.609G>A纯合无义变异

90 100 G G C G T G A T T G |A A C T T A C C G G G

图6 家系2父亲、母亲MMACHC基因：第4外显子c.609G>A杂合无义变异

100 110

|G G G T T A G T T T A T A C C C C T T C C

图7 家系3先证者MMACHC基因：第1外显子c.80A>G杂合错义突变

100 110 T A C C C C T T C C |A G G T T A G T T T A

图8 家系3母亲MMACHC基因：第1外显子c.80未见基因突变

90 100 G G C G T G A T T G |A A C T T A C C G G G

图9 家系3先证者MMACHC基因：第4外显子c.609G>A杂合无义变异

90 100

G G C G T G A T T G |A A C T T A C C G G G

图10 家系3父亲MMACHC基因：第4外显子c.609未见基因突变

综述

甲基丙二酸血症研究进展

综述李婉婉审校罗强

先天性氨基酸、有机酸代谢病是儿童遗传代谢疾病中比较常见的一种病种，主要侵害中枢神经系统，是造成儿童智运动及智力发育迟滞的重要原因。先天性氨基酸、有机酸代谢病由于酶的缺陷导致正常的代谢途径发生障碍，进而引起生化反应的异常，导致组织或体液内环境中氨基酸异常堆积，引起相应的组织器官功能障碍，并出现相对应的各种临床症状。先天性的氨基酸、有机酸代谢异常患者出生时一般未见异常现象，经数日的哺乳后因生化反应过程中酶的缺陷导致代谢途径阻滞，即可出现受累的氨基酸异常蓄积，血中此种氨基酸水平明显增高，继续增高超过肾阈值时，出现氨基酸有机酸尿现象。测定血液和尿液中异常增多的氨基酸或尿液中明显增多的代谢产物，可做出明确诊断。早期检测氨基酸及代谢产物，可以在组织器官功能受到损失及临床症候表现前给予明确的诊断，并根据诊断进行对症及有效的治疗，可预防其临床症状的出现，避免不可逆转的不良后果。

支链氨基酸（branch chain amino acid，BCAA）是一组非极性脂肪族氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。支链氨基酸是人体所必需的氨基酸，外周组织中作为氮供体存在[1]，特别是骨骼肌中，是支链氨基酸转氨基作用的主要场所，来自骨骼肌蛋白降解和从血亮氨酸增强胰岛素的吸收，支持形成谷氨酸，其中，反过来，是产生丙氨酸氨基转移的代谢途径，作为脑内谷氨酸的来源之一。丙氨酸释放到肝脏内，其中碳成为糖异生底物和氮转化为尿素，这些反应在饥饿时承担高度额自适意义，高达30%的丙氨酸N来自支链氨基酸。

支链氨基酸在人脑内吸收：1.进入大脑中是一个主动的过程，要求不同的运输系统协助其转运[1]。2.在顶叶皮质层，亮氨酸的的主动转运较其他任何氨基酸更快，在生理浓度的运输过程中始终保持饱和状态[2]。3.大脑有丰富的支链氨基酸转氨基作用，因为大脑具有支链氨基酸转氨酶线粒体和胞浆内形成身体器官

几乎是独一无二的。4. 对支链氨基酸的转氨基作用脑率大大超过其氧化率[3]。5.神经元能够输送代谢产生的酮酸。5. 转氨基作用可以在“前进”或“反向”的方向发展，方向发展取决于反应物的相对浓度[4]。6. 和磁共振波谱的研究表明，神经元与星形胶质细胞亮氨酸运输可能足以补充胶质氮库，虽然这种方法可能不提供足够的时间敏感性的动态和精细的代谢调整，无疑是改变反应的神经元活动发生或解剖[5]。

本文将从以下几个方面对甲基丙二酸血症进行阐述。

1 定义

甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）又被称为甲基丙二酸尿症（methylmalonicaciduria），由Oberholzer等[6]人第一次报道，其是氨基酸与有机酸代谢异常（即支链氨基酸代谢异常）中最常见的病种，是一种常染色体隐性遗传性有机酸血症性疾病。甲基丙二酸血症的患病率在不同国家和地区存在着很大的差异[7]，美国为1：48000；意大利为1：61775，德国为 l：169000，日本为1：50 000，我国台湾地区约为1：85000。

2 发病机制

甲基丙二酸血症发病机制较为复杂，根据基因突变后引起代谢过程中所需要的甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷及其辅酶-5’脱氧腺苷钴胺素（维生素B12）（Ado-Cb1）合成障碍[6]。以上突变缺陷造成其过程中产生的前体物质甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等不能进入三羧酸循环代谢中，导致有机酸代谢产物的异常蓄积，进而导致三羧酸循环中琥珀酸在生成延胡索酸过程中所需要的琥珀酸脱氢酶（succinatedehydrogenase，简称SDH，是线粒体内膜的结合酶）亲和性低下，甚至亲和力为零，线粒体中氧化呼吸链受到阻滞，引起中枢神经系统、肝脏、肾脏、骨髓等多个脏器均可有不同程度的损伤，尤其是中枢神经系统破坏[1]。以上发病机制中的缺陷均为常染色体隐性遗传方式。

2.1 甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）异常

甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷，即变位酶酶蛋白（mutase apoenzyme）缺陷产生的完全性变位酶缺陷（completetemutase deficiency,mut0）和部分缺陷（partial deficiency,mut-）两种。

甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）缺陷的甲基丙二酸血症患者，编码MCM的基因是是MUT（OMIM25 1000）基因[8]，该基因位于6号染色体的P12-P21.2编码区域，由13个外显子组成，长度为2.7kb，编码一个含有32个氨基酸残基的，由750个氨基酸序列组成的线粒体靶向序列的一条多肽链，这条多肽链在穿梭进入线粒体基质之前会被切割掉其所带有的32个氨基酸残基序列，切割后的32个氨基酸的线粒体前导序列的两个亚基组被装配成一个同型二聚体，与两分子的腺苷钴胺素（Ado-Cbl）结合，并组合成有活性的全酶钴胺素[8]。甲基丙二酰辅酶A变位酶是一种核编码的线粒体基质酶，催化完成异构化L-甲基丙二酸单酰辅酶A代谢生成琥珀酰辅酶A的过程，代谢过程中以腺苷钴胺作为辅助因子，然后生成的琥珀酰辅酶A进入三羧酸循环完成进一步的代谢过程，产生大量能量共人体需要[8]。根据甲基丙二酰辅酶A变位酶的活性，生化细胞研究划定了该酶缺陷时的2种表型变异：一种是mut0：突变类型中生物检测未检测到钴胺素依赖性的活性；一种是mut-：突变类型中生物检测到残余少量或中度的钴胺素依赖性活性[8]。

正常的甲基丙二酰辅酶A变位酶包括不同的功能域[9]：N端结构域（残基1-32）、随后一段中所涉及的两个MCM的单体的二聚化（残基32-87）、N-端（β/α）一段含有辅酶A结合结构域（残基87-416）和C-末端钴胺素结合β/α5域（残基578-750）、由160个氨基酸组成的连接区连接了八个β/α段到C-末端β/α结构域。甲基丙二酰辅酶A变位酶的每个亚单位都具体有2个主要的功能结构域，一个功能结构域位是用于连接同型二聚体中的2个亚基的结构(编码33—87位氨基酸)和结合底物的结合区(编码88—422位氨基酸)的N-端，另一个功能结构域是位于结合Ado—Cbl辅酶结合区的C-端(编码578—750位氨基酸)。此外，还包括一个可关闭N-端功能的功能结构域(编码423—577位氨基酸)，它是一段连接底物结合区和辅酶结合区2个功能区的一段较长的连接区域。

到目前为止国外已发现MUT基因的突变位点有200余种[10-11]，有错义突变（一个氨基酸变为另外一种氨基酸）、无义突变（一个氨基酸变为终止密码子）、

剪切位点的突变（在DNA转录为mRNA的过程中，要将内含子剪去，外显子拼接，其中内含子和外显子交界的区域，即为剪接位点）、移码突变（或称框移突变，插入非3整倍数碱基导致密码子读码框错位移动），尤其以错义突变多见。MUT基因突变存在地域差异，不同的国家级民族有不同的常见基因突变，如等位基因是c.322c＞T（p.r108c），c.280g >A（p.g94r）和c.1022dupa在西班牙裔患者常见[10]；c.2150G＞T（p.g717v），c.1867gG>A（p.g623r）和c.281G＞T（p.g94v）在黑人患者常见[11]；c.1280G>A（p.g427d）和c.1630.1631delGGINSTA（p.g544x）在亚洲患者常见[11]；c.655A＞T（p.n219y）在白种人患者常见；和c.349g＞T（p.e117x）在日本患者常见[12]。生化表型的突变在大多数情况下是在钴胺素结合域[11]与突变相关，如错义突变-c.299a > G（p.y100c），c.1031c＞T（p.s344f），c1097a > G（p.n366s）和c.2081g＞T（p.r694l），其中三种突变（p.y100c，p.s344f，p.n366s）涉及严格保守的氨基酸的N-末端的底物结合结构域相关。在中国国内，王斐等[13]在14例MMA中发现17种MUT基因突变中，以C．1630-1631GG>TA (p.G544X)被检出率最为常见，突变的频率为14．3％，并无突变热点存在。蔡奥捷等[14]在MMA中检出的25种MUT基因突变分别存在于48个等位基因中，其中以c．729-730insTT(p．D244Lfs*39)的被检出率最高，突变频率为20％。

2.2 甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）的辅酶异常

MCM辅酶的异常指维生素B12在辅助因子形式异常导致的VitB12代谢异常的遗传性疾病，其辅助因子形式包括甲基钴胺素（MeCbl）和腺苷钴胺素（AdoCbl）。VitB12代谢反应过程中合成、转运、代谢等任何一个环节出现异常，均可导致MMA发病，可分为八个不同的基因突变组（cblA-cblH）。蛋氨酸合酶功能缺陷导致高胱氨酸尿症和升高血浆总同型半胱氨酸（cblE，cblG，和cblD），而原发性缺陷的酶或钴胺素合成导致甲基丙二酸尿症（cblA，cbl B，cblD，cblH），即线粒体钴胺素还原酶（mitochondrial Cbl reductase，cblA）缺乏，线粒体钴胺素腺苷转移酶（mitochodrial cobalamin adenosyltransferase，cblB）缺乏。缺乏参与细胞维生素B12代谢的早期步骤的酶导致同型半胱氨酸以及血和尿中甲基丙二酸的积累（cblC、cblD，和cblF）。

[15]

（cobalamin，CBL），是唯一含金属元素的维生素，维生素B12又称钴胺素

维生素B12的利用遗传疾病是新生儿疾病的一个重要部分继承。在人体内的主要存在形式有氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺素和5’-脱氧腺苷钴胺素。VitB12是

