摘要：重金属和农药对水体造成的污染日益加重。利用LC50-24h作为1个毒性单位（Toxic Unit, TU），初步探讨了利用污染物对24-48h龄大型蚤急性毒性效应实现水体污染事故的应急监测。结果表明，氯化镉对大型蚤的LC50-24h为3.044mg/L，属于高毒类，在1, 2, 5, 10, 20, 50TU暴露下，高锰酸钾导致大型蚤半数死亡时间分别为24h、11.2h、8.7h、5.8h、4h和2.7h；
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灭多威对大型蚤的LC50-24h为9.851×10mg/L，属于高毒类，在1, 2, 5, 10, 20, 50TU暴露下，氯化锰导致大型蚤半数死亡时间分别为24h、6.3h、1.9h、0.5h、0.25h和0.05h。表明半数死亡时间与浓度呈现明显相关性。可以采用半数死亡时间表征水质变化程度，实现水体污染事故应急监测的定性和半定量分析。同时，大型蚤急性行为反应在对污染物定性方面具有一定优势。因此，基于氯化镉及灭多威对大型蚤急性毒性效应的水质应急监测技术可以对水质污染状况和程度实现原位快速检测。
关键词：氯化镉，灭多威，大型蚤，应急监测
The Emergency Monitoring of Cadmium Chloride and Methomyl Based on
Acute Toxic Effects of Daphnia magna* Abstract: In this study, LC50-24h was regarded as one TU to discuss the technology of
emergency monitoring of cadmium chloride and methomyl pollution used Daphnia magna with life stage of 24-48h. The results showed that the LC50-24h of cadmium chloride and methomyl
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was 3.044mg/L and 9.851×10mg/L respectively. In the exposure of 1, 2, 5, 10, 20, 50TU cadmium chloride, The Time of Half Lethal (THL) was 24h, 11.2h, 8.7h, 5.8h, 4h and 2.7h respectively, and in the exposure of 1, 2, 5, 10, 20, 50TU methomyl, THL was 24h, 6.3h, 1.9h, 0.5h, 0.25h and 0.05h respectively. It suggested that it was evident negative relationship between the exposure concentration and the half death time. THL could reflect the pollution level, and with the help of THL, qualitative and quantitative analysis could be made on the emergency accidents. Meanwhile, the behavioral responses of Daphnia magna could be used in the analysis of emergency accidents.
Key Words: cadmium chloride; methomyl; Daphnia magna; Emergency monitoring
1 引言
工农业生产的快速发展导致大量重金属和农药进入水体，不仅破坏了水生态系统平衡，造成重大经济损失，更对人类健康构成严重威胁。
