固相萃取－高效液相色谱法测定食品中6种对羟基苯甲酸酯
王萍亚，周勇，陈皑，黄鹂，赵华，张薇英
(国家海洋食品质量监督检验中心, 浙江 舟山 316021)
摘要：建立了固相萃取－高效液相色谱法（SPE-HPLC）同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯）含量的方法。考察了2种不同提取液和3种不同流动相体系对6种对羟基苯甲酸酯分析的影响，最终分别选择乙醇和甲醇－柠檬酸缓冲液为提取剂和流动相。样品提取液经Oasis HLB固相萃取柱净化和甲醇定容后，紫外检测器258 nm处测定。结果表明，6种对羟基苯甲酸酯在0.1 ~ 20.0 mg/L范围内呈现良好线性关系，各组分的检出限分别为0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.2 mg/kg（S/N=3），不同剂量的加标回收率为82.8% ~ 115.5%，相对标准偏差（RSDs）为0.2% ~ 6.8%。该方法简便、快速、灵敏，准确度和重现性较好，可作为食品中测定多种对羟基苯甲酸酯类添加剂的有效方法。
关键词：对羟基苯甲酸酯；食品；高效液相色谱法
中图分类号：O658 文献标识码：A 文章编号： 栏目类别：研究论文
Determination of 6 p-Hydroxybenzoates in Food Using Solid Phase
Extraction-High Performance Liquid Chromatography
WANG Ping-ya, ZHOU Yong, CHEN Ai, HUANG Li, ZHAO Hua, ZHANG Wei-ying
(National Marine Food Quality Supervision and Testing Center, Zhoushan, Zhejiang 316021, China)
Abstract: A methd was developed for determination of 6 p-hydroxybenzoates (methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, isobutyl p-hydroxybenzoate and butyl p-hydroxybenzoate) in foods using the combination of solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC). Two different extraction solution and three different mobile phase were tested for p-hydroxybenzoates analysis, and finally ethanol and methanol-citric acid solution were selected as optimal. Samples were extracted with ethanol solution and purified by Oasis HLB solid-phase extraction cartridge. p-hydroxybenzoates were redissolved in methanol and determined by UV-detection at wave length of 258 nm. Results showed that the calibration graphs was linear in the concentration rang of 0.1 ~ 20.0 mg/L. The limits of detection were 0.1 mg/kg for methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate and 0.2 mg/kg for isobutyl p-hydroxybenzoate, butyl p-hydroxybenzoate（S/N=3）. The average recoveries were between 82.8% ~ 115.5% with relative standard deviations（RSDs）of 0.2% ~ 6.8%. The method is simple, rapid, sensitive, accurate and reproducible. It can be used for the routine analysis of the p-hydroxybenzoates in foods.
Key words: p-hydroxybenzoates; food; high performance liquid chromatography（HPLC）