N5-CH3-FH4转甲基酶（甲硫氨酸合成酶）的辅酶，催化同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸。作为一个辅助因子VitB12的代谢，必需通过复杂的途径，改变其结构，并将其通过细胞的亚细胞。B12缺乏时，影响甲硫氨酸合成，同时也影响四氢叶酸的再生，造成巨幼红细胞性贫血，即恶性贫血。同型半胱氨酸的堆积可造成高同型半胱氨酸血症，增加动脉硬化、血栓生成和高血压的危险性[15]。B12缺乏所导致的神经疾患便是由于脂肪酸的合成异常而影响髓鞘质的转换，造成髓鞘质变性退化，引发进行性脱髓鞘。所有B12具有营养神经的作用。 2.2.1 cblA型

cblA型的基因，被命名为MMAA基因[16]，位于4号染色体的q31.1-2编码区域，长度为17.1kb，共有7个外显子组成，编码ATP酶，正常的MMAA基因编码包括前导序列的418个氨基酸的多肽链，成熟后翻译为线粒体钴胺素还原酶（mitochondrial Cbl reductase，cblA）。在行MMAA基因的检测过程中发现该基因没有编码还原酶，而是一种蛋白质，它属于P-环磷酸激酶的G3E家族，该家族中的蛋白是参与金属中心的组件或功能的金属酶，主要存在于肝脏和骨骼肌中[16]。cblA可能存在两种功能：一种是作为组件的运输系统成分直接转运维生素B12，使其进入线粒体内；一种是作为可溶性的辅助性辅助蛋白辅助维生素B12跨膜转运至线粒体内。国内外已报道有30余例MMAA基因突变[17-18]。

C. Melissa Dobson[19]等人报道：37 例cblA型患者共发现64种不同的MMAA基因突变，新发现的突变位点包括：一个复制（c.551dupg，p.c187lfsx3），删除（c.387delc，p.y129yfsx13），一个剪接位点突变（c.440-2aA> G，剪接位点），4个错义突变（c.748G >A，p.e520k；c.820G >A，p.g274s；c.627G >A，p.r209s；c.826aA> G，p.k276e），和3的废话突变（c.960G >A，p.w320x；c.1075C >T，p.e359x；c.1084C >T，p.q362x），所有新的错义变异影响高度保守的残基，并预测是具有破坏性的。文章中发现，6号外显子杂合错义变化，c.821g >A（p.g274d），影响残留在脊椎动物中是高度保守的。它改变了甘氨酸，这是一个很小的氨基酸，是一种酸性氨基酸。

Lerner-Ellis JP[20]等人报道：35例患者中提示22的基因突变已被确定：13导致过早终止密码子，包括删除，插入，和一个重复；三剪接位点的缺陷；六个错义突变发生在高度保守的氨基酸残基。c.433c4t（r145x）突变为21例，代

表致病基因和单倍型，被确诊的突变均为纯化突变；c.592_595delaCTG突变在6个人，其中五人是欧洲血统，可能具有种族及地域的差异。 2.2.2 cblB型

cblB型的基因，即MMAB基因，位于12号染色体的q24.1编码区域，它由9个外显子组成，编码ATP酶，翻译转录为线粒体钴胺素腺苷转移酶（即cblB），属于钴胺素adenosyltransferases PduO家族的一个成员，由250个氨基酸序列组成[20]。MMAA基因将为钴胺素还原酶或线粒体转运维生素B12的辅助因子。线粒体缺陷因为钴胺素合成减少是定位于线粒体，和活动如法进行细胞提取物，而不是整个细胞恢复。线粒体钴胺素腺苷转移酶能够催化5'-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）中腺苷基转移至钻胺素上，并合成腺苷钴胺素（Ado-Cbl）。线粒体钴胺素腺苷转移酶也可作为分子伴侣将Ado-Cbl转移至线粒体中的甲基丙二酰辅酶A变位酶（即MCM）上，之后Ado-Cbl作为MCM的辅酶参与甲基丙二酰辅酶A代谢生成琥珀酰辅酶A的反应过程中[21]。

迄今国内外已报道了30余种MMAB基因突变，并且具有种族和地域差异。Jordan P等[22]报道 35例cblB型甲基丙二酸尿症患者的基因突变类型，共发现了19个致病突变，大多数为错义突变（9/11），并多数（11/19）个位于外显子7上，影响酶活性中心的氨基酸残基，其中c.556C>T是特别常见的致病基因，占33%，它几乎完全被认为是欧洲人群早发型的常见突变，常发病于出生后第一年内。Ana Jorge-Finnigan[23]等人文献报道：42例cblB型甲基丙二酸血症患者，有21中MMAB基因突变位点别检测出，如c.185C＞T（p.t62m），c.394T＞C（p.c132r），c.398C＞T（p.s133f），c.521C＞T（p.s174l），c.572gG>A（p.r191q）；且1号外显子中c.56_57GC > AA（p.r19q）和9号外显子中c.716 T＞C（p.m239k）分别检测到42.9%和71.4%。 2.2.3 cblC型

cblC病的致病基因为MMACHC基因[24]，该基因位于1号染色p34编码区域，全长总共约10.8kb，编码一个包括了282个氨基酸的cblC蛋白，该cblC蛋白的功能是在细胞胞浆内催化还原脱氰反应和合成腺苷钴胺素反应。

目前为止，国内外共有250种不同的基因突变类型，不同的国家和民族MMACHC基因突变的位点有差异性，如c.331c > T突变多于法国、加拿大国家患者多见；c.394c > T突变常见在亚洲的印度/巴基斯坦/中东地区。

欧美国家 MMA 患者最常见的突变类型是c. 271 dupA[25]，其中Lemer.EHis等[24]通过对国外366例cblC病患儿基因分析发现了60个突变位点，c.271dupA突变率高达占42%，该位点纯合突变的患儿均发病较早。Augoustides Savvopoulou等人的报道[26]，2姐妹基因检测分析：确诊甲基丙二酸血症，存在 c.271dupa和c.394C >T复合杂合突变，姐姐在新生儿期即有癫痫发作，发育延迟，逐渐进展为痉挛性截瘫，，死亡于13岁。妹妹9岁以前无临床表现，之后逐渐出现生长迟缓、癫痫发作。在相同的突变位点中出现早发型和迟发型2中不同的情况，存在显著的家庭内表型的异质性，一些额外的因素有助于解释家庭内的变异可能包括“协同性”疾病相关的基因在钴胺素通路其他编码的酶或蛋白质，顺多态性影响折叠或残余的突变酶活性的反式作用因子的相互作用与突变的等位基因和非遗传因素如饮食。

