猪繁殖与呼吸综合征诊断与疫苗研究进展

朱月华,姜󰀁平,李玉峰,王先炜

(南京农业大学动物医学院,江苏南京210095)

*

󰀁󰀁摘󰀁要:猪繁殖与呼吸综合征是危害世界养猪业的最严重的传染病之一,自出现以来迅速在世界范围内大面积流行,对养猪业造成不可估量的损失,因此对于该病的研究具有重要的意义。近几年来,随着各国对该病的研究日益深入,在疫病的防控机制、诊断方法等方面也取得了重要进展。文章就近年来猪繁殖与呼吸综合征诊断方法和疫苗的发展概况进行了综述,诊断方法主要包括血清学诊断方法和分子生物学诊断方法,疫苗主要包括常规疫苗和基因工程疫苗等。󰀁󰀁关键词:猪繁殖与呼吸综合征;诊断方法;疫苗

中图分类号:S852.659.2;S858.28

文献标识码:A

文章编号:1007󰀁5038(2011)08󰀁0093󰀁05

󰀁󰀁猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又称猪蓝耳病,是由

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的以母猪流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪高热、呼吸困难等呼吸道症状为特征的高度接触性传染病。1996年,我国学者郭宝清首次在国内养殖场内分离到PRRSV,证明PRRSV在我国的存在。2006年,我国发生了大规模的猪蓝耳病,对全国造成了巨大的经济损失。目前,某些猪群虽然没有临床症状,却存在隐性感染,这对养猪业存有潜在的威胁,因此对猪蓝耳病的研究势在必行。国内外学者对该病进行了多方面的研究,本文就PRRSV检测方法和疫苗的研究进展进行综述。

90.0%。BrownE等[2]应用PRRSVNSP7蛋白建立了双重ELISA检测技术,用此方法和IDEXXELISA对1107份血清进行检测,结果表明,IDEXX检测的502份阳性样品中,NSP7双重ELISA检出409份,检出率为97.6%,而IDEXX检测的605份阳性样品中,NSP7双重ELISA检出590份,检出率为97.5%。并且该研究结果显示基于NSP7的ELISA在鉴别诊断PRRSV󰀁型和󰀁型中的敏感性和特异性良好,因此NSP7很有潜力成为IDEXXELISAN蛋白的替代抗原。1.2󰀁间接免疫荧光试验

陈仕龙等[3]应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb󰀁A61,McAb󰀁C65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA),并与商品化的PRRSVRT󰀁PCR鉴别试剂盒进行比较。结果显示,McAb󰀁C65能同时识别PRRSV美洲株和HP󰀁PRRSV,而McAb󰀁A61只能识别PRRSV美洲株,2株单抗都不能识别PRRSV欧洲株,IFA与RT󰀁PCR的符合率为100%。证实了单抗介导的免疫荧光鉴别诊断方法能有效的诊断出高致病株。

1.3󰀁反转录󰀁聚合酶链反应

反转录󰀁聚合酶链反应(RT󰀁PCR)技术是近年来研究最多、进展最快的一种快速有效的分子生物学诊断技术。由于PRRSV存在基因变异,许多学者

1󰀁诊断方法

1.1󰀁酶联免疫吸附试验

核衣壳(N)蛋白和GP5蛋白是PRRSV的主要

免疫原性蛋白,PRRSV感染后,猪在早期主要产生针对N蛋白的抗体,但不能准确有效地评估免疫效果。针对GP5蛋白的抗体具有中和作用,但该抗体出现的比较晚。罗弦利用重组NSP2蛋白抗原建立了检测PRRSV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用此方法与IDEXXPRRSV试剂盒对来源不同的100份血清进行检测,并对检测结果进行比较。结果表明,建立的ELISA方法的特异性为98.1%,敏感度为91.5%,两者的符合率达到

[1]

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收稿日期:2011󰀁01󰀁05

作者简介:朱月华(1986-),女,河北武强人,硕士,主要从事动物传染病与免疫子研究。*通讯作者94

动物医学进展󰀁2011年󰀁第32卷󰀁第8期(总第218期)

