A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA双链复制 C．PCR的主要过程包括变性、退火、延伸 D．PCR扩增中不需要使用热稳定DNA聚合酶 【答案】D 【解析】
试题分析：PCR技术扩增DNA时，热稳定DNA聚合酶是必须的。 考点：本题考查PCR技术知识，意在考查知识的识记。
2．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液 （Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是
【答案】B 【解析】 【分析】
PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因。9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株。 【详解】
A、PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A正确； B、3号PCR结果包含250～500bp片段，应包含目的基因，B错误； C、9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；
D、10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的
电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。 故选B。
3．PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸
A．PCR产物的分子大小在250至500bp之间 B．3号样品为不含目的基因的载体DNA C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是( )
第1页 共32页 ◎ 第2页 共32页
A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 【答案】B
【解析】PCR中解旋是通过高温进行的，故甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用，A正确；丙过程用到的酶为耐高温的DNA聚合酶，在高温下不会失活，因此在PCR扩增时不需要再添加，B错误；如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，形成的DNA分子为8个，而含有15N标记的DNA分子为2个，故在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%，C正确；PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变，D正确。
4．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（ ）
A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B．设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连 C．退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 【答案】D 【解析】
用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物（两种），但不必知道基因的全部序列，A正确；设计引物时，需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，B正确；退火的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此退火温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有
第3页 共32页 ◎ 第4页 共32页
引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为14/16＝7/8，D错误。
5．通过设计引物，PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。图引物1序列中含有一个碱基T不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5’端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是（ ）
PCR又称多聚酶链式反应，该反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，如提供：DNA模板、分别与两条模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】
引物1和引物2的5’端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点，有利于目的基因的定向插入，A错误；在PCR反应体系中还需加入脱氧核苷酸、Taq酶等，不需要加入解旋酶，PCR中利用热变性打开DNA双链，B错误；通过2轮复制后，可以获得以①链为模板合成的②链，经过第三轮复制，以②链为模板，引物1能与图中②链的3’端结合，形成两条链等长的突变基因，C正确；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA只有一个，
即以②链为模板合成的DNA分子，总DNA数目是23=8个，故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8，D错误。因此，本题答案选C。
A．引物中设计相同的限制酶识别位点有利于目的基因定向插入 B．在PCR反应体系中还需加入核苷酸、解旋酶、Taq酶等
C．第3轮PCR，引物1能与图中②链的3’端结合，形成两条链等长的突变基因
D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2 【答案】C 【解析】 【分析】