我国国内的cblC型患者中 c. 609G > A 位点突变频率最高 ( 48 %~ 67%)，其次是 c. 658 _ 660 delAAG, 该位点的突变频率为 7 .1 %~13 .9 %[28-29]。这两种类型的突变均会导致截短的 cblC 蛋白。有文献报道，携带 c. 609 G > A 与 c. 658 _ 660 delAAG两个热点突变的患儿均发病较早，且症状较严重，预后较差[28]。 2.2.4 cblD型

cblD型甲基丙二酸血症患儿，致病基因是MMADHC基因[29]，该基因位于2号染色体的q22.1–q23.3编码区域，长度为891bp，编码296个氨基酸多肽序列，该缺陷可能导致孤立的甲基丙二酸血症症、高胱氨酸血症或分离。MMADHC基因存在预测的线粒体前导序列和一个假定的维生素B12结合序列。基因突变蛋白可能负责胞浆和线粒体内的钴胺素分支的代谢途径。MMADHC是独特的，表现出明显的基因型与表型的关系[30]，即在5′区域截断突变仅导致甲基丙二酸尿症（MCM不足），截断突变中3′地区导致甲基丙二酸尿症、高胱氨酸尿症合并（MCM和不足），并在3′区错义突变导致只有高胱氨酸尿症（MS不足），三种不同的生化表型涉及胞浆和线粒体途径。Suormala T等[31]报道7例cblD型甲基丙二酸血症中有9种基因突变类型，其中5个导致编码序列的突变形成终止密码子使蛋白质翻译过程提前，从而截短蛋白，包括2个无义突变160c→T，

748c→T），2个序列缺失（57_64del，696 + 1_4del），和一个重复（419dupa）；文章中1例同时伴有同型半胱氨酸血症的患者的基因突变位点为（419dupa携带突变，696 + 1_4del，和748c→T），导致编码的提取终止，形成一个缺乏功能域有缺陷的蛋白而致病。 2.2.5 cblE型

cblE型甲基丙二酸血症患者，致病基因为MTRR基因[33]，该基因位于5号染色体的p15.2-15.3编码区域，长度约34kb，含有15个外显子和14个内含子，该基因编码一个含有黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） / NADPH结合位点单一蛋白该酶即为蛋氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase，MSR），由698个氨基酸序列组成多肽链，该酶是一个可溶性的单体蛋白，属于双黄素蛋白家族，能够维持人体内有充足的有活性钴胺素，作为甲硫氨酸合成酶的第二蛋白存在，是甲硫氨酸合成酶的辅助因子，作用是使甲硫氨酸合成酶的活性状态充分降低，并绑定钴胺素。当维生素B12被氧化时，甲硫氨酸合成酶还原酶催化还原甲基化，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体再生甲钴胺。

2.2.6 cblF型

CblF型甲基丙二酸血症，致病基因[34]位于6号染色体的q13编码区域，该基因编码溶酶体膜蛋白LMBD1，由540个氨基酸序列组成，具有同源性的蛋白膜受体LIMR溶酶体膜蛋白，是一个具有LMBD1胞内C-末端和九个跨膜螺旋在不同的器官中表达的溶酶体膜蛋白，可作为运载蛋白（如小的疏水性分子如类固醇和脂质载体），因大多数维生素B12存在于溶酶体中，只有一小部分到达胞浆和线粒体中，一个脂质运载蛋白分子可以在结合维生素B12后使溶酶体降解，故该基因发生突变时导致溶酶体中的VitB12穿梭进入细胞质的过程发生缺陷[35]。至今国内外共报道[34-35]13例患者中已有6中突变基因被确定，多为移码或提前终止翻译，而且，有趣的是，均为c.1056delG（p.l352fsx18）。大多数患者在婴儿期死亡或存在有轻度至严重的生长及智力发育迟滞，但此型对维生素B12治疗有效。

2.2.7 cblG型

cblG型甲基丙二酸血症患者，致病基因为MTR基因[36]，该基因位于1号染色体的p43编码区域，这是一个高度压缩的基因，由33个外显子和32个内含子组成，跨度至少60 KB，编码细胞质中的甲硫氨酸合成酶（即N5-CH3-FH4转甲基酶，EC 2.1.1.13），该酶在在由同型半胱氨酸合成甲硫氨酸的过程中起甲基供体的作用，催化同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸，以5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，和需要的活性酶结合钴胺素作为辅基存在，是甲硫氨酸循环的关键酶。甲硫氨酸合酶的甲基化周期至关重要[36]，它保持了甲硫氨酸衍生物，如S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的细胞水平，这种分子在多种细胞反应过程中充当甲基供体，包括DNA、RNA的甲基供体、蛋白质的甲基化、神经递质的合成。甲硫氨酸合成酶的辅酶是维生素B12，参与甲基的转移，它也是唯一参与叶酸的循环，因为它是使用甲基四氢叶酸作为甲基供体的只有哺乳动物的酶[37]。

甲硫氨酸合酶的活性取决于第二蛋白的存在，即甲硫氨酸合成酶还原酶[38]，使甲硫氨酸合成酶的活性状态充分降低，并绑定钴胺素。当维生素B12被氧化时，甲硫氨酸合成酶还原酶催化还原甲基化，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体再生甲钴胺。

甲硫氨酸合成酶的活性对于人体内维持足够水平的甲硫氨酸和防止同型半胱氨酸的积累起到非常重要作用。同型半胱氨酸的堆积可造成高同型半胱氨酸血症，增加动脉硬化、血栓生成和高血压的危险性[32]。迄今为止，国内外已发现有20余种该基因的不同突变类型[36]，其中最常见的是c.3518C＞T（p1173l），导致一个MspI酶切位点丢失。其他如对c.12-13delgc，这会导致蛋白质功能完全缺失；对c.3613G＞T，这将导致在末端的62个氨基酸的蛋氨酸合成酶蛋白损失；对c.12-13delGC会导致缺乏所有四个功能结构域蛋白；对c.381delA会导致缺乏大部分的同型半胱氨酸结合域蛋白，以[39]及所有的5-甲基四氢叶酸，钴胺素结合，并激活域；对c.1753c＞T将导致的5-甲基四氢叶酸域部分损失，以及所有的钴胺素结合结构域和激活域；对c.2101delt将导致大部分的钴胺素结合域和整个激活域损失。剩下的三个截断突变会导致激活域的部分损失，包括残基被绑定的S-腺苷甲硫氨酸的关键。它已被证明，一个完整的激活域蛋氨酸合成酶的功能是至关重要的。

