高效液相色谱法测定水样中的苯酚

一、实验目的

1.1 熟悉HPLC仪器的各个部件及熟悉操作方法； 1.2 掌握应用高效液相色谱法对苯酚的定性、定量分析； 1.3 掌握水样中苯酚的测定。

二、实验原理

HPLC原理

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，如图1所示。

图1 液相色谱仪结构示意图及工作流程图

方法原理：在相同的色谱条件下，相同物质具有相同的保留时间，据此可对某物质进行定性分析；在一定浓度范围内，待测物质含量与仪器响应值呈线性关系，通过建立标准曲线，可实现对待测物质的定量分析。

三、仪器和试剂

1、仪器：

⑴岛津（SHIMADZU）LC-20A液相色谱仪：

①流动相：乙腈、MQ水（由铝箔纸包裹，防止其中产生藻类，堵塞进口）

②高压输液泵：并联式微体积柱塞往复泵 （ Prominence LIQUID CHROMATOGRAPH） 型号：LC-20AD

厂家：UFLC SHIMADZU

③色谱柱：固定相填充物：十八碳（C18） 型号：Intertsil ODS-SP

参数： 填充物粒径：5 μm 内径×长度：4.6×250 mm ④检测器：二极管阵列检测器（PDA） 型号：SPD-M20A 电压：230V 厂家：SHIMADZU

⑤脱气装置： 型号：DQO-20A5 ⑥进样装置：高压六通进样阀

两个状态： Load：样品进入六通阀，未入色谱柱 Inject：位于六通阀的样品进入色谱柱 种类：SIL-10A 、SIL-10Ai 、SIL-10ADVP

⑦淋洗液（洗针、洗阀）：甲醇 ⑵移液管 2 mL、5 mL各一支

⑶具塞离心管10 mL三支、1.5 mL一次性离心管一支

2. 试剂：甲醇（色谱纯）； 苯酚标准使用溶液（10 mg/L）

待测水样。

四、实验步骤 1 标准系列配制

取苯酚标准使用液0.50、1.00、2.00 mL于10 mL的具塞离心管中，用甲醇定容至5 mL，混匀。待测。 2 样品的制备

取水样约1 mL于1.5 mL一次性离心管中。待测。 3 色谱参数

色谱柱：C18 柱； 流动相：乙腈、水； 梯度洗脱程序： 洗脱时间 0:00 乙腈（%） 65 4:00 65 4:01 75 5:00 75 5:01 65 8:00 65 流速：1.0 mL/min； 柱温：室温； 进样量：20 μL；

检测器：二极管阵列检测器，检测波长280 nm 4 测定

测定标准系列，再测定样品。根据标准系列中苯酚的保留时间，定性确定样品中的目标物。

记录标准系列和样品中目标物的峰面积。

五、数据记录与计算

（1）标准系列c=4mg/mL的谱图及样品的谱图： 样品谱图（图2）中，三个明显高的峰的记录数据如下表

表1 样品的谱图中三个峰的特征数据

第一个峰 第二个峰 第三个峰

保留时间（t/min） 3.892 4.307 4.879

色谱峰面积/counts 22907 182.47 20567

色谱峰高/mAU 2928

mAU280nm,4nm (1.00)6.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5min图1 标准系列c=4mg/mL的谱图

mAU280nm,4nm (1.00)6.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5min3.773/666253.773/66625

图2 样品的谱图

2. 标准系列和样品中苯酚的保留时间、峰面积、峰高等实验数据： 表2 标准系列和样品中苯酚的谱图峰的特征数据

标准样品体积/mL 0.5 1.0 2.0

色谱峰面积

保留时间t/min

/counts 3.951 3.837 3.773 3.892

17640 34754 66625 22907

浓度

色谱峰高/mAU

/(mg/mL) 1209 2963 5258 2928

1.0 2.0 4.0 1.3

1 2 3

样品 －

六、思考题

1 液相色谱使用的注意事项；

答：流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)，气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器， C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗，更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中，更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

2 何谓梯度洗脱，有何特点；

答：梯度洗脱是采用两种(或多种)不同洗脱能能力的溶剂,在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式.当样品混合物中化合物的保留差异很大,用单一流动相等度洗脱时,分离时间太长,而且随保留值增大,后洗脱的色谱峰谱带变宽,使峰检测发生困难.有时甚至会发生部分化合物保留太强,不能洗脱下来,此时采用梯度洗脱.梯度洗脱一般用液相色脯装置来实现.高压梯度,低压梯度两种装置.

3 正相高效液相色谱与反相有何差别。

答：高效液相色谱法包括正相高效液相色谱法和反相高效液相色谱法。 正相高效液相色谱法中流动相的极性小于固定相的极性，也就是以及性键合相为固定相（常以氨基、氰基键合相等作为固定相）。

反相高效液相色谱法中流动相的极性大于固定相的极性，也就是以非极性键合相为固定相（常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作为固定相）。