评卷人 得分 二、实验题
6．野生型果蝇为灰身、长翅。灰身基因（A）突变后出现黑身表型，长翅基因（B）突变后出现残翅表型。已知控制这两对性状的基因都位于常染色体上。用灰身长翅（P1）与黑身残翅（P2）两种果蝇进行的杂交实验结果如下：
第5页 共32页 ◎ 第6页 共32页
少，推测产生此结果的直接原因是______。
（5）取杂交实验二中的P1卵巢制成切片，染色后用显微镜观察处于减一分 ______现象，而取P2裂前期的卵母细胞，发现其中的一些染色体有联会和
精巢切片观察同一时期的精母细胞却通常观察不到此现象，因为______。
根据这两对基因的DNA序列分别设计一对PCR引物，对杂交实验一亲本、子代的基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果见图1．请回答问题：
【答案】一 AB和ab 增加
基因重组 P1亲本雌果蝇产生了4种卵细胞（AB、ab、Ab、aB），数量两两相等，其中ab多，Ab、aB少，而P2亲本雄果蝇只产生一种ab的精子 交 AB、叉 Y染色体与X染色体大小相差很多，同源区段很少 【解析】 【分析】
（1）根据杂交实验一与相关基因PCR产物电泳结果，推测两对等位基因应该位于______对同源染色体上，P1亲本产生配子的基因型是______。 （2）由图1的PCR结果可以推测：果蝇B→b的突变是由于B基因内碱基对的______（填“增加”或“减少”）所致。
（3）若对杂交实验二中的亲本、子代的基因组DNA再进行PCR扩增，亲本及亲本型子代扩增结果见图2．请将新组合表型果蝇的扩增条带图绘在图2中的横线上。______
（4）分析杂交实验二后代中出现4中表现型，这种变异类型属于______，F1出现的四种表现型是两多两少，且两两相等，其中亲本类型多，重组类型
根据图1和杂交实验一可知：杂交一的亲本和子代的基因组成为
AaBb×aabb→AaBb：aabb=1：1，推测两对等位基因位于一对同源染色体上，A和B再一条染色体上，ab在一条染色体上。 【详解】
（1）根据以上分析已知，两对等位基因位于一对同源染色体上，P1亲本产生配子的基因型是 AB和ab。
（2）由图1的PCR结果可知，B基因有600碱基对，而b基因有700碱基对，说明果蝇B→b的突变是由于B基因内碱基对的增加所致。
（3）图2说明杂交实验二中的亲本的亲本基因组成为AaBb和aabb，杂交实
第7页 共32页 ◎ 第8页 共32页
验二的F1出现的四种表现型是两多两少，且两两相等，其中亲本类型多，重组类型少，推测P1亲本雌果蝇产生了4种卵细胞（AB、ab、Ab、aB），数量两两相等，其中AB、ab多，Ab、aB少，而P2亲本雄果蝇只产生一种ab的精子，因此后代的基因组成为AaBb、aabb、Aabb、aaBb。新组合表型果蝇的扩
评卷人 得分 三、综合题
7．PCR是聚合酶链式反应简称，可以完成特定基因的体外复制，标准的PCR过程如下图，一次循环，DNA含量就增加一倍，下图为一次循环。
增条带如图所示：。
（4）杂交实验二后代中出现4种表现型，四种表现型是两多两少，且两两相等，其中亲本类型多，重组类型少，推测P1亲本雌果蝇产生了4种卵细胞（AB、ab、Ab、aB），数量两两相等，其中AB、ab多，Ab、aB少，而P2亲本雄果蝇只产生一种ab的精子，说明P1发生了交叉互换，这种变异类型属于基因重组。
（5）取杂交实验二中的P1卵巢制成切片，染色后用显微镜观察处于减一分裂前期的卵母细胞，发现其中的一些染色体有联会和交叉现象，而取P2精巢切片观察同一时期的精母细胞却通常观察不到此现象，因为Y染色体与X染色体大小相差很多，同源区段很少。 【点睛】
解答本题的关键是理解基因分离定律和自由组合定律的实质，学会应用配子法判断非等位基因的位置及遵循的遗传规律，分析DNA指纹判断基因突变的类型及相关个体的基因型，会出特定个体的DNA指纹，并根据测交后代的表现型比例推算交换率。
第9页 共32页 ◎ 第10页 共32页
（1）PCR中使双链DNA模板的形成单链DNA，需要加热，相当于在细胞内完成此过程中_________的作用。
（2）在合成互补子链过程中，一般不使用DNA聚合酶，而使用Taq酶，请你根据图解中有关信息确定最可能原因是Taq酶__________________。 （3）合成与模板互补的DNA链是以dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷酸）为原料，若用脱氧核糖核苷酸则不能形成互补的子链，dNTP可用简略用下图解表示。
推测：最终单个dNTP连接形成子代DNA链时，要断裂_____个磷酸键，并
同时为DNA链的形成提供______________。
（4）若要用PCR技术特异性地拷贝DNA分子上“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。经过一次循环后，产物如下图2所示。则经_________轮循环后，产物中出现如下图3所示DNA分子；此DNA分子共有__________个。
为DNA合成的原料。三磷酸脱氧核糖核苷酸水解过程中会释放大量的能量，可以为DNA合成提供能量。
（4）PCR中每次复制子链的合成是从引物结合的位置开始的，故第一次复制的产物如图2所示，设图2中所示DNA中的四条肽链从上到下依次命名为1、2、3、4，图3所示的DNA两条链从上到下依次为5和6，则第二次复制会形成4个DNA分子，其中2个如图2所示，另外2个DNA分别由26号链组成及3号链和5号链组成，第3次复制时，分别以5号链和号链和
6号链为模板合成的2个DNA分子双链等长，如图3所示。 【答案】解旋酶 在高温下也具有强的催化活性 2 能量 3 2 【解析】 【分析】
PCR可以实现体外快速扩增DNA分子，原理是DNA双链的复制，原料是四种游离的脱氧核苷酸，需要耐高温的DNA聚合酶。 【详解】
（1）PCR中通过加热破坏氢键，打开双链，在细胞内由解旋酶催化氢键打开。
（2）PCR需要在较高的温度下进行，普通的DNA聚合酶在高温环境中会失活，故需要用耐高温的DNA聚合酶处理。
（3）一个三磷酸脱氧核糖核苷酸含有3个磷酸，1个脱氧核糖和1个含氮碱基，需要打开2个磷酸键，脱去2个磷酸基团才能作为形成脱氧核苷酸，作
