基于CRISPR/Cas9 技术构建原位敲入亨廷顿病（HD）小鼠模型

作者：彭怡 王柏彬 付彬 徐兴然

来源：《江苏科技信息》 2018年第30期

摘要：目的：探究CRISPR/Cas9技术在建立亨廷顿病（Huntington’s Disease，HD）原位敲入小鼠模型中的运用。方法：首先，设计gRNA靶点序列（Htt gRNA）并检测其体外Cas9酶切活性，选择活性较好的一对备用。其次，利用全基因合成具有150Q（150个CAG重复）的Donor序列。然后将Cas9 mRNA，Htt-L3 gRNA，Htt-R3 gRNA 和Donor DNA混合均匀进行胚胎显微注射，再将胚胎移植到受体小鼠中备孕。待小鼠出生后，鉴定F0代及其子代F1，F2，F3代的基因型。结果：F0，F1，F2及F3代小鼠基因组上均出现150Q的准确敲入，且子代稳定遗传。结论：在不改变小鼠HD基因表达调控的基础上，仅改变其特定致病基因的长度，利用CRISPR/Cas9技术成功构建HD原位敲入小鼠模型，为进一步模拟人类HD缓慢且迟发的发病过程及后续临床治疗研究拓展了HD模型。

关键词：亨廷顿病；CRISPR/Cas9；原位敲入；小鼠模型；150Q

中图分类号：Q789 文献标识码：A

0 引言

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s Disease，HD）属于一种神经退行性疾病，随着年龄增长患者会出现神经功能性退化或障碍，主要表现在认知、运动、感官等上的缓慢衰退。研究认为HD的发病原因主要是由于人4号常染色体上Htt（IT15）基因的Exon1内发生谷氨酰胺（CAG）的突变加长，导致亨廷顿突变蛋白（mHTT）错误折叠，引起细胞病变坏死［1］。

CRISPR/Cas9系统是第三代人工核酸内切酶，该技术构建简单，打靶效率较高，适用物种较为广泛，目前已成为现阶段进行基因编辑研究的热门工具之一。相比前两代系统，

CRISPR/Cas9最大优势是可以在靶点区域的特定位点形成一个单链切口，这不仅可以降低诱导基因修复的非同源末端连接（NonHomology End Joining, NHEJ）的概率，还可以激活细胞的同源重组修复机制（Homologous Recombination,HR）。这种特性既降低了脱靶风险，同时又供给HR需要的目标Donor 质粒，大大增加了目的基因的突变概率［2］。

目前，对于HD疾病模型的构建有很多，包括非人类灵长类动物HD疾病转基因模型的构建［3］，HD疾病敲入猪模型的构建［4］，HD疾病小鼠模型的构建［5］等。由于小鼠HD模型造价相对低廉、模型相对有效等优点，更受研究者们的青睐。本研究利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Htt（IT15）基因上原位敲入一段包含150Q长度的HD致病基因，构建HD敲入小鼠模型，近似地模拟人类HD疾病发病机制，为进一步探究HD的发病机制和HD的治疗方法提供一定的帮助。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（北京唯尚立德生物科技有限公司），琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司），Mouse Tail DNA Mini Kit（成都福际生物技术有限公司），氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物（OXOID生物技术公司），琼脂、GoldView、

Ampicillin（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），pMD19-T载体、IPTG、X-Gal（Takara），KOD FX（TOYOBO），金牌Mix（green）TSE101、琼脂糖（北京擎科新业生物技术有限公司），DNA Marker（北京博迈德基因技术有限公司）。

1.1.2 仪器

超低温冰箱（Thermo公司）；高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；单人单面垂直流生物型超净工作台（上海天呈实验仪器制造有限公司）；全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；恒温振荡器（太仓市文尔惠金实验仪器厂）；涡旋振荡器（上海骥辉科学分析仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；PCR仪（BIO-RAD）；电泳仪（BIORAD）；凝胶成像仪（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9靶点设计及其体外Cas9酶切活性检测

利用GenBank基因信息和CRISPR/Cas9的gRNA靶点设计分析网站，设计了4对靶点序列，并对这4对序列进行体外Cas9酶切活性检测。根据Cas9/gRNA的活性结果及靶点位置，本实验室最终选用了活性较高的靶点序列Htt-L3（CAAGATGGCTGAGCGCCTTGG）和Htt-R3（CGGGAAAGCCTGGCCTCAGGG）进行后续试验［6］。