氯化镉(cadmium chloride)作为一种高毒环境污染物，伴随工业的迅速发展，其生产和使用量不断增加。镉的摄入或吸入过量可引起呼吸疾病、神经障碍和肾损伤（魏筱红等，2007；Jessica et al，2009）,氯化镉可诱导骨骼肌的氧化应激反应（Claudia et al ,2005），引起许多原癌基因的诱发和抑制DNA修复系统(Giaginis et al.,2006; Waisberg et al., 2003)，并导致DNA损伤和细胞凋亡(曹锋等，2006；Chan andCheng,2003; Bagchi etal.,2000)，且具有生殖毒性（杨凡，2010），其毒性与抑制酶系统功能有关（任宗明，2008）。国际肿瘤研究机构（IARC）阐明镉及其化合物对人类和实验动物具有致癌作用(IARC,1997)。灭多威(Methomyl)是一种高毒性的氨基甲酸酯类杀虫剂，主要作用于乙酰胆碱酯酶（Ache），引起神经毒性（阳冬梅等，2000；张凯，2003），且对线粒体中的酶系统产生破坏（许名飞，2001）。
因此，对水体实时评价是避免重金属和农药过量导致生物毒性效应的有效措施。但在水体重金属和农药含量突发性升高的情况下，目前尚无有效措施对其实现原位、实时的应急监测，缺乏相关应急预案和措施的技术支持。
大型蚤（Daphnia magna）是一种小型枝角类动物，易于实验室培养，并对水体内化学物质的变化非常敏感（Martins et al.,2006），目前在国内外被广泛应用于水质监测中（Duquesne et al.,2010；Johnston et al.,1994；Villarroel et al.,2003）。
本研究首先探讨了以氯化镉和灭多威为代表的重金属及农药对大型蚤急性毒性效应，并希望通过大型蚤在一定污染物浓度暴露下的半数死亡时间（Time of Half Lethal, THL）表征水体污染程度，探讨水体重金属和农药含量突发变化下的应急监测技术。 2 材料与方法
2.1 生物培养
大型蚤（Daphnia magna）的培养参照文献和文献进行，培养温度为（22±2）℃，光照强度为3000-4000lx，光照周期为16L：8D。培养用水为经自然曝气三天以上的自来水，pH为7.8±0.2，硬度以CaCO3 计为（250±25）mg/L，试验周期内喂食斜生栅藻（Senedesmus obl iqnus）。实验采用蚤龄为24-48小时的大型蚤进行。 2.2 试验设计
试验中采用的氯化镉购自北京化学试剂中心，分析纯（纯度≥99.5%）；灭多威购自北京中联化工厂，分析纯（纯度≥99.0%）。
用培养液作为对照和稀释用水，24h急性毒性实验参照ISO国际标准进行（ISO，1996），采用静水环境暴露及监测大型蚤的行为反应。
结合相关报道，氯化镉及灭多威对大型蚤LC50-24h分别为84ug/L（Pawlaczyk et al.,1972）和34.5mg/L（Donald et al.,1991），因此，在24小时暴露浓度设定中，采用1 mg/L、2 mg/L、4mg/L、8 mg/L、16mg/L氯化镉及0.421 g/L、0.527 g/L、0.661 g/L、0.829 g/L、1.04g/L MC进行暴露，确定不同物质对大型蚤的24小时半数致死剂量（50% Lethal Concentration，LC50-24h）。实验过程中，采用5个平行，每个平行5只幼蚤，采用1个空白对照，实验期间不喂食，用概率单位法求出LC50-24h。
结合水体污染物应急监测需要，试验中采用污染物对大型蚤的LC50-24h作为1个毒性
单位TU（Toxic Unit）实现不同污染物LC50-24h的量化统一，并分别进行1TU、2TU、5TU、10TU、20TU和50TU暴露下半数大型蚤半数死亡所需时间（Time of Half Lethal, THL），同时分析污染物浓度与THL之间关系。
枝角摆动频率和翻转次数作为大型蚤表现毒性效应的重要指标。本研究中，判断不同水体暴露对大型蚤产生毒性效应的标准是：暴露过程中出现第一只大型蚤死亡。枝角摆动频率和翻转次数研究方法是在污染物对大型蚤产生毒性效应以后，立即对其余大型蚤分别进行计数，并取平均值（计数过程中死亡大型蚤不计入内）。 2.3统计方法
氯化镉和灭多威对大型蚤的急性毒性效应分析通过origin8.0软件采用概率单位法统计，在线监测数据通过Microsoft Office Excel2003进行分析，采用SPSS17.0软件进行数据统计处理。 3结果与分析
3.1 氯化镉、灭多威对大型蚤的急性毒性效应
不同浓度氯化镉和灭多威暴露对大型蚤的死亡率影响如表1所示，概率单位法计算表