防腐剂是食品生产、加工、储存等过程中广泛使用的一类化合物，它们能够抑制微生物的繁殖，以达到延长食品保质期目的，如苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类等[1-2]。但防腐剂的过量加入亦会危害人体健康，而且我国对防腐剂的使用量和残留量也有着严格的规定和要求。因此，高效、快 速、高选择性和高灵敏度测定食品中的各种防腐剂对确保人类健康具有重要的意义。 —————————————
通讯联系人：王萍亚，女，高级工程师，主要从事食品检测技术研究。Tel：(0580)2080538, E-mail: zxhuaxueshi@163.com. 基金项目：浙江省重大科技计划项目（2007C13067）
目前，防腐剂的测定方法主要有高效液相色谱法[3-5]、薄层色谱法[6]、毛细管电泳法[7-8]、气相色谱法[9-11]等。但是，随着食品品种和添加剂种类的不断扩大，需要开发出能同时适合多类不同样品中多种添加剂的测定方法[12-15]。由于对羟基苯甲酸酯类防腐剂种类繁多，而且在鱼肉制品、乳制品、脂肪制品、饮料、糖果等食品和化妆品中使用广泛[16-17]。因此，本实验通过多条件摸索，建立了一种能够快速、简单、高效和准确地同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯的方法。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
Waters 2695高效液相色谱系统（美国Waters公司），配套Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱管理软件；DS-1型组织捣碎机（上海标本公司）；低温高速离心机（德国Hettich公司）；20位固相萃取装置带负压抽滤器（美国Waters公司）；Milli-Q去离子水纯化系统（美国Millipore公司）；Waters Oasis HLB. 6cc固相萃取小柱（200 mg，美国Waters公司）。
甲醇为色谱纯，乙醇、柠檬酸等试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。
对羟基苯甲酸酯标准品（美国Sigma公司）：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯，纯度≥99%。 1.2 色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry-C18，粒度5 μm，4.6 mm×250 mm（ID×L）；检测波长：258 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；流动相：柠檬酸缓冲液－甲醇（体积比为48:52）；柱温：40℃。 1.3 实验方法
1.3.1 标准工作溶液的配制
将对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯用甲醇配制成100 mg/L的单标储备液，按实际检测要求，用甲醇稀释到相应浓度的混合标准工作溶液，浓度系列：0.10、0.50、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/L。 1.3.2 样品准备和处理
取适量样品经组织捣碎机捣碎，称取样品5 g（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入25 mL提取液，水浴超声波辅助提取15 min（每5 min振摇几下），取出，4000 rpm离心10 min，上清液转入容量瓶中，残留物再用25 mL提取液重复提取1次，合并上清液，用提取液定容至50.0 mL，滤纸过滤，滤液离心，上清液备用。
固相萃取小柱预先用10 mL甲醇，10 mL蒸馏水活化，再取经上述步骤处理过的样品清液25 mL滤过，再以3.0 mL甲醇洗脱小柱，收集甲醇洗脱液，用甲醇定容至5.0 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤作为试液，供高效液相色谱仪测定。 1.4 对羟基苯甲酸酯的分析
定性 在相同色谱条件下，将样品色谱图与对羟基苯甲酸酯标液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的对羟基苯甲酸酯。
定量 本实验采用Enpower色谱工作站中的增强型积分法确定各组分的峰面积，按外标法定量。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的确定
对羟基苯甲酸酯类难溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。分别选用乙醇、甲醇作为提取溶剂进行回收率试验。试验结果表明，乙醇和甲醇均具有较高的提取效率，但两者差异不显著。由于甲醇挥发后易被呼吸道、胃肠道和皮肤吸收而致中毒，对长期接触的实验人员具有一定的危害，因此本试验中考虑采用乙醇作为提取溶剂。此外，对羟基苯甲酸酯类显弱酸性，调节溶液pH值使组分处于酸性分子状态，易被有机溶剂萃取。基于上述原理考虑，以乙醇溶液调节提取溶液至酸性再进行回收率试验，结果表明酸性条件下提取样品的回收率大幅提高。因此，我们确定酸性条件下的乙醇溶液为对羟基苯甲酸酯类的提取溶剂。 2.2 流动相的选择