2.2.8 cblH型

基因突变是X-连锁隐性Xq28，该基因突变至今的机制不明确。

2.3 其他基因突变类型

有文献报道[40]，在MMA患者中发现还发现了其他的基因突变，甲基丙二酰CoA异构酶和ADP结合形成琥珀酰辅酶A合成酶（EC scs-a，6.2.1.5）。甲基丙二酰CoA异构酶的编码基因位于2号染色体p13.3区域，该酶是一种线粒体基质酶，催化完成琥珀酰辅酶A和辅酶A的合成琥珀酸；琥珀酰辅酶A合成酶的编码基因位于13号染色体的q14.2 SSCLA2 区域，编码这两种酶的基因发生突变时均可导致琥珀酰辅酶A合成酶减少，影响三羧酸循环。另外，琥珀酰辅酶A还能够和甘氨酸结合，经过δ-氨基γ-酮戊酸代谢生成四吡咯化合物（该代谢产物为血红素化合物的合成起点）。

3 病理改变

甲基丙二酸血症的细胞损伤的病理生理改变如下：首先，在三羧酸循环及氧化呼吸链反应中参与干扰代谢过程中谷胱甘肽和二羧酸运输，继而出现线粒体功能障碍，氧化应激反应和线粒体DNA平衡的失衡。其次，人体内积累的大量二元酸可能是有毒的，特别是在大脑内，根据“陷阱”假说，二羧酸在血脑屏障、星形胶质细胞和神经元之间以及从头脑中的运输、合成是造成脑损伤的关键。

3.1 细胞凋亡在脑损伤中的病理改变

据文献报道中论述的甲基丙二酸血症的病理改变[41],表示细胞凋亡在甲基丙二酸血症脑损伤发病机制中的作用，这些病变常有弥漫性大脑和小脑萎缩，严重的反应性胶质细胞增生，髓鞘，和耗尽或发育不完全的小脑外颗粒细胞在10个月以上年龄的儿童，出现老年痴呆症2型星形胶质细胞，多发性小脑出血，未成熟的神经元选择性死亡和广泛的核碎裂或变量的大小及形状不同的染色体浓缩，在新生儿期即可出现这些变化,类似于细胞凋亡的特征性表现。出血和坏死灶的发现主要发生在基底神经节和大脑皮层。坏死可能导致血管壁类似线粒体肌病，脑病变性有关的出血和缺血，乳酸性酸中毒和卒中样发作[41]。Kanaumi T等[42]人文献中一个死亡于3岁龄的甲基丙二酸血症患者的尸检病理结果提示：

多个小的出血和坏死灶近病灶在尾状核、小脑和脑干，和神经髓鞘形成不良的海绵状变化散落在大脑皮层病变，老白质、脑干和小脑皮质。在基底神经节坏死之前已经报道过，但没有坏死灶报道在黑质和中脑导水管周围的海绵状病灶与单链DNA阳性神经元在动眼神经和面神经核。

3.2 代谢异常引起的病理改变

实验证明甲基丙二酸诱导胚胎大鼠纹状体细胞培养神经元损伤[43]。人体中高浓度的甲基丙二酸，离子型谷氨酸受体拮抗剂，抗氧化剂，和琥珀酸减少甲基丙二酸–诱导的细胞损伤。体内高浓度的甲基丙二酸又能明显使琥珀酸脱氢酶的酶活性下降，生成大量的琥珀酸，引起神经细胞的兴奋性毒性作用[44]。此外，代谢异常可能会抑制大脑的结构发育，随着年龄的增长，小脑颗粒细胞层细胞明显增多，大脑的发育迟滞均可导致智力发育迟滞。

3.3 进行性慢性肾脏功能损伤的病理改变

甲基丙二酸血症的长期并发症（MMA尿）中进行性慢性肾功能衰竭，类似细胞损伤中的二羧酸转运及线粒体毒素的累积对肾脏功能的损伤，该疾病基因缺陷的严重程度在肾脏损失过程中起到很关键的作用，血液中越高浓度的甲基丙二酸超过了肾脏的排泄阈值，典型的是有机酸引起肾小管慢性进行性损伤，并抑制尿酸的肾小管分泌，而体内高尿酸症状是引起痛风性肾脏慢性间质性炎症[45]，进而向肾脏功能衰竭的结果进展。文献报道[46]中进行肾脏活检提示：具有显著的肾小管萎缩、间质纤维化穿插的单核细胞浸润，而无其他明显的异常表现，该疾病引起的进行性肾脏功能衰竭后在其17岁进行肾脏移植[46]。这一观察结果符合MUT型 [47]和cbl型 [48]患者的肾脏损坏活检情况。该甲基丙二酸血症患者在未来的16.5年的随访过程中，间断进行肾脏活检未再表现出任何显著的肾脏损伤病理，即使在其怀孕期间[49]。

4 临床表现

急性代谢危机常出现在患者出生后的第一天或由于长期进食或传染病感染等急性症状出现时人体内分解代谢障碍。代谢危机的特点：乳酸性酸中毒、甲基丙二酸尿症、低或高血糖、高氨血症、可能导致的代谢性脑病和多个脏器功

