盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证

２０１　３年７月第３卷第１　３期　・药品鉴定・　盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证　吴羽岚　嵇海澄　江苏豪森药业股份有限公司，江苏连云港２２２０００　【摘要】目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。方法按《中国药　典》（２０ｔ０年版）附录ⅪＨ无菌检查方法进行。结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。　结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。　【关键词】盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法　【中图分类号１　Ｒ一３３１　【文献标识码１　Ｂ　【文章编号１　２０９５—０６１６（２０１３）１３—９５—０２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｊ　ｅｃｔｉｏｎ　ＷＵ　Ｙｕｌａｎ　ＪＩ　Ｈａｉｃｈｅｎｇ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｈａｎｓｏｈ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ　２２２０００，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｗｅｒｅ　ｄｏｎｅ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ａｐｐｅｎｄｉｘ　ＸＩＨ—ｓｔｅｒｉｌｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ”Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ”（２０１０　ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｌｅｖｏｌｆｏｘａｃｉｎ　ｈｙｄｒｃｈｅｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｆｉｈｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　盐酸左氧氟沙星（Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）化学名称：　（Ｓ）一９一氟一２，３一二氢一３一甲基一１０一（４一甲基一１一哌嗪　９８　００１】、黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８　００３】，以上菌种均由江苏省　药检所提供，传代次数均为第３代。　稀释液：ｐＨ　７．０无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、０．１　ｍｏｌ／Ｌ硫　酸锰溶液、０．９％无菌氯化钠溶液（ＮＳ），本实验室配制。　１．３供试品　基）一７一氧代一７Ｈ一吡啶并【ｌ，２，３－ｄｅ］一［１，４】苯并嗪一６一羧　酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。本品具有抗　菌谱广、抗菌作用强的特点，适用于敏感细菌引起的呼吸系　统、泌尿系统、生殖系统、皮肤软组织感染等的中、重度感染。　无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查　盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液（规格／１００　ｍＬ：０．２　ｇ　０．９　ｇ、批号／１００８０４、１００８０５、１００８０６）　的重要项目［１－６］，本品为大容量最终灭菌注射液，按照《中国　２方法与结果　２．１样品供试液制备　药典）ｘ　２０１０年版１二部附录ＸＩ　Ｈ　的要求，要进行无菌检查。　１　实验材料　１．１仪器　取供试品原液作为供试液。　２．２菌液的制备和计数　Ｈ　ｒＹ一２０００Ａ全封闭集菌仪和ＫＳＦ集菌培养器（杭州高　德泰林有限公司）、ＩＳ—Ｂ５０Ｌ立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用　核子仪器有限公司）、生化培养箱（上海精宏实验设备有限公　分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白　色念珠菌的新鲜培养物用０．９％无菌氯化钠溶液（ＮＳ）１０倍　递增稀释成每毫升含菌数３０　１００　ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液。取生　司）、ＭＪＸ一１６０Ｂ霉菌培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设　备厂）、ＡＫＬ１５００净化工作台（苏州华宏净化技术有限公司）。　１．２试剂　孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物与标准比浊管　对比，取与比浊管相当的菌液用ＮＳ按１０倍递增稀释成每　毫升含菌数３０～１００　ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培　养物，用５　ｍＬ含０．０５％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯８０的０．９％无菌　氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液用ＮＳ１０倍递　培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营　养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。　实验菌株：大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４　１０２］、金黄色葡　萄球菌【ＣＭＣＣ（Ｂ）２６　００３】、枯草芽孢杆菌【ＣＭＣＣ（Ｂ）６３　５０１】、生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４　９４１】、白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）　增稀释成每毫升含菌数３０～１００　ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液。