金属离子对马铃薯多酚氧化酶活力的影响

第４９卷第４期　厦门大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．４９　ＮＯ．４　２０１０年７月　ＪｕＬ　２Ｏ１Ｏ　金属离子对马铃薯多酚氧化酶活力的影响　林庆同，王　伟　，杨美花，黄　浩，石　艳“　（厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建厦门３６１００５）　摘要：以马铃薯多酚氧化酶为对象，研究金属离子对该酶活性的影响．实验结果表明．Ｌｉ　、Ｋ　、Ｂａ　和Ｍｅ　对酶活力　几乎没有影响，Ｃａ。　和Ｎａ　对酶活力有微弱的抑制作用，Ｃｕ　叶。则表现出较强烈的抑制作用，其Ｊｃ５ｏ为０．２４８　ｍｍｏｌ／Ｌ．　Ａｌ”、Ｆｅ３＋、Ｃｄ”、Ｃｏ”、Ｍｎ　和Ｚｎｚ　则对马铃薯多酚氧化酶有不同程度的激活作用。本研究为探讨多酚氧化酶的催化　活性和催化机理提供理论基础．　关键词：马铃薯；多酚氧化酶；金属离子；酶活力　中图分类号：Ｑ　３５６．１　文献标识码：Ａ　文章编号：０４３８—０４７９（２０１０）０４—０５６１—０３　多酚氧化酶（ＥＣ　１．１４．１８．１，ＰＰＯ）是广泛存在于　生物体内的含铜氧化还原酶Ｌ１］．在植物中，当组织受　损，ＰＰＯ会与酚类底物接触并发生催化作用，羟化单　酚为双酚，进一步氧化双酚为醌，醌自发集合且和细胞　１．２　金属离子对酶活力影响的测定　参照文献［５］的方法，３Ｏ℃下在２　ｍＬ磷酸缓冲　液（ｐＨ　６．８）的测试体系（０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ—ＤＯＰＡ，不　同浓度的金属离子）中加入０．１　ｍＬ酶液，监测波长　内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐　色的物质，导致组织酶促褐变［２］，因此，ＰＰＯ是引起褐　变的关键酶．褐变不但会影响产品的色泽和味道，而且　为４７５　ｎｍ（消光系数ｅ＝３　７００　Ｌ／（ｍｏ１．ｃｍ））Ｌ５　的光　密度值随时间的增长直线，从直线斜率求得酶活力．　使用仪器为Ｂｅｃｋｍａｎ　ＤＵ　６５０分光光度计．以不含效　因为醌类物质会与蛋白质的一些侧链基团（如一ＳＨ，　～ＮＨ　等）结合使蛋白质的结构、营养特征发生改变　应物反应体系为对照，计算酶在各种金属离子存在下　的相对活力．各实验均重复３次取平均值，酶活力单　位（Ｕ）定义为在该条件下，每分钟催化Ｌ－ＤＯＰＡ氧化　产生１　ｍｍｏｌ／Ｌ产物的酶量．　而降低营养价值［３３．防止褐变是果蔬等农产品加工需　要解决的主要问题，本文以茄科植物马铃薯作为研究　对象，探讨金属离子对马铃薯ＰＰ０活力的调控，为防　止果蔬褐变提供理论基础．　２　结　果　２．１　Ｃｒ、Ｎｏ　和Ｓｏｊ一对马铃薯ＰＰｏ的影响　以ＫＣ１、ＫＮＯ。和Ｋ２ＳＯ　为效应物，测定它们对　马铃薯ＰＰＯ酶活力的影响．结果（图１）表明ＫＮＯ。和　Ｋ：Ｓｏ　对马铃薯ＰＰ０活力几乎没有影响，而ＫＣ１对　１材料与方法　１．１　材　料　马铃薯（无花种）由福建农林大学提供，马铃薯　ＰＰＯ的分离纯化按照文献［４］的方法进行，获得比活　力为ｌ　９２８　Ｕ／ｍｇ，纯化倍数为９．４的部分纯化的酶制　马铃薯ＰＰ０只有轻微的影响．这说明Ｃ】一、ＮＯ　和　Ｓｏ：一３种阴离子在一定的浓度范围内，对马铃薯ＰＰ０　剂．Ｌ一多巴（Ｌ—ＤＯＰＡ）为Ａｌｄｒｉｃｈ公司产品；其它试剂　为国产分析纯；使用的蒸馏水为去离子重蒸水．　活力没有影响．结果同时表明Ｋ　对酶的活力没有影　响．　２．２对马铃薯ＰＰｏ作用不明显的金属离子　以Ｌｉ。Ｓ０　、ＭｇＣ１　、ＢａＣ１。作为效应物，测定它们　收稿日期：２００９—１２—１７　对酶活力的影响，结果如图２，酶活力几乎不受这３种　基金项目：国家自然科学基金（３０５７０４０８）；福建省重点科技项目　（２００７Ｎ００５１）　效应物的影响，说明Ｌｉ　、Ｍｇ抖、Ｂａ抖对马铃薯ＰＰＯ　几乎没有影响或者影响很微小．　＊现工作单位；漳州师范学院生物科学与技术系　＊＊通讯作者：ｙｓｈｉ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ＣＤ　ＣａＣＩ。、ＮａｚＳＯ　对酶活力的影响见图３．结果表明　・５６２・　厦门大学学报（自然科学版）　２０１０矩　加　∞　舳　∞　∞　加　０　加　∞　舳　∞　∞　加　０　；　：ｌ　日　．三　ｃ／（ｍｍｏｌ　Ｌ　）　图ｌ　ＫＣ１、ＫＮＯ。和Ｋ２ＳＯ　对马铃薯ＰＰＯ活力的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＫＣ１，ＫＮＯ３　ａｎｄ　Ｋ２　ＳＯ４　Ｏｉｌ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ＰＰＯ　‘；　＝　日　．兰　ｃ／（ｍｍｏｌ・Ｌ。）　图２　ＬｉｚＳＯ　、ＭｇＣＩｚ和ＢａＣＩｚ对马铃薯ＰＰＯ活力的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｌｉ２　ＳＯ４，ＭｇＣ１２　ａｎｄ　ＢａＣ１２　Ｏｉｌ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ＰＰ０　＼　；　２　Ｕ　．