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明氯化镉对大型蚤的LC50-24h为3.044mg/L，灭多威对大型蚤的LC50-24h为9.851×10mg/L。结果显示，氯化镉为，灭多威系高度类。结合致毒机理分析，氯化镉的致死性源于镉离子通过置换出细胞内酶类金属，降低机体抗氧化酶活性，引起机体氧化损伤（刁书永，2005）。灭多威毒性效应可能由于其与胆碱酯酶的阴离子点和酶点相结合形成复合物，从而抑制胆碱酯酶活性，这种结合是可逆的（王淑琴，1991）。
表1 24小时暴露中氯化镉和灭多威对大型蚤的急性毒性效应
Table1 Acute toxic effects of cadmium chloride and methomyl on Daphnia magna in 24h exposure
污染物
浓度（mg/L）
1 2
氯化镉
4 8 16 421 527
灭多威
661 829 1040
死亡率（%）
4 36 60 92 100 12 44 68 88 96
基于上述污染物对大型蚤的LC50-24h，并将LC50-24h作为污染物对大型蚤的1个毒性单位TU（Toxic Unit），分别进行氯化镉及灭多威1TU、2TU、5TU、10TU、20TU和50TU暴露下大型蚤半数死亡所需时间（Time of Half Lethal, THL）的研究，探讨并建立不同污染物浓度与大型蚤半数死亡所需时间（THL）之间的关系模型，并希望通过该比对模型，用于水体突发污染事故的应急监测分析，实现水体污染事故定性及污染物半定量分析，完成水体突发事故原位快速检测。
氯化镉、灭多威不同浓度暴露与大型蚤半数死亡时间（THL）关系分别如图1所示。结果显示，大型蚤THL与氯化镉、灭多威暴露浓度（x）均存在显著的幂指数关系
（±）
THL（PP）=14.73（±0.015）x-0.9060.0007，R2=0.941；
（±）
THL（MC）=21.64（±0.332）x-1.0640.0016，R2=0.989；
说明大型蚤的存活时间与环境压力大小直接相关。因此，结合该结果，在水体突发性事故应急监测中，可以通过受试水体的实测THL值与模型数据THL值的比对进行污染物半定量分析，根据受试水体测得的THL值反推受试水体污染与否以及污染程度，从而实现水体突发性污染事故危害程度的推断。不同污染物暴露下的关系模型是不同的，说明不同作用机理导致大型蚤THL有明显区别。
2520氯化镉灭多威时间(小时)15105001020浓度(TU)图1 PP不同TU暴露对大型蚤半数死亡时间（THL）的影响
Fig.1 THL of Daphnia magna exposed to PP and MC
304050
3.2 氯化镉、灭多威暴露下大型蚤的行为反应
氯化镉暴露中对照组大型蚤运动形态正常，暴露组大型蚤进入溶液后运动频率短时间内较高，之后出现较普遍的翻转运动，一段时间后蚤的触角有弯度，沉底后的蚤做类似“爬行”和“平躺”前行的运动，并且蚤体逐渐发白，然后死亡。在灭多威暴露中，对照组大型蚤运动形态正常，实验组大型蚤初期运动较缓慢，之后出现大幅度流畅的乱窜，做不规则的翻转运动，不断变换角度方向，运动形态焦躁，后运动过程中出现静止现象，不规则翻转变得一顿一顿，之后有大型蚤沉入烧杯底部，可见心脏快速跳动，再跳起做不规则翻转，静止几秒后死亡。
氯化镉、灭多威不同TU暴露对大型蚤枝角摆动的影响如图2所示，氯化镉、灭多威浓度与大型蚤一分钟枝角摆动次数均呈显著相关（p<0.01，r=0.955；p<0.01，r=0.923），并呈明显线性关系（y（PP）=161.70+1.09x，R2=0.890；y（MC）=160.15+1.17x，R2=0.814）。图3为氯化镉、灭多威不同TU暴露下大型蚤翻转运动的影响，结果显示，氯化镉、灭多威浓度和大型蚤一分钟翻转次数均呈显著相关（p<0.01,r=0.953；p<0.01,r=0.949），并呈明显线性关系
22
（y（PP）=8.52+1.02x，R=0.890；y（MC）=20.04+1.72x，R=0.881）在同一效应点，灭多威暴露下的大型蚤翻转次数较多。
250200氯化镉灭多威枝角摆动(次数)150100500125浓度(TU)102050
图2 PP、MC暴露对大型蚤枝角摆动的影响
Fig.2 Effects of PP and MC on the antenna swing of Daphnia magna
120氯化镉100灭多威翻转(次数)80604020001020浓度(TU)图3 PP、MC暴露对大型蚤翻转运动的影响
Fig.3 Effects of PP and MC on the non-linear movement of Daphnia magna
