164圆园20年3月
第41卷第6期
云oodResearchAndDevelopment食品研究与开发检测分析
呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的
建立及性能测定
*
徐冬梅1，李亚英2，李玉静3，（1.石家庄职业技术学院食品与药品工程系，河北石家庄050081；2.河北科技大学，河北石家庄
050018；3.河北交通职业技术学院，河北石家庄050051）
采用自制的呋喃西林代谢物抗原、抗体为基础摘要：建立动物源性食品中呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法。（enzyme-linkedimmunosorbentassays，原料，通过优化反应条件，建立间接竞争酶联免疫吸附试验ELISA）检测方法，并对方法的性能进行测定。结果表明：建立的检测方法在0.03滋g/L~2.43滋g/L范围内呈线性，检测灵敏度为0.03滋g/kg，鱼肉组织样本、虾肉组织样本的检测限分别为0.236、0.229滋g/kg，回收率均在75%~120%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，通过与标准方法液相色谱-串联质谱（highperformanceliquidchromatography-massspectrum/mass喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的灵敏度、准确度和精密度等参数均符合我国动物源性食品中兽药残留检测方法的规定。
关键词：呋喃西林；残留；酶联免疫吸附；检测方法；性能
spectrum，LC-MS/MS）对比验证，两种方法用于鱼肉样本的检测呈现较好的相关性，相关系数R2为0.9944。建立的呋
EstablishmentofEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayforDeterminationof
FuracillinMetabolitesandItsProperties
（1.DepartmentofFoodandDrugEngineering，ShijiazhuangVocationalTechnologyInstitute，Shijiazhuang050081，Hebei，China；2.HebeiUniversityofScienceandTechnology，Shijiazhuang050018，Hebei，China；粤遭泽贼则葬糟贼：Toestablishanenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedeterminationoffuracillinmetabolitesincompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassays（ELISA）methodwasestablishedanditsperformancewasmeasuredbyoptimizingthereactionconditions.Theestablisheddetectionmethodwaslinearwithintherangeofanimalderivedfood.Usingthefuracillinmetaboliteantigenandantibodyasthebasicrawmaterials，indirect
3.HebeiJiaotongVocationalandTechnicalCollege，Shijiazhuang050051，Hebei，China）
*
XUDong-mei1，LIYa-ying2，LIYu-jing3，0.03滋g/L-2.43滋g/L.Thedetectionsensitivitywas0.03滋g/kgandthedetectionlimitsoffishtissuesamplesandshrimptissuesampleswere0.236滋g/kgand0.229滋g/kg，respectively.Therecoverieswerebetween75%and120%，thevariationcoefficientbetweenbatchandbatchwerebelow15%，comparedwithstandard
methodofhighperformanceliquidchromatography-massspectrum/massspectrum（LC-MS/MS），twomethodsusedinthedetectionoffishsampleswereshowinggoodcorrelation，thecorrelationcoefficientR2of0.9944.Thesensitivity，accuracyandprecisionoftheestablishedmethodforthedeterminationoffuracillinmetabolitesbyenzyme-linkedimmunosorbentwereinlinewiththerequirementsofthemethodforthedetectionofveterinarydrugresiduesinfoodofanimalorigininChina.