针对不同的检测目的建立了相应的RT󰀁PCR检测方法。肖跃强等[4]根据经典与高致病性PRRSVNsp2序列,设计了一对引物,建立了PRRSV经典与高致病性毒株RT󰀁PCR的鉴别检测方法。对分离的8株PRRSV进行检测,3株为经典毒株,5株为高致病毒株;对采集的59份确诊病料进行了检测,21份为经典毒株感染,38份为高致病毒株感染。表明所建立的RT󰀁PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,可用于区分PRRSV经典与高致病毒株。王林等[5]根据PRRSVNsp2基因序列和PCV󰀁2ORF1基因序列设计合成各自PCR引物,在优化单项PCR检测方法的基础上,初步建立了敏感的同时检测PRRSV和PCV󰀁2的二重PCR检测方法。通过检测143份临床病料对二重PCR方法和单项PCR/RT󰀁PCR方法进行了对比验证,结果显示,两者的总符合率在92.6%以上,表明该二重PCR检测方法可以用于临床病料的检测。

TianH等

[6]

1.4󰀁环介导逆转录等温检测

环介导逆转录等温检测(RT󰀁LAMP)是一种较新的检测PRRSV技术。该技术对靶基因的6个特异部位设计4种引物,并在反转录酶和BstDNA聚合酶的作用下对靶基因进行等温核酸扩增反应。RT󰀁LAMP方法简单高效,并且具有较高的敏感性和特异性,检测结果肉眼可判定,1h内获得检测结果。赵彦宗等根据PRRSVM基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT󰀁PCR高100倍,特异性强,可在恒温条件下1h内完成反应,操作简单方便,其扩增效果与两步法RT󰀁PCR方法相比,反应时间缩短,灵敏度提高,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法,在基层检测中具有相当的优势。

ChenCM等[12]根据PRRSVN基因的6个区域设计了4个特异性引物,建立了诊断PRRSV的RT󰀁LAMP方法。将各个样品于等温水浴扩增1h,包含PRRSV的样品出现了与期望一致的条带,而猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病毒没有出现相应条带,具有很好的应用前景。

1.5󰀁基因芯片

PRRSV经常与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)和猪细小病毒(PPV)等发生混合感染,基因芯片因其灵敏度高、特异性强及高通量等优点,已被广泛用于PRRSV混合感染。姜永厚等针对猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV󰀁2)设计了4~6条寡核苷酸探针,建立了一种可同时检测区分这几种病的寡核苷酸基因芯片方法。经过对76个仔猪样本检测结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。相对于单重PCR或RT󰀁PCR,此方法可以同时检测大批量的病料。

符芳等[14]应用基因芯片技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,制备了用于同时检测这5种重要猪病病原的基因芯片,用该基因芯片对100份猪全血样品进行检测,阳性检出结果为PRRSV26份,CSFV20份,PPV5份,PRV2份,PCV217份,PRRSV和PCV2混合感染阳性样品17份。研究表明,此试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,同时也说明基因芯片技术可以在一次检测中[13]

[11]

根据PRRSVN基因的高度保守

区域设计一对引物,建立了快速检测PRRSV的SYBR一步实时定量RT󰀁PCR方法。通过分析生成的标准曲线,验证了此方法的敏感性,同时对猪瘟、猪水疱病病毒和猪水疱性疹病毒的检测结果说明此方法具有很好的特异性。郭杨等[7]在SYBRGreen荧光定量RT󰀁PCR的基础上建立了检测PRRSV的PowerSYBRGreen荧光定量PCR方法。根据PRRSVNSP2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成一对引物来检测高致病性PRRSVNsp2变异株。研究结果显示,Nsp2󰀁PowerSYBRGreenRT󰀁PCR具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以作为PRRSVNsp2变异株的诊断方法。

方桂友等[8]根据变异PRRSV与普通PRRSV的NSP2段基因序列,合成引物和TaqMan探针,通过特异性、敏感性验证,并与常规RT󰀁PCR方法进行比较,建立了TaqMan荧光定量RT󰀁PCR的检测方法。成丹等[9]根据猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)设计特异性引物和TaqMan水解探针,建立了一种敏感度高、特异性强、重复性好,可用于CSFV和PRRSV混合感染检测的复合荧光定量RT󰀁PCR方法。用此方法对155份样品进行检测,结果显示,73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT󰀁PCR的符合率高达99.4%。同时,根据引物探针能量转移方法也可以从系统学上区分来源于不同地区的PRRSV毒株

[10]