为选择最佳的检测条件，分别对乙腈－水、甲醇－水和甲醇－柠檬酸缓冲液三种流动相体系进行了试验。结果显示，使用乙腈－水流动相的分离度较差，而且会出现严重的重叠现象。甲醇－水流动相体系，虽然分离度较前者要好，但是该体系需要使用梯度洗脱条件，而这导致基线稳定性较 差，而且使分析时间明显延长。而选择甲醇－柠檬酸缓冲液流动相体系，在同等条件下它能较好地分离六种对羟基苯甲酸酯类，而且能有效地缩短总的分析时间。此外，还考察了不同体积分数的甲醇－柠檬酸缓冲液对各组分分离的影响。结果显示，甲醇体积分数为52％的流动相最为适合，分离效果好，色谱峰明显，而且保留时间合适。 2.3 检测波长的选择
用二极管阵列检测器在210 ~ 400 nm之间对各组分的标准溶液进行光谱扫描，吸收光谱如图1所示。从图中可以发现，6个组分中有2个组分在256.8 nm处具有较高的灵敏度，而另4个组分在258 nm处表现高灵敏度，因此我们优先选择258 nm作为本次实验的检测波长。
1 (256.8) 2 258.0 3 AU 256.8 4 258.0 5 258.0 6 258.0 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0 320.0 340.0 360.0 380.0 λ/nm 图 1 6种对羟基苯甲酸酯类的吸收光谱图 Fig. 1 Absorption spectrum of 6 p-hydroxybenzoates
1. methyl p-hydroxybenzoate; 2. ethyl p-hydroxybenzoate; 3. propyl p-hydroxybenzoate; 4. isopropyl p-hydroxybenzoate;
5. butyl p-hydroxybenzoate; 6. isobutyl p-hydroxybenzoate
2.4 方法的评价
2.4.1 标准曲线的线性范围
对羟基苯甲酸酯的混合标准工作液用甲醇稀释定容，配制对羟基苯甲酸酯标准溶液浓度系列为0.10 mg/L、0.50 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L和20.0 mg/L。对羟基苯甲酸酯类标准品通过高效液相色谱进行分析，检测结果如图2所示。实验结果表明，在甲醇－柠檬酸缓冲液为流动相条件下，各组分保留时间合适，而且分离效果较好。
图2 六种对羟基苯甲酸酯类标准品的高效液相色谱图 Fig. 2 Chromatograms of 6 p-hydroxybenzoates standards
1. methyl p-hydroxybenzoate（0.5 mg/L）; 2. ethyl p-hydroxybenzoate（0.5 mg/L）; 3. propyl p-hydroxybenzoate（0.5 mg/L）; 4. isopropyl p-hydroxybenzoate（0.5 mg/L）; 5. butyl p-hydroxybenzoate（0.5 mg/L）; 6. isobutyl p-hydroxybenzoate（0.5
mg/L）
根据色谱图中各组分的峰面积与其质量浓度进行线性回归，得出回归方程和相关系数。本法线性回归方程如表1所示，其中Y代表峰面积，X代表进样质量浓度（mg/L）。实验表明，本法线性范围较宽，考虑到不同样品的实际需要，确定线性范围的上限为20.0 mg/L。对羟基苯甲酸酯在0.1 ~ 20.0 mg/L时，其质量浓度与峰面积之间均存在良好的线性关系。
表1 对羟基苯甲酸酯的线性回归方程和检出限
Table 1 Linear regression equation and detection limits of p-hydroxybenzoates
Standard samples
MP EP IPP PP IBP BP
Linear range (mg/L)
0.1 ~ 20.0 0.1 ~ 20.0 0.1 ~ 20.0 0.1 ~ 20.0 0.1 ~ 20.0 0.1 ~ 20.0
Linear regression equation1) Y=3.63*103x+3.77*104 Y=4.15*103x+3.44*104 Y=1.79*103x+2.95*104 Y=2.60*103x+3.69*104 Y=1.62*103x+3.27*104 Y=2.12*103x+3.34*104
Correlation coefficient 0.9999 0.9999 0.9999 0.9999 0.9999 0.9999
LOD2) / (mg/L)
0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2
1）Y: peak area; X: mass concentration, mg/L. 2）LOD: limit of detection.