304050
由此可见，污染物对大型蚤产生毒性效应后，大型蚤不同行为指标变化与污染物浓度直接相关，既有明显的相似性变化趋势，又有明显不同。首先，在不同指标变化趋势上，都会随着暴露浓度的升高出现明显的相似变化趋势。而通过对指标变化程度分析，氯化镉和灭多威暴露中大型蚤翻转运动次数具有明显差异，相关变化特征应该与污染物的不同毒性作用机理有关系。
4 结论
常规的水质监测方法耗费大量时间，容易造成漏检（程炜轩，2009），监测获得的理化数据并不能直接反应水生动物和生态系统受危害程度，因此很难实现对水体突发性污染事故的在线监测（任宗明，2008）。为了避免国家和人民财产受到损害、公众健康受到威胁，有必要在水质在线监测基础上，构建一套快速原位应测技术，以实现水体污染事故的应急监测分析。
本研究旨在建立基于生物毒性测试的水质安全评估技术，通过原位生物测试方法实现水质快速应急检测，缩短常规检测所需周期，为针对污染事故的应急措施提供理论支持。结果表明，在生物预警基础上，THL比对模型的建立有助于实现污染事故的原位应急监测中污染程度的快速分析，同时结合污染物致毒机理对生物行为指标的变化研究，有助于实现污染事故半定量应急监测基础上对污染物性质的进一步分析，至此解决污染与否、何种污染物、污染物量化分析三个问题。因此，THL比对模型、生物行为指标分析和结合污染源调查的污染物理化特征分析三者有希望共同构成一套完整的基于生物毒性测试的水质水体污染事故的应急监测技术。
水体污染物种类繁多，有必要结合后续研究，探讨更多污染物与不同生物THL及行为变化之间的关系模型，构建完整THL比对模型数据库，并准确应用到水体突发污染事故的应急监测中，实现水体突发事故的定性及污染物半定量分析。 References
Duquesne S, Kuster E. 2010. Biochemical, metabolic, and behavioural responses and recovery of Daphnia magna after exposure to an organophosphate [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 73(3): 353-359
Examination of cadmium-induced expression of the small heat shock protein gene, hsp30, in Xenopus laevis A6 kidney epithelial cells
Johnston N A L, Campagna V S, Hawkins P R, Banens R J. 1994. Response of the eastern rainbowfish (Melanotaenia duboulayi) to toxic Microcystis aeruginosa[J]. Australian Journal of Marine and Freshwater Research, 45(5): 917-923
Acute, chronic and sublethal effects of the herbicide propanil on Daphnia magna【J】。M.J. Villarroel,
E. Sancho, M.D. Ferrando , E. Andreu2003。Chemosphere.53(8):857-864
镉的毒性及危害
镉致DNA损伤及对原癌基因蛋白表达的影响
灭多威对美洲大蠊
灭多威染毒家兔周围神经功能的变化 灭多威对美国棉铃虫细胞的抑制作用研究
氰戊菊酯和氯化镉暴露下日本青鳉的行为反应差异 镉对小鼠睾丸生殖细胞的遗传毒性 镉中毒机理研究进展
灭多威的毒理学研究
Martins J, Soares M L, Saker M L, OlivaTeles L, Vasconcelos V M. 2006. Phototactic behavior in Daphnia magna Straus as an indicator of toxicants in the aquatic environment [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 67(3): 417-422
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