运藻赠憎燥则凿泽：furacillin；residue；enzyme-linkedimmunosorbent；detectionmethod；performance
（1980—）研究方向：微生物应用技术。作者简介：徐冬梅，女（汉），高级工程师，博士研究生，*通信作者
检测分析
引文格式：
徐冬梅，等：呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的建立及性能测定
165徐冬梅，李亚英，李玉静.呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的建立及性能测定[J].食品研究与开发，2020，41（6）：164-168
XUDongmei，LIYaying，LIYujing.EstablishmentofEnzyme-linkedImmunosorbentAssayforDeterminationofFuracillinMetabolitesandItsProperties[J].FoodResearchandDevelopment，2020，41（6）：164-168
呋喃西林（Nitrofurazone）是硝基呋喃类药物的一种，具有5-硝基呋喃母核[1]，可抑制细菌DNA和RNA合成，干扰菌体内酶代谢系统，能有效杀灭多种革兰氏阴性和阳性菌及某些真菌和原虫，曾被广泛应用于畜牧、水产养殖中[2]。然而，该类药物及其代谢物具有细胞诱变性、动物致癌毒性[3]，通过食物链进入人体后会产生潜在危害，大部分国家已经禁止其在肉食中残留[4]。
呋喃西林在动物体内会被迅速代谢[5]，不易检测，其代谢产物氨基脲（semicarbazidehydrochloride，SEM）SEM能跟可细作胞为内蛋白呋喃西长林期残结留合[6-8]的标，识存物留。目较长前时间，呋喃，因西林此
代谢物的检测方法主要为色谱分析技术和免疫学分formance析技术。liquid色谱技chromatography术主要为高效，液HPLC相色）、谱液法相（色high谱-per质原
谱联用法（liquidchromatography-mass，LC-MS）和液相
色谱串联质谱法（LC-MS/MS）等，这些方法能随刻进行精确检测[9-11]，有着灵敏和准确等优点，但仪器设备昂贵、操作繁琐、检测成本高，不适合现场批量检测，严重影响了对其非法使用的检测监管和风险预警。以酶联免疫吸附技术为代表的免疫分析方法具有灵敏准确、方便快捷、分析容量大、检测成本低等优点，可以实现对目标物进行现场批量快速定性定量分析，已成为目前最有效的初筛技术手段[12-17]，广泛应用于动物源性食品中有毒有害物质的检测。
本研究以自制的SEM抗原、抗体为基础原料[18]，通过确定抗原和抗体使用浓度、抗原包被时间和温度ELISA、一抗和检测二方抗法作，通用时间等反应条件，建立间接竞争确度和精密度等参数过均性能符合测我定国，该动方物法源性的灵食品敏度中、
兽准药残留检测方法的有关规定，具有简便、快速、能批量检测等特点，能够应用于动物源性食品中呋喃西林代谢物的检测。影响该方法性能的因素有很多，如人工抗原的纯度、抗体的敏感性和特异性以及方法学的各项反应条件等[19-23]。本试验采用了自制的呋喃西林代谢物的人工抗原和单克隆抗体，人工抗原经透析等手段保证了纯度，单克隆抗体经鉴定具有很高的敏感性和特异性，从基础材料上有效保障了方法学的建立。通过进一步的试验，建立其酶联免疫吸附测定方法。1
1.1材料与方法
呋喃试剂
西林代谢物标准品：Sigma公司；呋喃西林代
谢物完全抗原SEM-OVA、呋喃西林代谢物单克隆抗体细胞株3D9：河北省科学院生物研究所细胞生化研究室研制；牛血清白蛋白（bovineserumalbumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、胎牛血清：上海生物工程股份有限公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG：北京中杉1.2金桥生仪物器；设备
其它试剂均为国产分析纯。
司；ME54EMULTIVAP电子分型析氮天吹平仪：：METTLER上海书俊公司；仪器设备液氮有限公
罐：成都金凤液氮容器有限公司；AllegraX-15R高速冷冻离
心机：德国BECKMAN公司；DKB-8A电热恒温水浴锅：上海精宏设备有限公司；ELX800酶标仪：美国伯腾仪器有限公司Bio-TEK；XW-80A漩涡混合器：上海医科大学仪器厂；96孔酶标板：Costar公司；微量移液器1.3：Eppendorf方公司。
1.3.1ELISA法
1.3.1.1抗原抗、原抗抗检体采体测工作方法条件优化用方浓阵度稀释的确法定
，横向包被梯度浓度
的抗原，纵向加入倍比稀释的抗体，用间接酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）法进行测定，选择A1.0左右时抗原和抗体浓度
的1.3.1.2组合作以确抗为定原理的抗包想被工作450原时间浓nm为、抗及度。
体温浓度度的，分选择
别设定包被条件为
以下6种：4益包被过夜、37益孵育0.5、1、2、3h和4h，1.3.1.3分别检测一抗其吸光度作用时间值，选的择选最佳择
包被时间和温度。