以上各　菌悬液或孢子悬液同时各取２份注入琼脂培养基，采用平皿　计数法计数，结果见表１。　表１　菌液活菌计数　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ　Ｃｍｆ￣，ｖｔｅ　９５　・药品鉴定・　取１２　ｍＬ／管的硫乙醇酸盐流　菌株　金黄色葡萄球菌２０１３年７月第３卷第１　３期　表２　６种试验菌的生长结果　２．３无菌检查过程　２．３．１　培养基的灵敏度检查批次　１　２　３　与对照管相比，供试品阳性管　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈｉｔ０与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　体培养基管９支，分别接种小于１００　ｅｆｕ的金黄色葡萄球菌、　大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌各２支，另１支作为空　白对照，培养３　ｄ；取９　ｍＬ／管的真菌培养基管，分别接种小　于１００　ｃｆｕ的白色念珠菌、黑曲霉各２支，另１支作为空白对　照，培养５　ｄ。在培养的３～５　ｄ内，空白对照管均无菌生长，　枯草芽孢杆菌　１　２　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈＮ与对照管一致　加菌的各培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查　符合规定。　３　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈ即与对照管一致　生长良好，在２４　ｈｆｉＰ与对照管一致　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　２．３．２培养基的无菌性检查取两种培养基各５瓶，分别　置于各自的培养温度下空白培养１４　ｄ，均无菌生长，判该批　大肠埃希菌　１　２　３　硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的无菌性检查符合　规定。　２．３．３无菌检查方法的验证试验组：取１套二联培养器，　生孢梭菌　１　２　先用５０　ｍＬ　ｐＨ　７．０无菌氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜。将　２０瓶供试液全量通过二个滤器，然后用ｐＨ　７．０无菌氯化钠　蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（１０００　ｍＬ／膜，８０　ｍＬ／次），边冲洗边　３　震荡，在２个滤器的最后一次冲洗液中分别加入小于１００　ｃｆｕ的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，最后各加入含２　ｍＬ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ硫酸锰溶液的１００　ｍＬ硫乙醇酸盐流体培养基，作　为供试品阳性对照。　白色念珠菌　１　２　３　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　生长良好，在４８　ｈ即与对照管一致　在培养的３　ｄ内，均无菌生长　在培养的５　ｄＨ，均无菌生长　黑曲霉　１　２　３　阳性对照组：另取１套培养器，不加供试品，其他同上　操作，作为阳性对照。　阴性对照：另取１套滤器，除无供试液、试验菌外同上　操作，其中１管加入含２　ｍＬ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ硫酸锰溶液的１００　ｍＬ　阴性对照（硫乙醇酸盐）　阴性对照（改良马丁）　硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入１００　ｍＬ改良马丁培养　基，作为阴性对照。　【参考文献］　［１］张崇生，陶建亮，王芳．盐酸左氧氟沙星注射液的无菌实验方法验ｉｉＥ［Ｊ］．　海峡药学，２００６，１８（４）：５８—５９．　取供试品与大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉　同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良马丁培养基。　将上述各管按规定温度培养３—５　ｄ。　２．３．４结果判断与对照管比较，所有试验组的试验菌均　生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌　作用或其抑菌作用可忽略不计，可按该法进行供试品的无菌　检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不　［２］许玉华，杜鹃，汤杨．药品微生物污染检测方法验证的必要性［Ｊ］．中国　药品标准，２００５，６（４）：４６．　［３］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所．中国药品检验标准操　作规范［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：３５１—３８９．　ｆ４］马绪荣，苏德模．药品微生物学检验技术【Ｍ】．北京：华龄出版社，２００７：　ｌ５０－２００．　生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需　去除供试品的抑菌作用并重新进行方法验证。　２．３．５结果记录见表２。　【５］汪穗福．微生物检测验证技术［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２００５　２ｏ０—３００．　３结果与讨论　通过以上验证试验，与对照管相比，６种试验菌的试验　组均生长良好。结果提示，采用该法能消除制剂对细菌、真　菌的抑制作用，适用于该制剂的无菌检查。　［６］潘友文．现代医药工业微生物实验质量管理与验证技术［Ｍ］．北京：中　国协和医科大学出版社，２００４：１１０—１６０．　【７】国家药典委员会．中国药典二部附录【Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，　２Ｏ１Ｏ：９９—１ｏ７．　（收稿１３期：２０１３—０２—２１）　９６＋一‘莠舛荦ＧＩ＂ＩＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