一、实验目的和要求
1．了解酶促动力学研究的范围。
2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km)。
二、实验内容和原理
在酶促反应中，当反应体系的温度、pH和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis和Menten根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：
V[S]km[S]
v此式称为米氏方程，式中Km称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km。方法有：
1．以v[S]作图
由米氏方程可知，v=V／2时，Km＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v对[S]作图。当v＝V／2时，其相应底物浓度即为Km。
2．以1／v对1／[S]作图
取米氏方程的倒数式：
1km11•vV[S]V
以1／v对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km／V，截距为1/V。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l／Km。
本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm处比色测定之。
棉子糖是一种非还原性三糖，与蔗糖有相似的结构。蔗糖酶水解棉子糖，可得到双糖（密二糖）和单糖（果糖），果糖是还原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的还原糖来进行测定，但本实验是要测定棉子糖和果糖对蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，还原糖的测定不能真实的反应果糖对蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用。
三、实验材料和试剂
1．实验材料：
蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。
2．实验试剂：
（1) 3,5－二硝基水杨酸试剂：
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
（2) 1％葡萄糖溶液(葡萄糖相对分子量198.17）。
（3）1％蔗糖溶液。
（4）0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5。
（5）5％棉子糖溶液。
（6）4mol/L尿素溶液。
四、实验器材与仪器
1．试管及试管架；
2．可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；
3．恒温水浴箱(50℃）。
4. 恒温水浴（100℃）；
5. 移液管；
6. 微量移液枪。
五、实验步骤与数据记录
1. 如下表所示，加入相应试剂到各个试管中。并测定各试管溶液在520nm波长下的吸光度值，记录数据，并绘制葡萄糖标准曲线。
2．如表2所示配置各试管溶液。先采用6号管的底物溶液进行预实验，分别加入不同稀释倍的蔗糖酶液，依表2步骤进行后测定其吸光度。选用吸光度在0.6-0.7范围内的酶液，并以此作为蔗糖酶液的稀释倍数。经过预实验可得1700倍为适当的稀释倍数，因此下面的实验都使用稀释1700倍的蔗糖酶液。并记录相应数据。
3．按表3加入相应试剂到各个试管中，并按其步骤操作。测得A520，记录数据。
4．操作同步骤2，步骤3。
五、实验数据处理
1. 葡萄糖标准曲线：
图1. 葡萄糖标准曲线图
2. 表2数据处理：
图2. 表2数据处理图1/V～1/[S]
由图2求得Vmax=1.301×10-2，Km=1.301×10-6。
3. 表3数据处理：
图3. 表3数据处理图1/V～1/[S]
由图3求得Vmax=5.556×10-3，Km=5.556×10-7。
4. 表4数据处理：
图4. 表4数据处理图1/V～1/[S]
由图4求得Vmax=2.225×10-2，Km=4.450×10-6。
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