兰　ｃ／（ｍｍｏｌ　Ｌ　）　图３　ＣａＣＩ２（ａ）和Ｎａ２ＳＯ　（ｂ）对马铃薯ＰＰＯ活力的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣａＣ１２（ａ）ａｎｄ　Ｎａ２　Ｓ（）４（ｂ）ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ＰＰＯ　Ｃａ　和Ｎａ　对马铃薯ＰＰＯ的抑制作用较弱，其中２．０　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ。　可以将马铃薯ＰＰＯ的活力降低约　２Ｏ　（图３中ａ）．而随着浓度增大Ｎａ　对马铃薯ＰＰＯ　的抑制强度变化不大（图３中ｂ）．　２．３　Ｃｕ　＋对马铃薯ＰＰＯ的影响　Ｃｕ。　对马铃薯ＰＰＯ活力的影响见图４．结果表明　￣／（ｍｍｏｌ・Ｌ’。）　图４　ＣｕＳ０　对马铃薯ＰＰＯ活力的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣｕＳＯ４　Ｏｉｌ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ＰＰＯ　随着ＣｕＳＯ　浓度增大，酶的活力逐步降低．２．１的结　果表明ＳＯ：一对马铃薯ＰＰＯ的活力没有影响，故在　ＣｕＳＯ　中起抑制作用的是Ｃｕ抖．导致酶活力下降　５０　所需的Ｃｕ。　浓度（Ｉｃｓ。）为０．２４８　ｍｍｏｌ／Ｌ．　２．４对马铃薯ＰＰＯ产生激活作用的金属离子　以ＦｅＣ１３、Ａ１Ｃ１３、ＣｄＣ１２、ＣｏＣ１２、ＺｎＣＩ２和ＭｎＣｌ２　作效应物，测定它们对酶活力的影响．结果如图５，　Ｃｏ。　对马铃薯ＰＰｏ具有明显的激活作用（图５ｄ），１６　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃｏ抖可以使酶活力激活约１００　．１　ｍｍｏｌ／　Ｌ的Ｚｎ。　（图５ｅ）可以将酶激活５Ｏ　以上．其它离子　的激活作用也较为明显，Ｃｄ抖、Ｆｅ什、Ｍｎ。　都可以在　浓度较低的情况下将酶激活约２０　，但激活程度有　限．Ａ１抖（图５ｂ）的激活能力较弱，１　ｍｍｏｌ／Ｌ时激活不　到１Ｏ　，７　ｍｍｏｌ／Ｌ时才激活约２Ｏ　．　３　讨　论　金属离子在酶的催化反应过程中起重要作用．金　属离子在酶催化反应中可能使底物直接结合到酶的活　性部位，或者通过可逆地改变金属离子的氧化态从而　调节氧化还原反应，或者通过静电稳定及屏蔽负电荷　等途径参与酶的催化［６］．由于ＰＰＯ是含铜的金属酶，　Ｃｕ抖在ＰＰＯ发挥作用的活性中心是必需的，因此浓　度低于０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃｕ　对菜青虫ＰＰＯ的作用表　现出激活作用　］．高浓度的Ｃｕ。　可导致酶活力的下　降，这与Ｃｕ。　对中国对虾ＰＰＯ以及菜青虫酚氧化　酶　］作用的研究结果一致，它的抑制效应可能是由于　Ｃｕ　能够与活性中心以外的基团结合，且作为重金属　离子，高浓度会使ＰＰＯ变性而达到抑制作用．Ｋ　、　Ｌｉ　、Ｍｇ抖、Ｂａ。　对马铃薯ＰＰＯ几乎没有影响．Ｋ　是　细胞内普遍存在的离子，它主要发挥调节渗透压等功　能．低浓度Ｎａ　对马铃薯ＰＰＯ的活性有很微弱　的抑制作用，随着Ｎａ　浓度的增加其抑制作用不会增　第４期　林庆同等：金属离子对马铃薯多酚氧化酶活力的影响　・５６３・　／＾ｌｌ＾弓日０＾ｌ１　Ｂｌｕ　／＾ｌｌ＾　∞Ｑ＾ｌ童０　／＾ｌｌ＾Ｉ１笔３＾焉　ｃ／（ｍｍｏｌ・Ｌ　）　ｃ／（ｍｍｏｌ・Ｌ‘。）　ｃ／（ｍｍｏｌ・Ｌ　）　图５金属离子对马铃薯ＰＰＯ活力的影响　ａ～ｆ分别代表ＦｅＣ１３．Ａ１Ｃ１。，ＣｄＣ１２，ＣｏＣ１ｚ，ＺｎＣ１２和ＭｎＣｌ２　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ＰＰＯ　强，而当Ｎａ　浓度大于１　ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｎａ　浓度变化对　于酶活力没有影响．Ｃｏ。　和Ｚｎ。　对马铃薯ＰＰＯ具有　［３］　Ｍａｔｈｅｉｓ　Ｇ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ　Ｊ　Ｒ．Ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｏｎｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．　Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｌ９８４，８：１３７一ｌ６２．　明显的激活作用，它们可能能够促进底物与酶活性中　心的亲和，进而有利于ＰＰＯ的催化反应，实现激活效　／＾ｌ１＾ｌｌ。　０＾ｌ兰ｕ　／＾ｌｌ＾ｌ１譬ｕ＾ＩｌＥＩＱ　应，而Ｃｄ。　和Ｍｎ抖在浓度较低的情况下激活ＰＰＯ可　能也是这样的原因，也可能因为这些金属离子的电子　［４３　黄浩，林敏，邱龙新，等．