(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104080477 A(43)申请公布日 2014.10.01
(21)申请号 201280042725.6(22)申请日 2012.06.29(30)优先权数据
61/503,790 2011.07.01 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.03.03
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2012/044814 2012.06.29(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/006401 EN 2013.01.10(71)申请人因波特医疗股份有限公司
地址美国加利福尼亚州(72)发明人D.H.戴维斯 X.梁 P.菲尔格纳(74)专利代理机构北京市柳沈律师事务所
11105
代理人张文辉
(51)Int.Cl.
A61K 39/395(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/00(2006.01)
权利要求书2页 说明书17页 附图5页权利要求书2页 说明书17页 附图5页
(54)发明名称
用于诊断和治疗单纯疱疹病毒1和2型的蛋白质抗原的方法和组合物(57)摘要
涵盖的组合物、装置和方法涉及来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的多种抗原及其在疫苗、治疗剂和各种诊断测试中的用途。在特别优选的方面，抗原是免疫显性的，并且就病原体感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对反应性，和/或具有已知的与疾病参数的关联。CN 104080477 A CN 104080477 A
权 利 要 求 书
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1.一种抗原组合物，其包含：
多种与载体结合的抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原就受HSV-1感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对抗体反应性；
其中所述至少两种抗原具有已知的与疾病参数的关联；且其中所述多种抗原选自下组：US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44，或其片段。
2.权利要求1的抗原组合物，其中所述已知反应性以反应性强度为特征。3.权利要求1的抗原组合物，其中所述已知反应性以所述疾病的活性状态为特征。4.权利要求1的抗原组合物，其中所述参数选自下组：先前或目前对病原体的暴露，用病原体的急性感染，用病原体的潜在性或复发感染，和对用病原体感染的至少部分免疫。
5.权利要求1的抗原组合物，其中针对所述至少两种抗原的抗体存在于暴露于所述至少两种抗原的群体的至少40%中，且任选地，其中患者中生成的针对所述至少两种抗原的抗体的平均结合亲和力和平均数量中至少一项在所述患者中生成的抗体的结合亲和力和数量的上部三分位数(upper tertile)中。
6.权利要求1的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的先前感染，且其中所述多种抗原选自下组：US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44，或其片段。
7.权利要求1的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的急性感染，且其中所述多种抗原选自下组：US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44，或其片段。
8.权利要求1的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的潜在性感染，且其中所述多种抗原选自下组：US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44，或其片段。
9.权利要求1的抗原组合物，其中所述载体是药学可接受载体，且其中所述组合物配制为疫苗。
10.权利要求9的抗原组合物，其中所述疫苗包含至少4种抗原。11.权利要求9的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是重组的。12.权利要求9的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是至少部分纯化的。13.权利要求1的抗原组合物，其中所述载体是固体载体，且其中所述多种抗原在阵列中的所述载体上布置。
14.权利要求13的抗原组合物，其中每种所述抗原以大于60%的纯度存在。15.权利要求13的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是重组的。16.权利要求13的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是至少部分纯化的。17.一种抗原组合物，其包含：
多种与载体结合的抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原就受HSV-2感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对抗体反应性；
