DNA提取各种缓冲液的配制

DNA提取各种缓冲液的配

制

Prepared on 24 November 2020

植物总DNA的提取

一、所需仪器设备及消耗品

剪刀、塑料袋（封口）、冰箱、棕色广口瓶（1000、500、200、100、50ml）、量筒（1000、500、100、10ml）、烧杯（1000、500、200、

100ml）、pH试纸、电子天平、高压灭菌锅、研钵、液氮罐（液氮）、水浴锅、离心机、移液器（1套）、枪头（1ml、200ml、20μl）、枪头盒、离心管（）（包括盒和架）、一次性手套、电泳仪、电泳槽、塑料胶带（宽）、微波炉、凝胶成像系统、垃圾桶、冰盒（自制）、记号笔、单面刀片

二、所需化学药品及试剂

CTAB、NaCl、EDTA-Na2·2H2O、Tris、冰乙酸、硼酸、β-巯基乙醇、NaAc、氯仿（三氯甲烷）、异戊醇、无水乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、蔗糖、溴化乙锭（EB）、RNase、NaOH、HCl（浓）、ddH2O

三、各种缓冲液的配制

（一）2%CTAB提取缓冲液（300ml）（高压灭菌）

4mol/L的NaCl 35ml×3=105ml 1mol/L的Tris-HCl 10ml×3=30ml L的EDTA 4ml×3=12ml CTAB 2g×3=6g

（二）1×TE（母液）（50ml）（高压灭菌）

1mol/L的Tris-HCl（） 500μl L的EDTA（） 100μl 最后加ddH2O定容到 50ml

工作液为×TE（45ml灭菌的ddH2O中，加入5ml已灭菌的1×TE）

（三）4mol/L的NaCl（150ml）（高压灭菌）

35.055g的NaCl，加ddH2O120ml溶解，再加水定容到150ml （四）1mol/L的NaCl（400μl）（用于配制RNase储存液） 取4mol/L的NaCl（已灭菌）100μl，加300μl灭菌的ddH2O。

（五）3mol/L的NaAc溶液（）（50ml）（高压灭菌）

NaAc·3H2O 20.405g 加ddH2O 30ml 用冰乙酸调节pH至 加ddH2O定容到 50ml

（六）RNase储存液（10mg/ml）（1ml）

1mol/L的Tris-HCl（） 10μl 1mol/L的NaCl 15μl RNase 10mg 沸水浴15~20min

（七）EB储存液（1mg/ml）

EB 30mg ddH2O 30ml

磁力搅拌至完全溶解，装入棕色瓶，铝箔包裹，保存于室温。 制胶时EB终浓度为μg/ml（30ml加15μl、40ml加20μl）

（八）10×TBE缓冲液（电泳缓冲液）（高压灭菌）

Tris碱 54g 硼酸 L的EDTA（） 20ml

以上溶于400ml的ddH2O中，在定容到500ml 工作液为1×TBE或×TBE （九）6×上样缓冲液（4℃保存）

%的溴酚蓝（1ml 40%（w/v）的蔗糖水溶液）

40%（w/v）蔗糖水溶液（2g/5ml的ddH2O，加热溶解，注：温度不能太

高）

（十）1mol/L的HCl溶液（不用灭菌）

ml的浓盐酸，加灭菌ddH2O ，混匀，室温保存（100ml）。

（十一）5mol/L的NaOH溶液（50ml，10g的NaOH溶于50ml灭菌的ddH2O中）（不用灭菌）

200g的NaOH，溶于灭菌的ddH2O中，定容至1000ml

（十二）1mol/L的Tris-HCl（）（100ml）（高压灭菌） 12.11g的Tris碱 80ml的ddH2O

加浓盐酸调节pH值至（大约加） （十三）L的EDTA（）（50ml）（高压灭菌） 9.305g的EDTA-Na2·2H2O

1g的NaOH 磁力搅拌器剧烈搅拌 40ml的ddH2O

最后加水定容到50ml，用NaOH调节pH值至

DNA定量用紫外分光光度计法，1 OD260≈50μg/ml双链DNA。

PCR（聚合酶链反应）

一、所需仪器设备及消耗品

冰箱（4℃、20℃）、高压灭菌锅、离心机、移液器（1套）、枪头、枪头盒、PCR管（包括盒和架）、PCR仪、离心管（包括盒和架）、一次性手套、

电泳仪、电泳槽、塑料胶带（宽）、微波炉、凝胶成像系统、垃圾桶、冰盒（自制）、记号笔、单面刀片

二、所需化学药品及试剂

质粒（阳性对照）、引物（1、2）、4×dNTP、DNA模板、buffer（MgCl2）、TaqDNA聚合酶、ddH2O、琼脂糖、DNA标准样品（DNA ladder）、溴化乙锭（EB）、5×TBE电泳缓冲液（Tris、硼酸、EDTA）

三、PCR反应体系与反应程序

仅供参考

成分 无离子水 缓冲液（buffer） MgCl2 4×dNTP 引物 TaqDNA聚合酶 模板DNA 操作顺序：

① 水、4×dNTP混合

② buffer、taqDNA聚合酶混合，①、②混合 ③ 加入引物

④ 混匀、分装PCR管

⑤ 向每个PCR管加入模板DNA PCR扩增反应程序：

94℃预变性3~5min。

10× 25mmol/L 2mmol/L 5pmol/L

5U/μl 母液浓度

各成分加入量（μl/20μl）

2 2 2

各成分终浓度

或含量

1× mmol/L mmol/L L 3U 50ng

20ng/μl

进入循环：94℃变性30s→56℃退火30~45s→72℃延伸1~2min，30~36个循环。

循环结束后再72℃延伸7min。

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗旱生理效果

Induced Expression of DREB Transcriptional Factor and Study on Its Physiological Effects of Drought Tolerance in Transgenic Wheat

成分 无离子水 缓冲液（buffer） 4×dNTP 引物1 引物2 TaqDNA聚合酶 模板DNA PCR扩增反应程序：

94℃预变性5min。

进入循环：94℃变性45s→45℃退火45s→72℃延伸1min，35个循环。 循环结束后再72℃延伸10min。

一般PCR反应中引物的终浓度为~μmol/L，≥μmol/L时，特异性降低或形成引物二聚体，≤μmol/L时，降低产量。

PCR反应中每种dNTP的终浓度为20~200μmol/L。

所用引物浓度是5μmol/L吗

PCR反应时，每个引物的终浓度是多少4×dNTP的终浓度是多少TaqDNA聚合酶的终浓度是多少模板DNA的终浓度是多少

5U/μl 母液浓度

各成分加入量（μl/25μl）

13

各成分终浓度

或含量

1× mmol/L 1μmol/L 1μmol/L 1U 50ng

10× 2mmol/L

2 5 5 1

20ng/μl