《微生物学及实验》实验指导书
杨翔华 主编
辽宁石油化工大学环境与生物工程学院
第一部分 实验目的
《微生物学及实验》实验课是我院环境科学专业学生必修的一门重要的基础实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。
《微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的基本实验方法和技术，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中建立无菌概念和掌握无菌操作技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的基础。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技术的基本操作和技能训练，培养学生动手操作能力和创新能力。通过微生物学实验课教学，加深理解和巩固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的基本操作技术，了解微生物实验的基础知识。通过微生物学实验培养学生观察、思考、分析问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。
本实验指导书主要内容包括：微生物个体和菌落形态观察、染色方法、培养基制备和灭菌、无菌操作、微生物检测和分离、生理生化反应、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物分布调查等内容。同时也注意和环境微生物学的联系与区别。
整个实验课中贯穿了显微镜使用—灭菌方法—无菌操作—微生物菌种分离筛选鉴定、选育—微生物代谢作用这一主线。微生物学需掌握的基本操作在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学基本概念的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下： 序 号 实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六
实验名称
光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的观察
微生物的染色及观察 培养基的制备和灭菌
纯种微生物的分离、转种和培养 有机污染物质的生物降解实验* 双歧杆菌口服液的发酵制备*
学时 3 3 3 3 4 4
实验类型 基础验证性实
验 综合性 实验
*注：实验五为环境工程专业选做实验。
第二部分 微生物学实验室规则
微生物学实验的对象大多为环境微生物，其中某些微生物对人体具有危害性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：
1.进入实验室应先穿白大衣，离开实验室时要脱下白大衣，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。
2．进入实验室进行实验前应先洗手，避免手上的分秘物，食物油，护肤用品和沾染的微生物等对实验造成污染。
3．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声说笑或乱走乱串。
4．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须经消毒处理，禁止随意放于桌上或冲入水槽。
5．须送恒温生化培养箱培养的物品，应做好标记（标明姓名、编号、日期、培养时间）后送到指定地点。
6．实验过程中如发生意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。如有传染性、腐蚀性的材料污染桌面、地面等，应立即用0. 2%-0. 5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min或肥皂清洗后，再以自来水反复冲洗干净，必要时去卫生所或医院就医。
7．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。
8．实验完毕，应物归原处、将台面整理清洁，将实验室打扫干净。最后以肥皂洗手后方可离开实验室。
第三部分 实验内容
实验一 光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的观察
实验项目性质：基础验证实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：3学时
一、实验目的
1. 学习并掌握显微镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 3. 观察几种真核微生物的个体形态，掌握生物图的绘制方法。
二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有如下二方面的原因：
1. 增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=λ/2NA，式中λ= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4-0.7mm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：
NA=n×sinα
式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到1200，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0 和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA 都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55mm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4mm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2mm左右。
利用显微镜的放大原理观察视野中的各种生物，根据观察到的生物形态、运动方式、生物（细胞）结构初步判断所观察到的生物的种类。
三、实验器材
1. 菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）染色玻片标本、青霉（Penicillium sp.）的水封片等（教师可根据具体情况选用菌种）、活性污泥混合液。
2. 溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四、操作步骤
1. 观察前的准备
（1） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3-4cm 。镜检时姿势要端正。 取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。
（2） 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
（4） 聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。
2. 显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
低倍镜观察：
金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
高倍镜观察：
低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
油镜观察：
高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位
置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
（4）活性污泥观察
取一片干净的载玻片放在实验台上，用一支滴管吸取试管中藻类培养液于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上(注意不要有气泡)即成标本片。用低倍镜和高倍镜观察。
3. 显微镜用毕后的处理 （1） 上升镜筒，取下载玻片。
（2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（3） 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验报告
1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。同时注明物镜放大倍数和总放大率。
2.绘出活性污泥生物相观察中和各种微生物和菌胶团。
六、思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 2、试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