评卷人 得分 四、非选择题
8．聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学
技术，由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学回答下列问题：
第11页 共32页 ◎ 第12页 共32页
2、原理：DNA复制．
3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物． 4、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温
条件下氢键可自动解开。
（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链的复制，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有
（1）PCR是一项在生物____________复制特定DNA片段的核酸合成技术，它是利用__________的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈________方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有_____________。
（2）PCR技术每一轮扩增中，需要参与的引物有_______________种，引物的本质是________，PCR扩增中需要dATP、dTTP、dCTP、dGTP的参与，它们的作用是______。参与PCR扩增的酶是Tap酶，它与普通的DNA聚合酶相比，特点是____________。
n
【答案】 体外 DNA双链复制 指数（或2） 一段已知目的基因的
一段已知目的基因的核苷酸序列。
（2）PCR技术每一轮扩增中，需要不同的2种引物，引物的本质是链DNA，PCR扩增中需要dATP、dTTP、dCTP、dGTP的参与，提供能量和原料。参与PCR扩增的酶是Tap酶具有耐高温的特点。
【点睛】本题考查PCR技术的相关知识，对于此类试题，学生需对相关知识进行归纳总结，构建一定的知识网络，本题意在考查考生的识记能力和理解能力。
9．基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作性状。通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分。多重PCR是在一个PCR 反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR 技术。请回答：
（1）我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得_______、_______、延熟的转基因作物。
核苷酸序列 2 单链DNA（单链DNA或RNA） 提供能量和原料 耐高温
【解析】试题分析：解答本题需识记有关PCR技术的相关知识：
1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术．
第13页 共32页 ◎ 第14页 共32页
（2）引物是根据__________的一段核苷酸序列合成的，每种基因扩增需要一对引物的原因是__________________。下表是A、B、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要体现在___________________________。
引物1 A基因 引物2 引物1 B基因 引物2 引物1 C基因 引物2
（3）PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是______________。 （4）检测人员通过多重PCR技术确定农作物中 是否含有A、B、C三种转基因。将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图。
5′GCGTCATGATCGGCTCGATG3′ 5′AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC3′ 5′CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3′ 5′GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3′ 5′TGAATCCTGTTGCCGGTCTT3′ 据图分析：含有三种转基因的农作物是____，判断依据是____ 。 （5）与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是________________。 【答案】抗虫 抗逆 （已知）目的基因 DNA在加热后得到的两条单链作为PCR扩增的模板 序列不同，每一单链对应一条引物核苷酸的数目不同，序列不同且每对引物之间不能互补配对 使引物与模板链（或“单链”）相应序列互补结合 样品4 样品4PCR扩增后的结果与已知三种基因的电泳结果一致 一次检测效率高（可同时检测多种基因） 【解析】
本题考查PCR技术，意在考查考生理解相关知识的原理和方法，要求学生能根据PCR技术的原理和方法分析表格和图形，进行推理和判断并得出正确结论。
（1）Bt毒蛋白基因表达可提高农作物棉花抵抗棉铃虫的能力，鱼的抗冻蛋白基因表达可提高农作物的抗冻能力，控制果实成熟的基因表达可有利用果实延熟，故将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得抗虫、抗逆、延熟的转基因作物。
（2）PCR技术中，引物是根据（已知）目的基因的一段核苷酸序列合成的，
第15页 共32页 ◎ 第16页 共32页
5′GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3′ 每种基因扩增都需要一对引物（两种），其原因是DNA在加热后得到的两条单链作为PCR扩增的模板。根据表中A、B、C三种基因引物的碱基序列可知，引物的特异性主要体现在序列不同，每一单链对应一条引物核苷酸的数目不同，序列不同且每对引物之间不能互补配对。
PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是使引物与模板链（3）（或“单链”）相应序列互补结合，即复性。
（4）根据电泳结果可知，样品4的PCR扩增后的结果与已知三种基因的电泳结果一致，可知含有三种转基因的农作物是样品4。
（5）根据题意，多重PCR是在一个PCR 反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR 技术；可知与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是一次检测效率高（可同时检测多种基因）。
10．PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。回答下列有关该技术的知识：
（1）下图为PCR原理示意图，据图回答问题。
需要__________等条件。
（2）现有目的基因“X基因”，它是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示。
至少需要循环__________轮，图2所示的五种不同的DNA分子在产物中才都会出现。经4轮循环后，图中④所示的DNA分子数分别占DNA分子总数的比例为__________，从理论上推测，第四轮循环产物中不含有引物1的DNA片段所占的比例为__________。
【答案】扩增和获取目的基因 解旋（变性） DNA解旋酶 样品DNA的两条链为模板、引物、四种脱氧核苷酸、Taq酶 3 3/16 1/16
【解析】 【详解】
基因工程中，利用PCR技术来__________，PCR技术依据的原理是DNA的半保留复制，生物体内也能完成DNA的复制，但有所不同，图中A过程称为__________，在生物体内需要__________才能完成。图中B和C过程的完成
试题分析：PCR技术的过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。据图分析，图中A表示高温变
第17页 共32页 ◎ 第18页 共32页
性，B表示低温复性，C表示中温延伸。
（1）基因工程中，可以利用PCR技术扩增和获取目的基因；根据以上分析已知，A表示高温变性过程，即DNA分子在高温下的解旋过程，该过程在生物体内需要DNA解旋酶的催化；图中B和C过程表示复性和延伸的过程，即以DNA链为模板合成子代DNA的过程，该过程需要的条件有：样品DNA的两条链为模板、引物、四种脱氧核苷酸、Taq酶等。
（2）由图分析可知：X基因第1次复制得到两个两种DNA：①和②；X基因第2次复制得到四个四种DNA：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第3次复制得到八个五种DNA：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤，因此至少需要循环3轮，图2所示的五种不同的DNA分子在产物中才都会出现；X基因第4次复制得到16个五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤，因此经4轮循环后，图中④所示的DNA分子数分别占DNA分子总数的比例为3/16，从理论上推测，第四轮循环产物中不含有引物1的DNA片段所占的比例为1/16。
11．我国公布的禁止进境检疫的有害生物烟草环斑病毒(TRSV)是RNA病毒。检疫部门取烟草叶片进行该病毒的诊断和检测，将待测样品利用RTPCR技术(逆转录PCR，具有灵敏度高、特异性强的优势)扩增样品。下图1是RTPCR技术的过程示意图，图2是PCR扩增产物的电泳图。请回答下列问题：
(1) 图1过程①表示利用RNA获得cDNA，该过程需要________酶的参与，过程②需要加入________酶。
(2) 待测样品中RNA的提供者可能是________和________，也可能只是________。
(3) 图1过程①需要加入引物P2，该引物是依据________________的序列设计并生产的。过程②引物P2、P1都需加入，理由是__________________________。
(4) 已知图2中电泳带1是取自未感染的烟叶样品电泳结果，电泳带2是不同大小DNA的标准参照，据图分析可以得出的结论是________，理由是______________________________。
【答案】反转录 热稳定DNA聚合(Taq) 烟草(叶片) TRSV 烟草 TRSV蛋白外壳基因 DNA两条链的合成需要不同的引物 电泳带3对应的样品感染了TRSV 电泳带3和电泳带1相比出现了分子量大约是600 bp的DNA电泳带 【解析】
第19页 共32页 ◎ 第20页 共32页
【分析】
本题以图文结合为情境，考查学生对基因工程的基本操作程序等相关知识的识记和理解能力，以及获取信息、分析问题的能力。 【详解】
(1)图1中，过程①表示利用RNA获得cDNA的逆转录过程，该过程需要反转录酶的参与；过程②表示利用PCR技术扩增TRSV外壳蛋白基因cDNA的过程，需要加入热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)。
(2)由题意“检疫部门取烟草叶片进行该病毒的诊断和检测”可推知：待测样品中RNA的提供者可能是烟草和TRSV，也可能只是烟草。
(3)利用PCR技术扩增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据 这一序列合成引物。图1中，过程①的产物是TRSV外壳蛋白基因，因此加入的引物P2是依据TRSV蛋白外壳基因的序列设计并生产的。过程②在扩增TRSV蛋白外壳基因时，两条模板链的碱基序列不同，与这两条模板链结合的引物也不同，即DNA两条链的合成需要不同的引物，因此引物P2、P1都需加入。
(4)在图2中，已知电泳带2是不同大小DNA的标准参照，电泳带1是取自未感染的烟叶样品电泳结果，说明电泳带1对应的DNA只来自烟叶。对比分析电泳带1、2、3可知：电泳带3和电泳带1相比出现了分子量大约是600 bp的DNA电泳带，据此得出的结论是：电泳带3对应的样品感染了TRSV。 【点睛】