其中所述至少两种抗原具有已知的与疾病参数的关联；且其中所述多种抗原选自下组：UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11，或其片段。
18.权利要求17的抗原组合物，其中所述已知反应性以反应性强度为特征。19.权利要求17的抗原组合物，其中所述已知反应性以所述疾病的活性状态为特征。
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权 利 要 求 书
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20.权利要求17的抗原组合物，其中所述参数选自下组：先前或目前对病原体的暴露，急性、潜在性或复发感染，和对用病原体感染的至少部分免疫。
21.权利要求17的抗原组合物，其中所述至少两种抗原存在于暴露于所述至少两种抗原的群体的至少40%中，且任选地，其中患者中生成的针对所述至少两种抗原的抗体的平均结合亲和力和平均数量中至少一项在所述患者中生成的抗体的结合亲和力和数量的上部三分位数中。
22.权利要求17的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的先前感染，且其中所述多种抗原选自下组：UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11，或其片段。
23.权利要求17的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的急性感染，且其中所述多种抗原选自下组：UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11或其片段。
24.权利要求17的抗原组合物，其中所述疾病参数是HSV的潜在性感染，且其中所述多种抗原选自下组：UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11或其片段。
25.权利要求17的抗原组合物，其中所述载体是药学可接受载体，且其中所述组合物配制为疫苗。
26.权利要求25的抗原组合物，其中所述疫苗包含至少4种抗原。27.权利要求25的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是重组的。28.权利要求25的抗原组合物，其中所述抗原或其片段是至少部分纯化的。29.权利要求17的抗原组合物，其中所述载体是固体载体，且其中所述多种抗原在阵列中的所述载体上布置。
30.权利要求25的抗原组合物，其中每种所述抗原以大于60%的纯度存在。31.一种抗原组合物，其包含：
多种与载体结合的抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原就受HSV-1和HSV-2两者感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对抗体反应性；
其中所述至少两种抗原具有已知的与疾病参数的关联；且其中所述多种抗原选自下组：对于HSV-1为US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44或其片段，和对于HSV-2为UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11或其片段。
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说 明 书
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用于诊断和治疗单纯疱疹病毒1和2型的蛋白质抗原的方
法和组合物
[0001]
本申请要求2011年7月1日提交的具有流水号61/503790的我们悬而未决的美
国临时申请的优先权。
发明领域
[0002] 本发明的领域是涉及单纯疱疹的选择抗原的组合物和方法，尤其由于它们涉及其在诊断、治疗和治疗性组合物中的用途。[0003] 发明背景
[0004] 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是能够感染哺乳动物和禽类两者的病毒。HSV1和2型是人发病率的重大原因。HSV-2是性传播的，并且是大多数复发性生殖器疱疹损伤的成因剂。HSV-2感染与升高的妊娠风险有关，所述妊娠风险包括自然流产，早产，和病毒对新生儿的先天性感染。另外，HSV-2的感染在暴露于HIV时也与升高的感染风险有关。不幸地，HSV-2感染经常是无症状的，并且大多数受感染的个体不知道他们被感染。对HSV-2状态的这种无知是传播给未感染配偶的主要促成因素。比较而言，HSV-1通常在童年期间传播，并且主要与导致“感冒疮(cold sores)”的口唇(orolabial)感染有关。然而，HSV-1可以引起角膜感染，其可以导致失明。不幸地，损伤的此种差别分布不足以区别HSV-1和HSV-2。