3、什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 4、影响显微镜分辨率的因素有哪些？
5、根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。 6、根据你观察到的活性污泥中的微生物种类，说明水质污泥情况。
实验二 微生物的染色及观察
实验项目性质：基础验证实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：3学时
一、细菌的简单染色法
1 实验目的
1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 1.2 掌握细菌的简单染色法。
1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 2 实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 3 材料
3.1 菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、面包酵母琼脂斜面培养物。实验教师可根据具体情况提供合适的菌种。
3.2 染色剂
吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 3.3 仪器或其他用具
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 4 流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。 5 步骤
5.1 涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
5.2 干燥
室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
5.3 固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 涂片、干燥和热固定。 5.4 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。
5.5 水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 5.6 干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 5.7 镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 6 结果
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。
二、革兰氏染色法
1 实验目的
1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 1.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 2 实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 3 材料
3.1 菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
3.2 染色剂
结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 3.3 仪器或其他用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 4 流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。 5 步骤
5.1 涂片 5.1.1 常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
5.2 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
5.3 媒染
用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。 5.4 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
5.5 复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
5.6 镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
5.7 实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干。
三、实验结果
1.根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
2.列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
四、思考题
1. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2. 进行革兰氏染色时，为什么强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 3. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
4. 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5. 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节? 6. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
7. 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
实验三 培养基的制备和灭菌
实验项目性质：基础验证实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：3学时
一、实验目的
1.了解并掌握培养基的配制、分装方法； 2.掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料
1、器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
2、药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
3、流程
称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
四、实验步骤
1 培养基的制备
1.1 称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
1.2 溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
1.3 调节pH
根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。
1.4 溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
1.5 过滤分装
分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
1.6 包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
1.7 灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
1.8 倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板。 2 灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
2.1 湿热灭菌
煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。
高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
2.2 操作方法和注意事项
加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。
排气：打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。
升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急
地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
2.2 干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