解答此题需识记并理解基因工程的基本操作程序，特别是利用PCR技术扩增目的基因的过程的相关知识。据此，以图1中的“箭头指向和文字信息”、
图2中的“3条电泳带对应的DNA的大小”为切入点，从中把握所蕴含的生物学信息。在此基础上结合题意对各问题进行分析解答。
12．真核生物基因中通常有内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。有人利用RT-PCR技术（mRNA逆转录为cDNA再进行PCR扩增)，获得了牛的G基因，导入到大肠杆菌中，成功表达出G蛋白（一种免疫蛋白）。请回答下列问题：
（1）RT-PCR过程需要的酶有_____________；在进行PCR扩增时需要设计_________种引物。
（2）RT-PCR的产物经过BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，与经过同样双酶切得到的PBV载体连接，该操作程序属于_________，也是基因工程的核心步骤。与单一酶切相比，双酶切具有的优点是________________（答出两点）。 （3）若要检测G基因是否翻译出G蛋白，可采用的分子水平的检测方法是_________________。
（4）有人从牛的基因组文库中获得了G基因，同样以大肠杆菌作为受体细胞却未得到G蛋白，其原因是________________。
【答案】 逆转录酶和Taq酶（热稳定的DNA聚合酶） 2 构建基因表达载体 防止目的基因（或载体）自身连接；防止目的基因与运载体反向连接 抗原—抗体杂交 从基因组文库获取的G基因有内含子，在大肠杆菌中，其转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出G蛋白 【解析】【分析】分析题文描述可知：本题综合考查学生对基因工程的基本操作程序，特别是基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定等相关知识
第21页 共32页 ◎ 第22页 共32页
的识记和理解能力。
【详解】(1) RT-PCR过程，首先是以mRNA为模板逆转录为cDNA，此时需要逆转录酶参与催化；其次是将cDNA进行PCR扩增，在扩增过程中不开Taq酶（热稳定的DNA聚合酶）的催化。在进行PCR扩增时需要设计2种引物，以便分别与两条DNA模板链结合。
(2) 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤。与单一酶切相比，双酶切具有的优点是：防止目的基因或载体自身连接；
防止目的基因与载体反向连接。
(3)若要检测G基因是否翻译出G蛋白，可采用抗原—抗体杂交技术。 (4)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有内含子；牛为真核生物，大肠杆菌属于原核生物；原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。可见，从牛的基因组文库中获得的G基因有内含子，在大肠杆菌中，其转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出G蛋白，因此以大肠杆菌作为受体细胞时未能得到G蛋白。 【点睛】本题的难点在于对（4）题的解答，其关键在于从题意中提取有效信息，即真核生物基因中通常有内含子，原核生物基因中没有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。在此基础上，从牛和大肠杆菌的基因结构入手，分析从牛的基因组文库中获得的G基因，将其导入大肠杆菌细胞中却未能得到G蛋白的原因。
13．萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。
（1）研究者用相同的_________酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到重组质粒，再将重组质粒置于经_________处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌。
（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。 ①这是一种定点的_________技术。
第23页 共32页 ◎ 第24页 共32页
②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。 PCR1 PCR2 PCR3 PCR4
（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和_________分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用_________方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效率是否提高。为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较_________的大小，以确定表达产物的生物活性大小。 （4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是_________。 【答案】 限制酶和DNA连接 CaCl2 基因突变
引物A 引物B 引物C 引物D 空质粒（pET质粒） 抗原-抗体杂交 抑菌圈 对人、畜、农作物和自然环境安全；不会造成基因污染；有效成分纯度较高
【解析】试题分析：本题主要考查基因工程的工具、基本过程的四个步骤、PCR技术等，回忆相关知识点，根据题干据图分析答题。
（1）在基因工程中，利用相同的限制酶和DNA连接酶处理蛋白A基因和pET
质粒，得到重组质粒；大肠杆菌作为受体细胞，需要用氯化钙处理，以便重组质粒的导入。
（2）①根据题意和图示分析，经过4次PCR技术后获得了新的基因，这是一种定点的基因突变技术。
②与研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），因此4次PCR应该分别选择如图所示的引物：
。