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朱月华等:猪繁殖与呼吸综合征诊断与疫苗研究进展

95

对大量的样品进行病原诊断,节省了劳力和时间,对于多种病原的检测有广阔的应用前景。

猪感染PRRSV后可以向外界排毒并产生病毒血症,KittawornratA等[15]根据实时定量RT󰀁PCR来检测唾液和血清中的抗体,以此来研究唾液能否代替血清诊断PRRSV。结果表明,唾液检测快速、有效和花费少,同时此方法可以克服在血清检测中遇到的劳动力、时间和人员安全性的缺点,有望成为替代血清检测的方法。

pIRESneo载体中,构建pIRESneo󰀁GP5󰀁GP4表达盒,再经酶切,与犬2型腺病毒E3区缺失性载体pPoly󰀁󰀁CAV󰀁2󰀁󰀁E3重组,构建了pPoly󰀁󰀁CAV󰀁2󰀁󰀁E3󰀁GP5󰀁GP4重组腺病毒。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,可以诱导产生较强的体液免疫应答,表明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为进一步研究猪体保护试验和研制PRRSV活载体疫苗提供了候选载体疫苗分子。王先炜等利用基因克隆方法,构建融合表达PRRSV󰀁GP5蛋白和PCV2󰀁Cap蛋白的重组腺病毒rAd󰀁Cap󰀁GP5,经IPMA、IFA和Westernblotting验证了GP5蛋白和Cap蛋白在该重组病毒中获得表达。将该重组腺病毒免疫小鼠测定其抗体、中和抗体,结果显示小鼠免疫后出现两种病毒的抗体和中和抗体,诱导小鼠产生明显的体液免疫应答,可以作为预防PCV2󰀁PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株。李宏宇等[22]以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒(rAdV󰀁GP52AE2)疫苗。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,针对PRRSV的中和抗体滴度为1󰀁16,在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。说明利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。

2.2.2󰀁重组痘病毒活载体疫苗󰀁韩松等[23]以鸡痘病毒为载体,构建了表达PRRSVORF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒rFPV󰀁ORF5󰀁ORF6,用小鼠进行免疫试验,并对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSVELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。田野[24]构建了能够表达PRRSVGP5蛋白的重组牛痘病毒rWR󰀁PRRSV󰀁GP5,与构建的真核表达质粒pcDNA3.1󰀁GP5分别免疫小鼠,分离血清,以原核表达质粒pGEX󰀁GP5表达的蛋白为抗原,进行间接ELISA检测,结果显示所构建的重组牛痘病毒rWR󰀁PRRSV󰀁GP5与真核表达质粒pcDNA3.1󰀁GP5在小鼠体内可诱导特异性抗体产生。

2.2.3󰀁重组伪狂犬病毒活载体疫苗󰀁金迪[25]构建了以伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)弱毒

[21]

2󰀁疫苗

目前,针对PRRSV的商品化疫苗主要是常规疫苗,即灭活苗和弱毒苗,其在控制本病传播和蔓延上发挥了较大作用,但尚不十分理想。随着分子生物学的发展,新型疫苗的研制也已取得了很大进展。2.1󰀁常规疫苗

随着高致病性猪蓝耳病的出现,很多学者相继开展了针对该流行毒株的活疫苗和灭活疫苗,其中有些疫苗已经在临床上广泛使用,包括JXA󰀁1R、HuN4󰀁112和TJM󰀁92株等,并取得了较好效果。李丽琴等[16]采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗接种PRRSV阴性的健康断奶仔猪,接种后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,通过临床症状、病理变化、PRRSV特异性抗体水平、细胞因子的水平、病毒血症的持续时间及病毒滴度等几个方面综合评价,HuN4活疫苗的免疫效果明显优于JXA1灭活苗。HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。王旭荣等[17]制备了PRRSVNsp2基因缺失株Jiangxi󰀁3灭活疫苗,王星晨等[18]制备了PRRSV全基因组灭活疫苗,免疫结果显示此两种疫苗的免疫效果良好,能够产生一定的保护率,可以推广应用。金扩世等[19]则对PRRSV󰀁PCV二联灭活疫苗免疫效力进行评估,结果表明,该二联疫苗免疫4周龄仔猪,于免疫后7d即可检测到抗PCV󰀁2和PRRSV抗体,免疫后21d抗体可达较高水平,28dELISA抗体和SN抗体均达到高峰。且该疫苗不会对两种病毒免疫产生相互拮抗作用,反而可起到相互促进作用,从而提高免疫免疫保护效率,同时在免疫猪后,不但可有效抑制病毒复制,达到临床免疫保护的目的,并且可减少病毒血症,防止病毒传播。

2.2󰀁基因工程疫苗

2.2.1󰀁重组腺病毒活载体疫苗󰀁蔡锦顺等用RT󰀁PCR方法扩增出GP5和GP4基因,克隆到[20]

疫苗Bartha󰀁K61株为载体表达PRRSVCH󰀁la株GP5的重组伪狂犬病病毒(rPRV󰀁GP5),以Balb/c96

动物医学进展󰀁2011年󰀁第32卷󰀁第8期(总第218期)