2.2.1 灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。
2.2.2 干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。 用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。
2.2.3 火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
五、实验结果
1、记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。 2、试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
六、思考题
1、制备培养基的一般程序是什么？
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？ 3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？ 4、试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。 5、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
实验四 纯种微生物的分离、转种和培养
实验项目性质：基础验证实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：3学时
一、 实验目的
1、了解微生物分离和纯化的原理； 2、掌握常用的分离纯化微生物的方法； 3、掌握菌落特征的观察；
4、学习掌握微生物的几种接种技术；
5、 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
三、实验材料
1 培养基和菌种
淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基，活性污泥混合液。普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2 溶液或试剂
10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3 仪器或其它用具
无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。
四、实验步骤
1、流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。 2、步骤
2.1稀释涂布平板法 2.1.1 倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
2.1.2 制备活性污泥混合液稀释液
称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的活性污泥混合液溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。
2.1.3 涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6，从三管活性污泥混合液稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
2.1.4 培养
将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。
2.1.5 观察并挑菌落
将培养后长出的单个菌落根据其大小、颜色、形状等特征进行观察，之后根据菌落不同特征分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2.2 平板划线分离法 2.2.1 倒平板
按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。 2.2.2 划线
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的活性污泥混合液悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
用接种环以无菌操作挑取活性污泥混合液悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第
四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
2.2.3 挑菌落
同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 3、常用四种接种方法操作指导：
斜面接种法：斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～50度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。
液体接种法：多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。
固体接种法：普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
穿刺接种法：此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。
五、实验结果
实验结果应该以所做涂布平板法和划线法较好地得到了单菌落为目的，如果不是，请分析其原因并重做。
六、思考题
1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？在平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
2、为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？
3、试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则?
4、以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 5、试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌。
实验五 有机污染物质的生物降解实验
实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：4学时
一、实验目的
1、掌握微生物在环境污染物降解中的原理和重要作用； 2、掌握污染物测定的测定方法。
二、实验原理
有机污染物广泛存在自然环境中，绝大多数污染物可以在微生物的作用下被降解，本实验以表面表面活性剂为模式有机污泥物进行生物降解实验。表面表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效成分，目前应用较多的是直链型烷基苯磺酸盐类(LAS)。环境中表面活性剂的消失几乎全靠微生物的作用，微生物通过其特殊的酶系的降解能力受到菌株类型、表面活性剂浓度及其他多种物理化学因素的影响。本实验应用一株由处理洗涤剂工业废水的塔式生物滤池中分离得到的LAS降解菌，考查不同起始浓度LAS对微生物降解度的影响。
三、器材与用品
1.菌种：气单胞菌D-4(Aeromonas sp．D-4，可由中国科学院水生生物研究所提供)；YM8菌株（由本实验中心在活性污染中分离）。
2.培养基
合成洗涤剂*（含LAS者）：0.02-0.12%；蛋白胨：0.5%；NaCl：0.5%；NH4NO3：0.5%；KH2PO4：0.1%；K2HPO4：0.1%；蒸馏水：100ml。调节pH至6.7-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
*分别配制四种含不同LAS浓度的培养液，使其LAS含量为40、120、180及240mg/L。可根据所采用的洗涤剂型号中LAS含量换算，再经实测（LAS测定见本实验“测定方法”项）。培养液分装于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS浓度标记清楚，121℃高压蒸汽灭菌20分钟备用。
3．美蓝溶液：称取100 mg美蓝溶于蒸馏水后稀释至100ml。移取该液30ml于1000ml容量瓶中，加 6.8ml分析纯浓H2SO4及50g NaH2PO4·2H2O, 用蒸馏水溶解后加入容量瓶并稀释至1000ml刻度处。
4．LAS标准溶液：称取纯LAS 0.5g(99.5%LA S标准品可由上海有机化学研究所提供)，溶于蒸馏水，稀释至500ml，此液LAS浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml,则LAS浓度为0.01mg/ml。
5．洗涤液：取6.8ml分析纯浓H2SO4及50g NaH2PO4·2H2O ,溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 6．恒温振荡器。