一抗作用时间会影响到一抗和抗原的反应效果，
因此需要通过试验来确定一抗与抗原的最佳作用时间。本试验选用一抗作用时间分别为10、20、30、45min
徐冬梅，等：呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的建立及性能测定
检测分析
166和1.3.1.460min羊抗羊，通小抗过鼠小线二鼠性抗的二关系选抗孵作育用择时间选时间最佳的作用确用定时间。10、20、30、45min
和1.3.260min准样确品进称取预行处测（理
定。1依0.05）g均质样本于50mL离心管中100；加滋L入衍生化4mL试去剂离工作子水，0.5充mL分振荡1mol/L；在盐酸溶37益过液夜和育（约16h）或60益水浴液孵，育1.5h；分别加入5mL孵
0.1mol/LK2HPO4溶液，0.4mL1mol/LNaOH溶液和46mL的乙酸乙酯，充分振荡5min；室温5000已mL烷溶离r/min解心残管，离留中心物，5010，再益min加~60；入1益取mL水出浴氮3mL复溶气的工作吹上干层液；充用液26分2到益下振荡mL另一正混
合30s；室温26益4000r/min，离心5min；去除上层正己烷相以及两相（正己烷相和水相）之间的泡沫或者胶1.3.3状物，1.3.3.1ELISA取下层水相50滋L样品进行检测。按照标优准曲线方法化的条件的的性能建，立
测定在线性范围内绘制标准曲线，
计算回归方程和R2，计算IC曲线的稳定性。
50值；重复测定，确定标准
1.3.3.2根据检欧测盟限《测动定
物源性食品中兽药残留检测方法》
的规定，分别测定20份鱼肉组织的空白样品，根据以上所述的方法对样品进行处理。用回归方程计算样品残留浓度，用SPSS得出样品浓度的平均值（X）和标准1.3.3.3差（SD），准以确X度加试验
3倍SD值作为各样本的最低检测限。
采用样品添加回收试验检测该方法的准确度，在
ELISA空白鱼方肉法样检品测中添。回加收不率同计浓算度如的下待：测物，用间接竞争
1.3.3.4回收精率密/%=度试验
实测浓度（滋g/L）/添加浓度（滋g/L）伊100精密度试验用变异系数来表示。
变异系数（CV）/%=SD/X伊100
式中：SD表示标准偏差；X表示平均值。取5个批次的组装试剂盒，测定鱼肉组织中添加不1.3.3.5同浓度选取ELISA的待测物鱼肉样法本与的变异系数。，仪用器本试验方法的确比定较
的间接竞争ELISA
法和农业部783号公告-1-2006中液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）同时对样品进行检测，比较两种方法的符合性。
2
2.1结果分析
对抗抗原原抗抗体体最佳的最佳工作浓工作度的浓确度定的进行测定，结果如
图1。
1.21.0111颐颐颐211万万万，，，210.5滋0.8滋g/mL
g/mL0.6滋g/mL
0.40.20.0
-1.0
-0.5
NPSEM（滋g/L0.0
）浓度对0.5数
1.0
图1SEM不同抗原抗体浓度检测结果
Fig.1Differentantigenantibodyconcentrationdetectionresultsof
SEM
随着包被浓度的降低，抑制曲线在上移，IC上升，可能是抗原抗体的结合能力较差，需要比50值在
较高
的1作用浓度。综合考虑，选择线性较最佳抗滋g/mL2.2原、抗体稀释倍数1颐1万作为SEM好的抗的ELISA原浓度法包包被被抗条件时间体使结果及用温浓度。
见度图的确2。
定
3.02.52.01.51.00.50
包被条件
图2最佳包被时间和温度的确定
Fig.2Determinationofoptimalpackettimeandtemperature
无37明益结果显2差h别后表，OD明，故确值37定趋益37于0.5稳益定h所2，得h或且4与OD益4值过益夜过明为最佳夜显的较低OD，包被值
到
条件2.3。
优一抗化一抗的作用时间作用的时间优化
，结果如图3所示。
随着抗体和抗原作用时间的增加，抑制曲线呈上移趋势，综合反应时间和线性关系因素，选择30min2.4作为羊SEM抗小间鼠接二竞争抗作ELISA用时间的一抗行测的定确，定
作用时间。
对二抗作用的时间进结果如图4。
随着作用时间的延长抑制曲线呈现上移，且线性
检测分析
徐冬梅，等：呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的建立及性能测定
1.00.90.8100.7200.630min
45min0.560minminmin
0.40.30.20.1-1.0
0-0.5
NPSEM（滋g/L0.0
）浓度对0.5
数
1.0
图3SEM不同的一抗作用时间结果
Fig.3Resultsofdifferentactiontimeofprimaryantibody
1.0
0.90.80.7102030min0.60.50.445min0.360minminmin
0.20.1-1.0
0-0.5
NPSEM（滋g/L0.0）浓度对0.5数
1.0
图4SEM不同的二抗作用时间结果
Fig.4Resultsofdifferentactiontimeofsecondaryantibody