1.2.2 150Q Donor序列的构建

在不改变C57小鼠其他基因碱基序列的情况下，根据其IT15基因信息，设计150Q（150个CAG重复）Donor基因片段，序列如下：

ATCCTCTTGCTTGGCCCTCTTCACTAAGGGGGGCTGGCTTTTGCGGGAAGGGGCGGGGCCACATCGGCGGGGCGGAGAGTCTTAAACTAGCAGAGGCCCCGCAGGCCTGCGTCCTGACTTCGGGAAAGAGGACGACGCATCCGCCTGTCAATTCTGCGGGTCTGGCGTGGCCTCGTCTCCGCCGGCATGACGTCACGGGACGCACTCGCCGCGAGGGTTGCCGGGACGGGCCCAAGATGGCTGAGCGCCTTCCTTCCGCTTCTGCCTGCCGCGCAGAGCCCCATTCATTGCCTTGCTGCTAAGTGGCGCCGCGTAGTGCCAGTAGGCTCCAAGTCTTCAGGGTCTGTCCCATCGGGCAGGAAGCCGTCATGGCAACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCTTTCGAGTCGCTCAAGTCGTTTCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCCACCGCCGCAGGCGCCGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCTCCGCCTCAACCCCCTCAGCCGCCGCCTCAGGGGCAGCCGCCGCCGCCACCACCGCCGCTGCCAGGTCCGGCAGAGGAACCGCTGCACCGACCGTGAGTCCGGGCGCCGCAGCTCCCGCCCGGGCCCCGCGCCCCTGGCCTGCGTGCTGGGCATGGCCAACACTGTTCCCTGTCCAGAGGGTCGCGGTACCTGGCTGAGGCCAGGCTTTCCCGGCCCGGGCCCTCGTCTTGCGGGGTCTCTGGCCTCCCTCAGAGGAGACAGAGCCGGGTCAGGCCAGCCAGGGACTCGCTGAGGGGCGTCACGACTCCAGTGCCTTCGCCGTTCCCAGTTTGCGAAGTTAGGGAACGAACTTGTTTCTCTCTTCTGGAGAAACTGGGGCGGTGGCGCACATGACTGTTGTGAAGAGAACTTGGAGAGGCAGAGATCTCTAGGGTTACCTCCTCATCAGGCCTAAGAGCTGGGAGTGCAGGACAGCGTGAGAGATGTGCGGGTAGTGGATGACATAA将上述Donor序列委托北京唯尚立德生物科技有限公司进行全基因合成，共计1 414bp。其中，下划线部分为150Q的碱基序列位置。

1.2.3 显微注射

显微注射组分准备。以全基因合成的Donor序列为模板，设计上游引物Htt-F：

ATCCTCTTGCTTGGCCCTCTTC；下游引物Htt-R：TTATGTCATCCACTACCCGCAC，按照如表1所示的反

应体系和条件进行PCR。将PCR产物经琼脂糖凝胶纯化回收后，测定浓度，作为后续显微注射的Donor DNA。按照表2进行显微注射组分配制，将配制好的组分进行4 ℃高速离心，10min后取出15 μL进行后续显微注射实验。

超排：对身体健康4周龄的C57雌鼠进行浓度为10个单位的孕马血清促性腺激素（PMSG）注射，剂量0.2 mL。间隔48小时，再进行浓度为10个单位的人绒毛膜促性腺激素（HCG）注射，剂量0.2 mL。然后将注射后的雌鼠和雄鼠进行交配，次日将见栓老鼠取出。胚胎准备：将见栓老鼠处以安乐死，取出输卵管，置于平皿上的胚胎培养基液滴中。用尖镊将输卵管划破，取出卵团，用透明质酸酶进行消化，去除多余细胞，将卵清洗干净置于胚胎培养基中培养。

显微注射流程：将胚胎固定于固定针上，在注射针中吸取注射组分，调整焦距、注射压力、注射时间后，将注射针扎入胚胎，点击鼠标完成注射。

1.2.4 胚胎移植

受体准备：选取ICR品系8周龄雌鼠作为受体，在移植前一天将发情雌鼠与结扎雄鼠交配，第二天挑选见栓受体备用。

胚胎移植流程：将受体雌鼠进行麻醉后，用理发器除去两侧脊部偏下方毛发，并用70％酒精进行消毒。将胚胎置于干净培养基中清洗，用移植针吸入胚胎后，备用。剪开小鼠皮肤，于显微镜下观察输卵管，用显微剪剪一个口，将吸好胚胎的移植针轻轻插入，慢慢将胚胎吹入。移植完毕将伤口缝合好，送到动物饲养间进行喂养。移植后的小鼠预计20天后生出F0代。F0代小鼠的显微注射与胚胎移植工作与北京唯尚立德生物科技有限公司合作完成。

1.2.5 小鼠出生及其基因型鉴定

对小鼠基本情况进行记录，并用耳标进行标记。用Mouse Tail DNA Mini Kit（货号：DE-05211）进行基因组提取，并将DNA 保存至-20 ℃冰箱中。根据150Q Donor片段在小鼠基因组的敲入位点，设计了相应的上游引物11-5F：GACGACGCATCCGCCTGTCAATTCTG；下游引物11-6R: CTCCAGAAGAGAGAAACAAGTTCGTTC。按照表3的反应体系及条件进行小鼠基因型鉴定，将PCR产物纯化回收后进行TA-克隆，挑选单菌落进行测序，进一步验证基因型。