7．分光光度计(具波长652nm)。 8．离心机。
9．500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脱脂棉等。
四、方法和步骤
1．接种：取气菌株斜面菌种1支，以10ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。每瓶培养液中接入菌液1ml；每种LAS浓度接2瓶，另设1瓶不接种作对照。
2．培养：将接种与不接种之对照瓶置震荡器上，控制转速为170-220r/min，于32±1℃恒温震荡培养48小时。培养结实时,将培养液离心以除去菌体(8000r/min离心10分钟或4000r/min离
心30分钟)。离心后之上清液留作测定LAS用。
3．LAS测定：LAS和美蓝可生成蓝色化合物，并溶于氯仿等有机溶剂中。
(1)制备标准曲线：取0、2、5、10、15、20 ml LAS标准液(0.01mg/m1)分别稀释至100 ml制成不同浓度标准液。将标准液100ml装于250 m1分液漏斗中，用H2S04调节pH至微酸性，加美蓝液25ml。
① 氯仿提取：向上述分液漏斗中加氯仿10ml，猛烈振荡30秒钟，静置分层，将氯仿层排入另一个250m1分液漏斗中。如此提取三次。
② 洗涤：在上述接纳了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50ml洗涤液，猛烈振荡30秒钟，静置分层。将一小块脱脂棉塞入分液漏斗活塞下部以滤除水珠，分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至一个50 ml容量瓶中。
③ 再次提取：加氯仿6ml于上述②分液漏斗的水液中,振荡分层后将氯仿层并入上述②容量瓶中。如此提取三次。然后用氯仿将容量瓶中液体稀释至50 ml刻度处。
④ 测定LAS：用纯氯仿做空白对熙，用分光光度计固定波长为652nm，测定各标准液的光密度值(OD)。以光密度值作纵坐标，LAS的毫克数(LAS原标准液浓度0.01mg/ml×所取该液的ml数)作横坐标，制取标准曲线。并通过图解法求出标准曲线的斜率K。
(2)培养液测定：吸取离心后的培养液上清液1-10ml，放于250m1分液漏斗中，用蒸馏水稀释至100ml。以下步骤同绘制标准曲线时的步骤，测得样品的氯仿提取液之光密度值。按下式计算样品中LAS浓度。
LAS(mg/L)＝OD652×1000/（标准曲线斜率×水样体积）×100%
4．LAS降解度计算
D＝（C0－Ct）/C0×100%
D：降解度%
C0：振荡培养开始时的起始LAS浓度(mg/L) Ct:：振荡培养若干小时后的残留LAS浓度(mg/L)
如果未接菌液的空白对照液经培养后，LAS也有所减少，且其差值为C(mg/L)，则
D＝｛C0－(Ct+C)｝/C0×100%
五、实验结果及报告
将实验结果填入下表。
表 LAS起始浓度对微生物降解度的影响
起始LAS浓度（mg/L） 培养后残留LAS浓度 降解度（%） 40 接种 不接种 120 接种 不接种 接种 180 不接种 接种 240 不接种 六、思考题 1、实验结果说明了什么问题？
2、参考本实验设计一个污染物微生物降解实验（要求有污染物的测定方法）。
实验六 双歧杆菌酸口服液的发酵制备
实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：4学时
一、实验目的
1、学习分离和纯化菌株的方法； 2、学习营养口服液的制作方法及过程；
3、初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。
二、实验原理
双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态试剂的重要生产菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的pH值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。
与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但如果pH值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响，因此在含活菌的活性营养口服液中大多添加磷酸盐等缓冲物质，防止pH过分偏低，延长产品中活菌的保持期并保持其保健作用。
三、材料与方法
(一) 实验材料 1、菌种：
双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌由本实验室筛选，经权威部门鉴定符合生产和临床使用标准。 2、培养基：
2.1 改良TJA培养基（培养双歧杆菌用）：番茄汁50mL；酵母浸出物5g；肉膏lOg；乳糖20g；葡萄糖2g；K2HPO4 2g；Tween80 1g；醋酸钠2.5g；琼脂15g。
2.2 BL培养基（培养乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白胨15g；酵母浸膏6g；肝浸液45 mL；葡萄糖20g；可溶性淀粉0.5g； NaCl5g；Tween80 3ml；L-Cys 0.5 g；蒸馏水1000mL；pH7.2。
2.3 去脂TJA培养基：在改良TJA培养基配方的基础上减去琼脂。
2.4 发酵培养基(生产发酵液)：番茄汁1 ml；酵母浸出物1g；乳糖1g；葡萄糖1g；K2HPO4 0.1g；Tween80 0.1ml；3%豆粕浸汁100ml。灭菌温度在115℃，时间20min。 3、青春型双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌的发酵菌种：
试管斜面—→转种50 mL试管—→250mL三角瓶—→测定菌量、酸度和pH值。 液体接种量为3%，摇床振荡培养。 (二) 实验方法
1、菌株活化及发酵剂制作
(1) 倒平板培养基：将改良TJA培养基完全融化并冷却至45℃左右倒平板，冷凝待用。 (2) 分离纯化及活化: 用接种环分别在双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌斜面上挑取少许菌株作平板划线分离。分离后，放37℃下培养以获得单菌落。
(3) 观察菌落特征：经2-3天培养，待菌落长成后，应仔细观察并区别不同类型的菌，注意是否有污染。
青春型双歧杆菌在培养基平板表面常呈现的形态菌落特征: 大小为2-3mm, 菌落中央呈隆起状，边缘整齐，半透明状，有浓郁的醋酸味，染色镜检为短杆状。
乳酸菌在BL培养基平板表面常呈现三种形态特征的菌落: ①扁平型菌落:大小为2-3mm,边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为杆状；②半球状隆起菌落:大小为1-2mm,隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状；③礼帽形突起菌落:大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，也有酪蛋白透明圈，染色镜检也呈链球状。
(4) 挑取少许具有上述菌落特征和菌株，分别接入装有50ml去脂TJA培养基的试管中，37℃下培养至出现混浊时停止作发酵剂用，如果需用量大可改用发酵罐培养。 2、实验流程及注意事项:
2.1 实验流程
辅助原料 发酵剂 ↓ ↓
豆粕煮汁—→调配—→灌装—→高压灭菌—→混合接种—→发酵—→成品 2.2 注意事项
2.2.1煮汁时一定要控制在90--100℃，时间为1h，不时的搅拌，以免糊化。煮汁一定要细过滤。
2.2.2 双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌的比例为：3:1:1，总接种量为3%。
2.2.3培养温度控制在37℃，当培养液出现混浊沉淀时，表明此时活菌数很高且大量产酸(此时pH值约4.0)，即可终止发酵。
2.2.4 选择优良的发酵剂是产品是否具有保健作用的关键，也是产品能否长期保存期的关键。 2.2.5 辅助原料按发酵培养基(生产发酵液)配方配制，现配现用以防污染；在发酵及传代中应避免杂菌污染。
2.2.6 实际生产时应按国家标准或行业和企业标准组织生产。
四、实验结果记录
将双歧杆菌口服液混菌发酵液发酵结果记录于下表中。 沉淀情况 活菌总数 pH 值 口感 口服初步感觉 五、思考题 1、在制备保健口服液时，应具备那些条件？ 2、在制备保健口服液时，应注意那些因素?
第四部分 主要参考书
[1] 周群英，《微生物学及实验》第二版， 高等教育出版社 ,2001年。 [2] 周德庆，《微生物学实验教程》第二版，高等教育出版社 ,2002年。 [3] 沈萍，范秀容，《微生物学实验》第三版， 高等教育出版社 ,2002年。 [4] 黄秀梨，《微生物学实验指导》，高等教育出版社 ,1999 年。 [5] 赵斌，何绍江，《微生物学实验》，科学出版社 ,2002 年。
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