小鼠和仔猪为试验用动物评价rPRV󰀁GP5免疫小鼠和仔猪后对PRRSV所产生的特异性免疫应答。结果表明,rPRV󰀁GP5免疫小鼠,特异性针对GP5的血清IgG抗体在第4周初次检测到,最高抗体滴度为1󰀁40,一直能持续检测到第10周。免疫仔猪后,特异性针对GP5的血清IgG抗体同样是在第4周初次检测到,最高抗体滴度为1󰀁40。

2.2.4󰀁基因疫苗󰀁EllingsonJS等[26]通过修饰活疫苗和分离强毒株(wtMN184)的不同重组构建了5个嵌合体克隆和一特异性突变株MN184毒株,免疫猪后攻异源毒株JA󰀁142,评价嵌合体疫苗的效力。结果表明MN184毒株ORF5󰀁6区交换能够对JA󰀁142毒株产生保护作用。ChiaMY等对共表达GP5和M蛋白的DNA疫苗进行了免疫原性研究,以甘氨酸󰀁脯氨酸󰀁甘氨酸󰀁脯氨酸(GPGP)链接GP5和M蛋白,构建了3个DNA重组体,以GPGP的有无和GP5与M的位置分别命名为pcDNA󰀁56、pcDNA󰀁5L6和pcDNA󰀁6L5。用其分别免疫猪,3周后攻毒,测定血清抗体滴度。结果表明,在免疫后3周即产生了中和抗体,且在攻毒后抗体水平上升。说明3个DNA重组体可以产生足够的免疫记忆。注射pcDNA󰀁5L6和pcDNA󰀁6L5的猪产生的病毒血症水平低,持续时间短。此研究表明可能通过改变靶融合蛋白的天然构象,使共表达GPGP连接的GP5和M融合蛋白成为将来PRRSV疫苗研究更有希望的方法。

2.2.5󰀁重组杆状病毒活载体疫苗󰀁张翔峰等[28]通过设计引物扩增PRRSVORF5和猪圆环病毒2型ORF2基因,将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC󰀁ORF2、pFVC󰀁ORF5、pFVC󰀁ORF5󰀁ORF2。将重组质粒分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒并转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc󰀁ORF2、rAc󰀁ORF5、rAc󰀁ORF5󰀁ORF2。重组杆状病毒对Balb/c小鼠的免疫试验结果显示,3株重组杆状病毒均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,并能持续较长时间。此外,在疫苗研制方面,HuangYW等[29]提出利用反向遗传操作系统构建具有安全性好、免疫效力高的重组PRRSV疫苗毒株是一个值得关注的方向,并对新一代PRRSV疫苗的研制提出了新的方法和策略。

[27]

现有的诊断方法尚不能有效地鉴别毒力,疫苗不能够对异源毒株产生很好的保护作用,也没有理想的疫苗免疫效果的快速评价方法,依靠疫苗或者药物来控制本病困难较大,猪场做好加强饲养管理仍十分重要。参考文献:

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ductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)inserumand3󰀁结语

PRRSV是目前影响世界养猪业的最重要病原

之一,病毒变异速度快,容易和其他疾病混合感染,

朱月华等:猪繁殖与呼吸综合征诊断与疫苗研究进展

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AdvanceDevelopmentinDiagnosisandVaccinesAgainst

PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome

ZHUYue󰀁hua,JIANGPing,LIYu󰀁feng,WANGXian󰀁wei

(CollegeofVeterinaryMedicineofNanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

Abstract:Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeisoneofthemostseriousinfectiousdiseaseswhichisharmfultotheswineindustryworldwide,ithasspreadtomanypartsofworldsinceitsdiscoveryandlea󰀁dedtodevastatinglossestotheglobalswineindustry,soitisveryimportanttostudyofthisdisease.Inre󰀁centyears,tremendousimportantprogressesinmechanismsofprevention,diagnosticmethodsandthema󰀁jorpreventionandcontrolmeasureshavebeenmadeasincreasinglydeeperstudyofthisdisease.Asimpleoverviewismadeaboutthediagnosticmethodsandvaccinedevelopmentofporcinereproductiveandrespir󰀁atorysyndromeinthispaper.Serologicaldiagnosticmethodsandmolecularbiologydiagnosticsaresumma󰀁rizedindiagnosticmethodswhileconventionalvaccinesandgeneticengineeringvaccineinvaccinedevelop󰀁ment.

Keywords:Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome;diagnosticmethods;vaccines