能衰竭。并发症包括生长发迟滞、发育迟滞、智力低下、肌张力减退，代谢类中风与基底神经节损害和肾功能衰竭等。

MMA患者的临床表现是异质的，复杂多样的，易造成误诊，并且每个不同个体发病时的临床表现各不相同，最常见的症状和体征是嗜睡、生长障碍、反复呕吐、脱水、呼吸困难及肌张力低下。根据维生素B12负荷试验结果，分为VitB12有效型和无效型，即连续3天肌肉内注射VitB12 1mg/d，若症状好转，生化异常改善，则为VitB12有效型。VitB12有效型：多为cblC、cblD、cblF型，cblA、cblB型部分有效。其中cblC型患儿最常见。主要表现为巨幼红细胞性贫血、生长障碍即神经系统症状。其中早发型多于1岁内起病，迟发型多在4岁以后出现症状，可合并多系统损伤[49-50]。cblD型患儿发病较晚，无血液系统异常表现。VitB12无效型：是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由于变位酶缺陷引起。出生时可无临床表现，迅速进展为嗜睡、呕吐并有脱水，继而出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下并发脑病[49-52]。Mut0型患儿比其他类型更早出现症。状，尤其是神经系统损伤， 80%出生第一周发病，且症状较严重，预后较差[50-53]。

MMA患者在若患者出现发热、呕吐、腹泻、感染、外伤等急性应激症状时，而这些急性症状使人体内对各种能量需求明显增多，各种分解代谢增多，致病性代谢产物生成增多。

Mut型的甲基丙二酸血症患者的临床表现：1. 新生儿期患者即可出现不同程度的酮症酸中毒、嗜睡、反复呕吐，生长发育迟滞，如果不能进行及时并准确的诊疗，容易导致患者早期死亡[54]。2.即使患者在新生儿期已被及时发现、确诊，并给予饮食疗法，患者仍然很容易受到严重的代谢失代偿威胁，严重时危及生命。3.该疾病长期高甲基丙二酸尿症的慢性炎症刺激，易导致难以恢复的并发症，如进行性肾脏功能衰竭、代谢性酸中毒、代谢性脑卒中、心肌炎[55-57]及其他不同程度的神经系统症状。

cblF型甲基丙二酸血症患者临床表现，从至今发现的12例确诊患者中可见

[58]

，其中4例（33.3%）是小于胎龄儿（small for gestational age, SGA ，即指出

生体重在相同胎龄平均体重的第10个百分位以下的婴儿）；3例在婴儿期即存在喂养困难；6例未能成长，死于3岁以内，5例从轻度到重度等不同程度的生长及智力发育迟滞。大多数生后两周出现口腔炎、肌张力低下和面部畸形，部分有血细胞形态异常。有报道[59]提示此型存在先天性心脏病，目前尚不能明确cblF型甲基丙二酸血症是否与先天性心脏病并存且继发于非此疾病或相关cblF。

甲基丙二酸血症的主要的并发症：发育延迟（包括生长发育及智力发育），肾小管间质肾炎进展性肾功能衰竭、急性基底节受累和慢性代谢病、运动障碍与舞蹈手足徐动症、癫痫、肌张力障碍和对/四肢瘫痪，肝功能损失、胰腺炎，免疫功能受损、视神经萎缩。

5 辅助检测

甲基丙二酸血症的全面的诊断方法包括[60]：代谢产物的串联质谱、有机酸分析与气相色谱法、酶的研究与成纤维细胞培养、基因突变分析。随着生化技术和酶法及基因测序的发展，MMA患者可以通过以上的方法得到准确的诊断，而诊断的诊断和遗传方式的了解对患者的持续性的和前瞻性的治疗起到关键作用，并对患者父母再生育及自身生育提供有效的遗传咨询指导。

5.1 实验室检查

常规实验室检查：1.血常规：cblC病提示不同程度的巨幼红细胞性贫血。2.低碳酸氢根水平：新生儿＜17 mmol/L；婴儿＜22 mmol/L；3.尿酮、血氨水平：新生儿＞150μg/L；婴幼儿＞70μg/L；儿童及成年人＞35–50μg/dL；4.血糖水平：婴儿＜40mg /ml；儿童＜60mg /ml；5.绝对中性粒细胞计数＜1500 /m3 。

5.2 MS/MS和色谱/质谱（GC / MS）

MS/MS技术对脂肪酸代谢紊乱性疾病的诊断较气相色谱质谱联用仪（GC/MS）有更大的优点，但鉴别MMA和PS疾病时需要进一步采用GC/MS, 检测尿液中有机酸才能进行鉴别。所以在遗传性代谢病诊断方面，MS/MS,与GC/MS两者结合十分重要，通过两者互补，使诊断更为可靠，酶学测定和分子生物学技术的联合应用也十分重要[61-62]。

MS/MS：即血串联质谱，MMA患者血丙酰肉碱（C3，参考值0.5-4umol/L）及C3/C2（乙酰肉碱，参考值＜0.25）比值增高，部分MMA伴同型半胱氨酸血症患者血蛋氨酸水平降低。

甲基丙二酸血症明确诊断必需基于尿液有机酸分析，采用气相色谱/质谱（GC / MS）方法[63]：有机酸可以用任何体液来测量，但尿液是确定代谢产物紊乱类型最有效的方法，测定尿液中有机酸和甘氨酸结合物MMA的诊断和随访的关键。原则上说需要收集24小时的总尿液，然后检测，但是新生儿及婴幼儿

等收集24小时尿液不切实际，故最好收集晨起第一次的尿液送检，空腹或代谢失代偿时期收集的尿液标本最有价值，因为此时的代谢旺盛，能够拍出选择性或高浓度的代谢产物[64]。MMA患者含有相对高浓度的甲基丙二酸和甲基枸橼酸代谢产物。但需要排除以下可以增加有机酸排泄的情况：首先，一些代谢产物的非特异性排泄，如药物药物治疗、饮食、非IEM疾病或生理条件；其次，细菌的代谢：内源性来源，如肠道感染，是甲基丙二酸二乙酯、苯乙酸、乳酸、丙乳酸、戊二酸、苯甲酸的异常分泌。甲基丙二酸血症血浆氨基酸测定，提示存在高甘氨酸，此外，血浆同型半胱氨酸能够识别MMA的基因类型。