[0005] HSV-1和HSV-2两者都在其宿主中建立终身的潜在性感染。这些感染以感染的周期性再活化和所得的病毒脱落为特征。由于HSV-1和HSV-2感染的不同天然史和后果，精确诊断HSV型对于患者管理和预后，以及对于控制潜在传播是重要的。例如，知道特定的HSV型可以帮助患者采取适当的防范以防止疾病传播给他人。具体地，未被认出的HSV-2感染的鉴定可以用于注意监测妊娠期间的病毒脱落，由此使先天性感染的风险最小化。[0006] 作为HSV定型(typing)的其它复杂情况，HSV-1和HSV-2显示紧密的氨基酸序列同源性，因此展现出广泛的抗原性交叉反应性。少数抗原是足够趋异的，使得它们容许区别HSV-1和HSV-2感染，尽管仅HSV-1和-2的US4/糖蛋白G(gG)足够趋异以提供有用的灵敏性和特异性参数。目前的诊断方法包括酶联免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)，及类似的测试形式。一种此类测试记载于美国专利No.6,265,176，其中表征了患者抗体对固定化HSV抗原的结合。此类测试一般表征患者对病毒的免疫应答，并且因此经常利用来自HSV-1和HSV-2的重组抗原。例如，EP1 982 993 A2描述了多聚体融合肽的用途，所述多聚体融合肽掺入糖蛋白G的部分以检测HSV-1和HSV-2。本文中讨论的这些和所有其它外来材料通过提及完整并入。在并入参考文献中的定义或术语的使用与本文中提供的所述术语的定义不一致或矛盾的情况中，适用本文中提供的所述术语的定义，并且参考文献中
得到FDA批准的唯一测试基于gG-1和gG-2反应性。含的所述术语的定义不适用。目前，
糊的结果在此类测试基于单一诊断性抗原的使用时是常见的，因为不同的感染患者可以具有不同水平的免疫应答。虽然基于gG的测试显示卓越的特异性，就像任何单一抗原测试一样，但是有风险从仅缺乏针对gG的抗体的感染个体获得假阴性结果。因此，随访测试，诸如
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说 明 书
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全病毒Western印迹可能是精确诊断需要的。不幸地，目前的测试方法仅产生部分有用的结果。此类部分表征的平台上的测试性能广泛变化，并且交叉反应性可以容易地从此类复杂混合物产生假阳性结果。
[0007] 响应HIV感染的高流行性和潜在负面后果，已经尝试开发疫苗。此类开发需要鉴定不仅对HSV特异性，而且还具有抗原性且能够产生保护性免疫应答的抗原。例如，美国专利申请No.2004/241182A1公开了HSV-2蛋白，其鉴定为有抗原性且筛选T细胞活化以用于疫苗。类似地，EP2 272 859 A2描述了与佐剂一起使用HSV-2肽，所述佐剂选择为诱导Th1型免疫应答。WO2004/026265A2中描述了不同的办法，其利用在引入哺乳动物中时导致肽表达的遗传构建体。此类遗传构建体从HSV-1序列文库生成，以诱导免疫应答。后续用HSV-1对动物的攻击用于鉴定产生保护性免疫应答的构建体。虽然此类办法在鉴定免疫原性且保护性抗原中具有至少一些效用，然而，其必需限于生成已经经历真核加工，例如糖基化和陪伴蛋白辅助折叠的肽和蛋白质。此类肽和蛋白质可能难以大规模生成，因为此类方法一般牵涉化学合成或使用容易培养的遗传修饰细菌。[0008] 因此，仍然存在对提供与HSV相关的诊断和治疗应用的抗原和抗体检测和监测的改善的组合物和方法的较大的、未满足的需要。[0009] 发明概述
[0010] 在解决与HSV相关的诊断和治疗应用的抗原和抗体检测和监测的改善的组合物和方法的需要中，本发明人利用蛋白质组微阵列方法来对针对多种HSV蛋白的感染期间的抗体应答确定概况，以鉴定生成具有高亲和力和特异性的抗体的抗原，所述抗体可以具有更精确的血清诊断和治疗效果。[0011] 生成蛋白质组微阵列，其展示由HSV-1和HSV-2编码的每种蛋白质，如基于大肠杆菌(E.coli)的可读框(ORF)体外转录/翻译中表达的。用来自一组眼和/或生殖器疱疹感染患者的血清筛选如此生成的微阵列，所述血清已经使用基于gG-1和gG-2的商业HSV血清分型试剂盒测定血清型。令人惊讶地，此分析证明了虽然HSV-1血清阳性供体与阵列上的HSV-1抗原良好起反应，并且证明了与HSV-2抗原的最小活性，HSV-2血清阳性供体与HSV-2和HSV-1抗原两者良好起反应。如此，虽然存在有由HSV-2血清阳性供体特异性识别的几种HSV-2抗原，但是HSV-1血清阳性供体仅特异性识别HSV-1US8(糖蛋白E)。发现表征受感染的个体对HSV的抗体应答的多重蛋白质组学方法，其中与高度特异性抗原结合使用高度敏感性抗原。以发明人所知，表征对HSV感染的应答的此类多重方法先前尚未尝试。利用本文中公开的多重测试，发明人发现了特定的且交叉反应性抗原，其对目前测试方法提供改善的灵敏性和特异性，所述目前测试方法仅依赖于类型特异性抗原，并且可以产生较高的假阴性率。另外，本文中公开的多重测试可以在单一测试中诊断HSV-1和HSV-2，其与需要针对HSV-1和HSV-2的分开测试的目前测试方法形成对比。[0012] 因此，这些结果提供了HSV相关感染的改善的诊断，并且进一步为针对HSV和哺乳动物、禽类、和人中由HSV触发的疾病和病症的血清诊断、生物标志物、疫苗、和治疗性产品开发提供了清楚的、截然不同的抗原靶物。另外，抗原可以在大肠杆菌中表达，这简化其大规模生产。
[0013] 如此，本发明主题提供了可以精确调查HSV诱发性疾病的新的且有用的工具。更具体地，本发明主题提供了用于鉴定、分析和监测就各种哺乳动物、禽类和人疾病而言具有
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诊断、预后和治疗价值的特定HSV抗原，或抗原组的工具、方法和组合物。