（3）将含有新蛋白A基因的重组质粒和含有蛋白A基因的重组质粒、空质粒（pET质粒）分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用抗原-抗体杂交方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效
含有蛋白A基因的重组质粒、
率是否提高。为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较抑菌圈的大小，以确定表达产物的生物活性大小。
第25页 共32页 ◎ 第26页 共32页
（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，是因为蛋白A基因的发酵产物对人、畜、农作物和自然环境安全；不会造成基因污染；有效成分纯度较高。
14．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
与模板之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
【答案】 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 GC含量高 ②③ 【解析】试题分析：图中代表
PCR技术流程，步骤1代表
模板DNA在94℃的高温下变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（1）引物的作用是作为DNA复制的起点，由于目的基因前端插入了引物，所以在构建重组质粒时，要在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的酶切位点，保证目的基因完整地插入到重组质粒中；设计引物时要注意避免引物之间碱基互补配对，形成环状DNA，使其无法插入
（1）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
（2）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（3）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物
重组质粒中。
（2）步骤1所示模板DNA在94℃的高温下变性，使DNA断开双链结构。
（3）PCR的退火过程中，进行的是引物与模板链的结合，
第27页 共32页 ◎ 第28页 共32页
如果温度过高，会破坏引物与模板链之间的碱基配对；由于碱基之间是以氢键连接的，碱基A与T之间以两个氢键连接，碱基C与G之间以三个氢键连接，相比之下C与G之间稳定性更高，所以长度相同但碱基G与C含量高的引物需要设定更高的退火温度。
（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则说明退火过程出现问题，由于退火温度过高导致引物与模板链无法结合，或是由于引物设计的不合理，使其无法和模板链互补结合。
【点睛】本题关键需要读懂图中PCR技术流程，进一步才能合理分析作答。
15．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示：
物A等。
(2)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是__________________、_______________。
(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要_________个引物B。
(4)利用RT－PCR技术获取的目的基因_______________ (填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是_______。
(5)RT－PCR过程中主要借助对__________的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
【答案】RNA提取物 逆转录酶 让逆转录酶变性失活 使mRNA－cDNA杂合双链解开 2
n－1
能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的
数量(或浓度)，便于检测 温度 【解析】 【分析】
对题图进行分析可知，过程Ⅰ以mRNA为模板合成cDNA的过程，表示逆转录。过程Ⅰ的产物是cDNA，cDNA与mRNA形成杂合双链。过程Ⅱ首先将mRNA－cDNA杂合双链解开，再以单链cDNA为模板合成双链DNA，最后
利用PCR技术进行大量扩增。 【详解】
(1)过程Ⅰ以mRNA为模板合成cDNA的过程，表示逆转录，需要加入缓冲
(1)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、_____________、_______________和引
液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。
第29页 共32页 ◎ 第30页 共32页
(2)过程Ⅰ以mRNA为模板合成cDNA，形成cDNA-mRNA杂合双链。因此，过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，使mRNA－cDNA杂合双链解开，同时让逆转录酶变性失活。
(3)根据DNA分子半保留复制的特点，对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要2n-1个引物B。
(4)不同生物体内DNA分子的基本结构相同，且所有的生物共用一套密码子，因此利用RT－PCR技术获取的目的基因能在物种之间交流。利用该技术增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测。
(5)RT－PCR过程中主要借助对温度的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。 【点睛】
准确判断题图中过程Ⅰ、Ⅱ代表的生理过程，结合PCR过程进行解答。
第31页 共32页 ◎第32页 共32页
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容