尿液有机酸分析和血浆同型半胱氨酸测定后，患者按下列标准之一诊断[65]：（a）尿液中具有非常高浓度的甲基丙二酸的患者，但血浆中的同型半胱氨酸正常，提示mut基因突变（即mut0或mut-），维生素B12代谢异常分型中的cblA、cblB亚型。酶法分析其亚型或行分子诊断进一步确诊。而分子诊断对患者及家系均行基因检测，了解患者患病的遗传方式，对患者的持续性的和前瞻性的治疗起到关键作用，并对患者父母再生育及自身生育提供有效的遗传咨询指导[66]。（b）尿液中轻度升高的甲基丙二酸，但血浆中同型半胱氨酸正常的患者，基因突变的类型常见的是MCEE、SUCLA2良性MMA的亚型。（c）血浆中同型半胱氨酸级尿液中甲基丙二酸浓度同时异常高的患者，基因突变类型常见的是cblC、cblF或 cblD亚型。

5.3 头颅CT/MRI

报道中头颅MRI提示脑室髓鞘异常突出、皮质萎缩、脑沟扩大、脑室周围白质异常、基底神经节的变化（钙化、萎缩和坏死）、小脑萎缩、皮质下白质的变化、胼胝体细化，尤其皮质萎缩、脑沟扩大多见。新生儿早期发病者在头颅CT上显示常有基底节（苍白球、双侧壳核）钙化[67-69]。

5.4 分子遗传学检测--基因检测

通常所说的产前基因诊断其步骤是先对先证者进行基因测序，并且对先证者突变基因的来源进行详细的分析，然后再对先证者的父母进行该疾病的基因测序，判定先证者的突变基因是否来自于其父母，确定其是否符合孟德尔遗传规律，然后于再次妊娠时对胎儿进行基因测序来根据结果做出产前诊断。

一代测序，也叫Sanger测序[70]，其原理是主要对模板（样本DNA）中选取一段作为测序的目标范围，这一段一般长度在200-1000bp（一个bp就是一个碱基的意思）之间，因为这个长度是一代测序反应比较合适的范围。Sanger测序因其准确率相对较高，测序的DNA样本的片段（PCR）产物较为纯净时，号称准确率可以达到99.999%，故其作为基因诊断的金标准，但其又存在弊端，如通量低（通量最高的一代测序仪ABI3700XL，可同时检查一个96个样本，每个样本最长可以检测1kbp，每次开机最多可检测100k的碱基，而1个基因的完整序列（包括内含子和外显子）长度大约是60k，检测次数增多）、成本高、灵敏度低（对简单的纯和或杂合的孟德尔遗传的变异较灵敏，但对检测样本中丰度较低的变异，比如体细胞嵌合体、肿瘤体细胞变异、线粒体DNA中的低丰度变异，灵敏度较差）。

二代测序的诞生，是对基因测序技术的重大变革，催生了人类的精准医疗时代。二代测序[71]一般测序长度是在75-150bp之间，如果从两端同时读可以最多检测300bp，其原理是样本取出了基因组DNA以后，要打断成200-400bp的碎片，然后对这些碎片进行分子生物学的修饰，并连接通过接头和引物进行扩增，再上机测序。二代测序具有测序通量高、成本低，若加大测序深度（即目标序列总共反复测了多少遍，测序深度越深，就越可以重复比对从而过滤掉测序错误，使其准确性越高），可以解决其准确率的问题，增高其准确率。

6 治疗

甲基丙二酸血症早期发现和预防重症酮症酸中毒发作是决定预后的关键，酮症酸中毒反复发作会引起生长发育落后、智力低下、早期能开展饮食疗法和药物治疗可改善预后[72]。

目前治疗以药物为主，急性期管理的治疗以及预后：早期及时发现和预防重症酮症酸中毒发作是决定预后的关键所在，酮症酸中毒反复发作会引起患者的生长发育落后、智力的低下，早期诊断病及时能够开展饮食疗法和药物治疗可以改善该疾病的预后[73]。

6.1 甲基丙二酸血症急性期的治疗方案

急性期[74-77]：1.输液疗法：纠正酸中毒症状。2.维生素治疗疗法：只要怀疑，就应该于确诊期间就及时先给以静脉滴注水溶性维生素B1:100-200mg/day、B2:100-300mg/day、B12（羟基型或氰钴维生素）：1-2mg/day、生物素：5-20mg/day。3.肉碱治疗疗法：可以静脉注射，剂量为200-300mg/kg/day；也可以应用口服的左旋肉碱，剂量为100-150mg/kg/day。4.血液透析：不管是治疗如何，如果出现严重的代谢性酸中毒或高氨血症，并且不能及时有效的改善的情况下，迅速开始进行血液透析和持续过滤透析。5.输血、GCSF疗法：若出现严重的贫血或中性粒细胞减少时给予对症成分输血或粒细胞集落刺激因子应用。6.补充氨基酸疗法：患者脱离急性期后，可以考虑增加人体所需氨基酸液体，起始的剂量可以为0.5g/kg/day，最高可达到0.8-1.0g/kg/day。同时定期行血液中氨基酸分析，注意要保持异亮氨基酸的浓度不得低于正常范围的下限值，血液中氨基酸分析的定期监测，要在专业医生的指导下进行。如果能够经口摄入或下胃管营养的情况下可以逐渐减少氨基酸剂量，直至停止应用。7.维生素B12依赖性的甲基丙二酸血症的治疗方案：维生素B12制剂10-40mg/day口服应用。