范围在扩大，综合反应时间和线性关系，选择30min作2.5为SEM间接竞争ELISA的二抗作用时间。将标准曲线
6个浓度的SEM标准溶液（0、0.03、0.09、0.27、
ELISA0.81、2.43B0为标法测滋准品定g/L获），0滋得每个g/L相应浓的的度吸光度吸光度重复值，值，计5孔，按照间B为标算准抑品制率接竞争
不同B/B浓0
度的吸光度值）。以B/B0为纵坐标，以标准品浓度的对数值为横坐标，绘制SEM的抑制曲线。结果如图5。
0.8
0.7y=-0.3351x+0.3842
0.60.5R2=0.9927
0.40.30.20.1-1.0
0-0.5
NPSEM（滋g/L0.0）浓度对0.5数
1.0
图5SEMELISA试剂盒标准曲线Fig.5ELISAkitstandardcurveofSEM
0.992范围SEM内7）呈。线的以性ELISA线，性最线性检低方程测方点0.03为法y滋=-0.335在0.03g/L1滋xg/L~2.43+0.3842（滋Rg/L
2=
敏度。
作为该检测方法灵2.6检测限测定167对鱼肉组织、虾肉组织样本进行检测，结果如表1
和表2所示。
表1鱼肉组织样本测定结果
Table1Determinationoffishtissuesamples
滋g/kg样品号
测定值样品号测定值样品号测定值1#2#0.2018#0.17515#0.1583#0.19310#9#
0.1940.21116#0.1774#
0.1690.186
12#
0.188
17#
0.1895#
6#
0.156
11#
0.17918#
0.1790.177#
0.184
0.167
13#
14#
0.162
19#0.23
20#
/
0.166
/
平均值0.182标准差
0.018检测限
0.236
表2虾肉组织样本测定结果
Table2Determinationoftissuesamplesfromshrimpmeat
滋g/kg样品号测定值样品号测定值样品号测定值1#2#0.1728#0.20815#3#0.15616#0.1674#
0.1780.173
10#9#
0.1890.148
0.158
17#0.18218#
0.168
5#
0.212
6#
0.155
11#
0.162
7#
0.147
12#
0.194
13#
14#
0.187
19#0.154
20#
0.171/
0.184
/
平均值0.173标准差0.019检测限
0.229
检测限分别为0.236滋g/kg和0.229滋g/kg，根据实2.7际检测试情况剂盒将准样确本度的最及精低密检度测测限定
定为0.25滋g/kg。
试验SEM，结果的如ELISA表3所试示剂，样盒品测回定收鱼率肉均组织在中添75%~120加回收
%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，符合我国动物2.8源食品中兽药残留检测方法的规定。
本试验与仪器方用法标的对准方比试验
法LC-MS/MS和ELISA方法同
时测定样品中SEM的含量见图6。两种方法用于鱼肉样本的检测，均呈现较好的相关性，R2为0.9944。
（168徐冬梅，等：呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的建立及性能测定
表3样品的变异系数及回收率
Table3Coefficientofvariationandrecoveryofsamples
检测分析
添加浓度（/滋g/kg）
3批内X依SD2.32依0.272.09依0.22
回收率/%104.511877.3变异系数/%11.610.5
X依SD2.46依0.161.87依0.19
批间回收率/%93.511382变异系数/%10.213.36.52
11.18依0.1714.41.13依0.152520y=0.9279x+0.3796
15R2=0.9944
10500
5
ELISA检10
测结果15
（/滋g/kg）
20
25
图6LC-MS/MS和ELISA方法检测鱼肉样本中SEM的相关性比较Fig.6CorrelationcomparisonbetweenLC-MS/MSandSEMin
fishsamples
3结论
本研究建立的检测方法在0.03滋g/L~2.43滋g/L范
围0.9927内呈肉组织）线性，线性方程为y=-0.3351x+0.3842（R样，检本测的灵检敏测度限为分别0.03为滋0.236g/kg，、鱼0.229肉组织滋g/kg样，本回、虾2=
收15率均种方%在法以用于下75，通%~120鱼肉过样与%本标之的准间检方，测法批均LC-MS/MS内、批间变呈现较好对异的比验系数相关证均性，，两在
相关系数R2为0.9944。本研究建立的呋喃西林代谢物酶联免疫吸附测定方法的灵敏度、准确度和精密度等参
数均符合我国动物源性食品中兽药残留检测方法的规
定，具有灵敏准确、方便快捷、分析容量大、检测成本低等优点，适合动物源性食品中呋喃西林代谢物的检测。参考文献：
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附法测
收稿日期：2019-11-29
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