2 结果

2.1 F0代小鼠基因型鉴定

如表4所示，经过显微注射和胚胎移植后，共有6只F0代小鼠出生。经过PCR电泳鉴定（见图1）及测序，确定2号和3号小鼠基因型正确。

2.2 子代小鼠基因型鉴定

F1代小鼠情况如表5所示，将基因型正确的F1代小鼠与野生型C57小鼠交配。截至2018年4月30日，共有81只F2代小鼠出生（见表6），将基因型正确的F2代小鼠进行相互交配，希望可以培育出F3代纯合子小鼠。截至2018年7月1日，共有18只F3代小鼠出生（见表7），但这11只小鼠中并没有纯合子，故2018年7月31日将F2代基因型正确的小鼠再次进行交配。

如图2所示，使用引物对11-5F和11-6R扩增小鼠基因组，正确敲入150Q小鼠的电泳条带在1 147 bp，而未敲入小鼠的电泳条带在718 bp。图中显示两条带则表明该敲入小鼠为杂合子。图3测序结果中，52 bp~72 bp为野生型小鼠的7Q靶点位置，52 bp~501 bp为150Q小鼠正确敲入的靶点位置。经过对子代小鼠基因型鉴定结果表明，150Q碱基序列不仅正确敲入C57小鼠IT15基因靶点位置，还能够稳定遗传，150Q原位敲入小鼠模型构建成功。

3 讨论

根据疾病模型不同的性质和目的，目前HD小鼠模型构建方法主要有两种，一种是转基因小鼠模型，另一种是基因敲入小鼠模型［7］。

转基因小鼠模型：将转基因随机插入基因组中作为外源基因，并在外源启动子下表达的模型。R6/2是目前被广泛研究的HD小鼠模型之一，Mangiarini等［8］

通过源自HD患者噬菌体基因组克隆中分离出的HD基因5′ 末端的1.9 kb SacI-EcoRI 片段构建了R6/2小鼠模型，该模型能表现出明显的HD症状，包括舞蹈样运动、震颤和癫痫等，经检测其转基因小鼠中携带CAG重复片段个数在115~150。Hodgson等［9］利用酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome，YAC）克隆改造，分别构建了18Q，46Q，72Q的YAC小鼠模型，模拟了正常人类（含有18个CAG重复）、HD成人发病（含有46个CAG重复）、HD幼年发病（含有72个CAG重复）3种不同情况。Gray等［10］则利用细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）通过Cre 重组酶切断全长突变的亨廷顿蛋白

（fulllengthmutant huntingtin，fl-mHtt）基因，替换掉原Htt基因外显子1的部分，构建了BACHD转基因小鼠模型。这些转基因模型通过提供外源基因，或者提供外源启动子使得原基因上的调控元件过表达，以此实现HD转基因动物模型的构建。

基因敲入小鼠模型：通过改变特定内源基因建立模型。Menalled等［11］通过将靶向构建含有neo新霉素抗性基因标记和140Q突变片度的质粒载体与小鼠Hdh基因直接进行同源重组，得到重组后的靶向Hdh等位基因，再将其导入胚胎干细胞中进行培养，最后囊胚注射到C57 小鼠中构建了HD 敲入小鼠模型。

Lin等［12］利用双重置换基因靶向方式，首先使用选择性标记Hprt以同源重组的方式替换掉小鼠Hdh基因的外显子1，然后再以同源重组的方式将更长CAG重复片段的Hdh基因替换掉Hprt标记，成功构建了HD敲入小鼠模型。Woodman等［13-15］通过比较HD敲入小鼠模型和转基因小鼠模型之间的异同，发现敲入模型小鼠的行为学异常表现与转基因小鼠相似，但相比转基因小鼠而言，敲入小鼠表现出更为迟发性的HD表型，这些病症表现都较轻，且发病时间较晚，一般12个月甚至更长时间才表现出轻微HD症状。

目前对于HD疾病的小鼠模型构建有很多，而利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行原位基因敲入的HD小鼠模型仍需进一步完善。本实验室构建的150Q原位敲入小鼠模型不添加条件表达原件及其他筛选标记，仅改变了小鼠Htt基因（IT15）外显子1内CAG密码子的长度，通过改

变其内源性致病基因的长度来模拟HD疾病。接下来本实验室将继续开展F3代纯合子小鼠的培育工作，比较纯合子（HD150Q+/150Q+）和杂合子（HD150Q+/7Q+）小鼠的发病时间及其病态行为学等之间的异同。希望通过此种HD模型找到HD基因敲入小鼠模型发病晚于HD转基因小鼠模型的原因，为进一步探究有效的疾病治疗方法提供新帮助。

参考文献

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（责任编辑王雪芬）