2.4.2 最低检测限的确定
在本实验条件下，以3倍基线噪声所对应的待测物浓度作为方法的最低检测限。根据信噪比（S/N=3）计算，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸丁酯的检测限分别为0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.2 mg/kg（表1）。 2.4.3 准确度和精密度
选取榨菜、果酱以及奶酪样品，分别按0.1，0.5，5.0和20.0 mg/kg添加水平进行对羟基苯甲酸酯类加标回收实验，同时做样品空白实验。样品经过预处理并经固相萃取柱净化后，通过高效液相色谱仪进行测定。榨菜样品中对羟基苯甲酸酯类加标回收的HPLC检测效果如图3所示。
图3 榨菜中添加6种对羟基苯甲酸酯色谱图
Fig. 3 Chromatograms of pickled mustard tuber added with 6 p-hydroxybenzoates standards
1. methyl p-hydroxybenzoate; 2. ethyl p-hydroxybenzoate; 3. propyl p-hydroxybenzoate; 4. isopropyl p-hydroxybenzoate;
5. butyl p-hydroxybenzoate; 6. isobutyl p-hydroxybenzoate
对各个样品在同一天内每一浓度平行测定6次，利用保留时间定性，采用外标法以样品加标进行校正，取平均值计算日内平均回收率，结果见表2。实验表明，本方法加标回收率比较稳定（82.8% ~ 115.5%），不同样品在不同加标水平上的回收率波动较小。
表2 食品中对羟基苯甲酸酯的加标回收结果(n=6) Table 2 Recoveries of p-hydroxybenzoates in foods (n=6)
p-Hydroxybenzoates
Added /(mg/kg) 0.1
MP
0.5 5.0 20.0
EP
0.1 0.5
Pickled mustard tuber
88.3 89.4 95.6 100.3 89.7 92.3
Average recovery/%
Jam 88.5 90.1 96.4 102.7 90.7 92.7
Cheese 86.8 90.7 95.2 100.3 95.2 93.1
5.0 20.0 0.1
IPP
0.5 5.0 20.0 0.1
PP
0.5 5.0 20.0 0.2
IBP
0.5 5.0 20.0 0.2
BP
0.5 5.0 20.0
96.0 104.3 91.3 97.3 104.8 109.1 86.5 94.1 94.6 97.5 85.0 89.3 94.8 95.2 85.3 86.9 92.6 93.5
98.5 106.3 91.3 97.4 107.8 115.5 94.3 92.6 102.6 102.0 85.8 89.8 94.8 94.6 86.3 88.6 92.2 93.0
96.7 105.6 90.8 97.5 105.1 109.7 85.5 93.5 95.0 97.7 87.5 92.8 95.2 94.8 82.8 86.8 93.2 93.8
根据不同水平加标回收率6次测定结果计算精密度，不同浓度的对羟基苯甲酸酯在榨菜、果酱和奶酪样品中的相对标准偏差分别为0.5％ ~ 6.8%，0.3％ ~ 5.4%和0.2％ ~ 5.9%，其精密度满足食品中对羟基苯甲酸酯类含量的分析要求。
表3 食品中对羟基苯甲酸酯的精密度结果(n=6)
Table 3 Precisions of the method for p-hydroxybenzoates in foods (n=6)
p-Hydroxybenzoates
Added /(mg/kg) 0.1
MP
0.5 5.0 20.0 0.1
EP
0.5 5.0 20.0 0.1
IPP
0.5 5.0 20.0 0.1
PP
0.5 5.0
Pickled mustard tuber
3.7 2.5 0.7 0.9 2.9 2.1 1.1 2.3 6.0 2.8 0.8 1.6 4.8 2.8 1.5
RSD/(%) Jam 3.0 2.4 0.4 0.5 2.5 1.6 0.7 0.3 1.9 1.0 1.3 0.6 2.7 2.0 2.2
Cheese 4.4 3.4 1.0 0.7 4.5 2.4 1.0 1.8 5.9 2.8 1.5 1.2 4.5 2.3 0.9
20.0 0.2
IBP
0.5 5.0 20.0 0.2
BP
0.5 5.0 20.0
0.7 5.8 3.4 1.3 0.8 6.8 3.2 1.0 0.5
0.8 5.4 4.8 2.0 1.0 5.1 3.1 1.6 1.3
0.5 4.8 1.5 1.1 0.3 4.0 1.7 1.0 0.2
3 结论
本文建立了固相萃取与高效液相色谱联合测定食品中对羟基苯甲酸酯类物质含量的方法。经过固相萃取预浓缩后，IBP和BP的检出限为0.2 mg/kg，而其余四种对羟基苯甲酸酯的检出限可达到0.1 mg/kg。该方法净化效果稳定，操作简单，结果准确，为质量检测部门对食品中对羟基苯甲酸酯类物质的检测提供了一种快速、有效的方法。
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