苯甲酸衍生物对马铃薯多酚氧化　酶的抑制作用ＥＪ］．厦门大学学报：自然科学版，２００６，４５　（４）：５６３－５６６．　［５］Ｃｈｅｎ　Ｑ　Ｘ，Ｓｏｎｇ　Ｋ　Ｋ，Ｗａｎｇ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　云排布中有空轨道而能与酶分子的一ＯＨ，一ＣＯＯＨ，　一ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｂｙ　ｓｏｍｅ　ａｌｋｙｌｂｅｎｚａＩｄｅｈｙｄｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１８：　４９１－４９６．　ＮＨ：等基团形成配位作用，导致酶活力有所增加．　Ｆｅ　、Ａｌ计对此类酶作用的研究不多，本研究结果显　示它们也有一定激活作用．　Ｅ６３王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学［Ｍ］．北京：高等教育　出版社，２００３．　参考文献：　［１］陈清西，宋康康．酪氨酸酶研究进展［Ｊ］．厦门大学学报：　自然科学版，２００６，４５（５）：７３１—７３７．　［７］薛超彬，王勤。柯莉娜，等．铜铁试剂对菜青虫多酚氧化酶　的抑制作用［Ｊ］．昆虫学报，２００５，４８（２）：２９０—２９４．　［８３薛超彬，王勤，贺量，等．金属离子对菜青虫酚氧化酶活力　的影响［Ｊ］．厦门大学学报：自然科学版，２００５，４４（Ｓｕｐ．）：　ｌ２Ｏ一１　２２．　Ｅ２］Ｐｒｏｔａ　Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｉｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｌ－Ｊ］．Ｍｅｄ　Ｒｅｓ　Ｒｅｖ，１９８８，８（４）：５２５—５５６．　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｏｍｅ　Ｍｅｔａｌ　Ｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｔａｔｏ　ＬＩＮ　Ｑｉｎｇ—ｔｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＹＡＮＧ　Ｍｅｉ—ｈｕａ，ＨＵＡＮＧ　Ｈａｏ，ＳＨＩ　Ｙａｎ”　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃｏａｓｔａｌ　ａｎｄ　Ｗｅｔｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｒｎｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。　Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ　３６１００５，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｗｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｏｔａｔｏＴｈｅ　ｒｅ—　．ｓｕｈｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｌｉ＋，Ｋ＋，Ｂａ。＋ａｎｄ　Ｍｇ　＋ｈａｄ　ｎｏ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａ。＋ａｎｄ　Ｎａ十ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｓｌｉｇｈｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＣｕ。＋ｃｏｕｌｄ　．ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　１Ｇ０　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔＯ　ｂｅ　０．２４８　ｍｍｏｌ／Ｌ．Ａｌ抖，Ｆｅ¨，Ｃｄ抖，Ｃｏ抖，Ｍｎ２＋ａｎｄ　Ｚｎ２＋ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ．Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｌａｉｄ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ。ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐｏｌｙ—　ｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ；ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ；ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