6.2 甲基丙二酸血症慢性期的治疗方案

慢性期[72.74-76]：1.饮食疗法：脱离甲基丙二酸血症急性期后，患者若能够进行进行的情况下开始饮食疗法。饮食疗法原则上要限制能够产生甲基丙二酸的支链氨基酸的摄入，避免自身分解状态。天然蛋白质的摄取从奶粉或母乳中摄入，开始可以0.5g/kg/day。根据血气、血氨等各种生化检查结果调整剂量，达到总的蛋白摄入量为婴儿期剂量为2.0 g/kg/day、幼儿期剂量为1.5-1.8 g/kg/day，学童期剂量以降至1.0-1.2 g/kg/day。2.肉碱治疗疗法：口服左旋肉碱50-150mg/kg/day，以保证血液中游离的肉碱浓度能够达到50nmol/ml以上。3.抗菌素治疗疗法：为了能够抑制肠道细菌活性，给予口服灭滴灵10mg/kg/day。但是为了防止频繁抗生素应用产生耐药性，可以用4休3。

6.3 甲基丙二酸血症的长期管理治疗方案

长期管理[74-78]：1.患者身体不适时的管理：若患者出现发热、呕吐、腹泻等急性症状时，而这些急性症状使人体内的各种分解代谢增快、增多。2.给予指导家属注意：若患者出现发热、呕吐、腹泻等急性症状并且不能保证其有足量的

饮食摄入时应及时与主治医生联系；并及时在家做尿酮体检测，如果出现阳性表现应该立即就诊。根据尿酮和血气等检查结果提示，补充适当的葡糖糖及碳酸氢钠液体。3.合并症的治疗：（1）神经合并症：精神运动发育迟缓和癫痫是最常见合并症，若出现这种情况，就需要及时定期就诊，定期给予脑电图和头颅MRI以及智力检查，给以适当的处置，还有脑瘫、锥体外系运动障碍、共济失调等脑病症状出现。（2）肾功能异常：甲基丙二酸血症的患者若没有得到及时的对症治疗，随年龄的增加血液中受累的氨基酸进行性增高，并超过肾阈值时，随尿液排泄出体外。代谢障碍过程中产生的多余的有机酸经肾脏排泄，对肾脏是一种长期慢性的炎症刺激，肾功能损害逐渐加重，故保守药物治疗法、透析疗法、以及肾移植治疗都需要考虑。（3）胰腺炎治疗：有病例报告代谢性酸中毒发作时会伴有淀粉酶增高，故若出现胰腺炎症状时应及时对症处理。4.器官移植疗法：（1）肝移植：对于重症的患者需要考虑肝移植治疗。移植手术最好能够在出现肾功能损害之前也就是乳儿期就实施为好。（2）肾移植：适用于出现肾功能衰竭的患者，但移植后的肾脏功能的远期预后情况尚不明确。

Mut0的突变形式是维生素B12治疗无效的，预后最差。

CblF的治疗，Gailus S等[79]人文献报道静脉VitB12治疗并加入甜菜碱后，克服可缺陷溶酶体钴胺素的出口，致使蛋氨酸血浆水平达到正常化。然而，迄今为止，没有证据表明在CBLF型甲基丙二酸血症患者的治疗中溶酶体钴胺素存储情况。此外，不能明确维生素B12是否足以穿过血脑屏障，在脑内进行代谢。这可能是由于肠外羟钴胺治疗无效的纠正，导致此并患者运动及智力发育延迟。

7 预后

甲基丙二酸血症的长期预后是由该疾病的分型、发病年龄、诊断及有效治疗年龄、治疗的有效程度及患者治疗过程中的依从性共同决定的。Mut型甲基丙二酸血症患者因基因突变导致代谢过程中所需的MCM缺陷，维生素B12治疗无效，预后较差[80]。CblC型甲基丙二酸血症患者维生素B12治疗有效，并可长期正常存活，预后较好。患者发病年龄越小，症状越严重时，预后越差[80]。所有的甲基丙二酸血症患者，尤其是早发型患者，均存在不同程度的中枢神经系统症状，如生长发育迟滞、精神发育迟滞、癫痫。甲基丙二酸血症的主要的远

期并发症：发育延迟（包括生长发育及智力发育），肾小管间质肾炎进展性肾功能衰竭、急性基底节受累和慢性代谢病、运动障碍与舞蹈手足徐动症、癫痫、肌张力障碍和对/四肢瘫痪，肝功能损失、胰腺炎，免疫功能受损、视神经萎缩。故早期发现、早期确诊、早期治疗能够改善甲基丙二酸血症患者的预后。

8 展望

到目前为止甲基丙二酸血症一起肾脏疾病的性质尚不明确，在MMA疾病的早期阶段缺乏特定的生物学标志物和肾脏活检的研究报道。未来在甲基丙二酸血症疾病中仔细的临床描述结合肾脏活检的详细研究是必要的，借以了解肾脏破坏的起源。

维生素B12治疗无效同时饮食控制不佳的的患者，因疾病的发展造成体内代谢紊乱，为了提高患者体内酶的活性，可以给予器官移植，如肝脏移植[81-82]、肾脏移植或肝-肾联合移植[83]，并且已应用于亚型的治疗。虽然实体器官移移植的受者移植后外周代谢不能改善并校正，但提高了患者的生长发育和代谢危机的保护间歇期。这一结果表明，基因和细胞疗法在甲基丙二酸血症患者中对肝脏的治疗作用[83]。有文献报道研究表明单纯肝脏移植不能改善患者神经系统后遗症的发生和进展。未来甲基丙二酸血症患者主要了解及研究器官移植后的病情改善、远期预后、器官移植后的存活率。

随着科学技术及分子遗传学的发展，甲基丙二酸血症作为单基因性的有机酸遗传病，基因治疗可以从根本上进行治疗。目前已有实验研究应用重组基因的腺病毒成功治疗甲基丙二酸血症的小鼠[84]。目前由于实验室的条件有限及人文伦理的影响，未来在治疗人类甲基丙二酸血症的基因治疗方面将面临重大的挑战。

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