[0014] 本发明主题可以用于鉴定与HSV和HSV相关感染和疾病相关的生物学相关抗原，抗原组，抗体和抗体组。发明主题也可以经由纵向监测针对选择的HSV抗原的抗体或抗体组的反应性实现治疗效力的监测和分析。本发明主题还提供检测针对特定HSV蛋白抗原，或抗原组的抗体反应性，其在诊断和治疗HSV触发的疾病和病症中是重要的，所述疾病和病症包括但不限于生殖器疱疹损伤，自然流产，早产，先天性疱疹，口唇感染(感冒疮)，疱疹性瘭疽(herpetic whitlow)，和疱疹诱发性失明(herpes-induced blindness)。涵盖的组合物、装置和方法包含来自HSV的抗体反应性抗原，其可以用作疫苗，诊断性标志物，及治疗剂。在特别优选的方面，HSV抗原具有就受HSV感染的群体的血清而言量化且已知的相对反应性，并且具有已知的与疾病参数的关联。[0015] 如此，本发明主题提供了针对特定HSV抗原或抗原组的抗体的鉴定、分析和监测，其在各种HSV触发的病症和疾病的诊断和/或治疗中是重要的。发明主题还提供了经由下列各项的组合精确调查HSV感染和疾病的工具和方法：抗体检测和监测，及表征血清样品，尤其在它们涉及其在诊断和治疗组合物和方法中的用途时。
[0016] 发明概念的抗原组合物可以包括两种或更多种与载体结合的抗原，其中至少两种抗原与来自受HSV-1感染的个体的血清的抗体具有量化的且已知的相对反应性，且其中至少两种抗原具有与疾病参数的关联。此类抗原可以选自US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36,和UL44，和/或这些蛋白质/肽的片段。在发明概念的一些实施方案中，针对此类组合物的至少两种抗原的抗体可以在较高百分比的暴露于抗原的群体中存在，例如约40%或更多。在此类实施方案中，抗体的平均结合亲和力和/或平均数量可以在由患者生成的抗体的结合亲和力和/或数量的上部三分位数(upper tertile)中。已知的相对反应性可以是与抗体反应性的亲合力或强度和/或疾病的活性状态。疾病参数可以是对病原体和/或HSV(诸如HSV-1)的暴露状态(例如目前或先前的暴露)，病原体和/或HSV(诸如HSV-1)的感染状态(例如急性，潜在性，或复发性)，和免疫状态(例如，无，部分，或完全)。[0017] 在发明概念的另一个实施方案中，抗原组合物可以包含两种或更多种与载体结合的抗原，其中至少两种抗原与来自受HSV-2感染的个体的血清的抗体具有量化的且已知的相对反应性，且其中至少两种抗原具有与疾病参数的关联。此类抗原可以选自UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11，和/或这些蛋白质/肽的片段。在发明概念的一些实施方案中，针对此类组合物的至少两种抗原的抗体可以在较高百分比的暴露于抗原的群体中存在，例如约40%或更多。在此类实施方案中，抗体的平均结合亲和力和/或平均数量可以在由患者生成的抗体的结合亲和力和/或数量的上部三分位数(upper tertile)中。已知的相对反应性可以是与抗体反应性的亲合力或强度和/或疾病的活性状态。疾病参数可以是对病原体和/或HSV(诸如HSV-2)的暴露状态(例如目前或先前的暴露)，病原体和/或HSV(诸如HSV-2)的感染状态(例如急性，潜在性，或复发性)，和免疫状态(例如，无，部分，或完全)。发明概念的另一种抗原组合物可以包含两种或更多种与载体结合的抗原，其中至少两种抗原与来自受HSV-1和HSV-2感染的个体的血清的抗体具有量化的且已知的相对反应性，且其中至少两种抗原具有与疾病参数的关联。此类抗原可以选自：对于HSV-1为US3
[0018]
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,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44和/或其片段，和对于HSV-2为UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US9和US11,和/或其片段。在发明概念的一些实施方案中，针对此类组合物的至少两种抗原的抗体可以在较高百分比的暴露于抗原的群体中存在，例如约40%或更多。在此类实施方案中，抗体的平均结合亲和力和/或平均数量可以在由患者生成的抗体的结合亲和力和/或数量的上部三分位数(upper tertile)中。已知的相对反应性可以是与抗体反应性的亲合力或强度和/或疾病的活性状态。疾病参数可以是对病原体和/或HSV的暴露状态(例如目前或先前的暴露)，病原体和/或HSV的感染状态(例如急性，潜在性，或复发性)，和免疫状态(例如，无，部分，或完全)。[0019] 在发明概念的一些实施方案中，载体可以是适合于用于疫苗的药学可接受载体。在此类实施方案中，疫苗可以包括4种或更多种抗原和/或其片段；此类抗原或其片段可以是重组的和/或至少部分纯化的。在发明概念的另一个实施方案中，载体可以是适合于用于诊断测定法的固体和/或不溶相，诸如例如阵列或微阵列，可以将抗原和/或其片段在此类载体上布置。在此类实施方案中，抗原或其片段可以是重组的，并且可以为至少60%的纯度或者至少部分纯化的。
[0020] 本发明的各种目的、特征、方面和优点从本发明优选实施方案的以下详细描述看会变得更加显而易见。[0021] 附图简述
[0022] 图1描绘了通过PCR和重组克隆从HSV基因组(或ORFeome)衍生的可表达ORF。图1A显示了按预期大小安排的PCR扩增子文库的凝胶。图1B显示了将PCR扩增子重组克隆入pXi中后相应DNA微量制备的凝胶。C-pXi=对照(非重组)pXi质粒。
[0023] 图2描绘了来自感染的和非感染的个体的人血清以及商业供应的血清对照材料的HSV-1和HSV-2抗体概况的热图。柱(column)对应于用于探查HSV和对照抗原阵列的血清样品，在图的底部显示样品大小。血清的血清型在图的顶部显示，并且用作样品分类的参照。将患者血清在图中分类成血清阴性，仅HSV-1血清阳性，仅HSV-2血清阳性，和HSV-1和-2血清阳性组。热图中的行对应于阵列上的抗原，并且分成HSV-1和HSV-2抗原-向右列出，通过按降序处理相应血清阳性群体的平均信号分级。
[0024] 图3描绘了HSV-1或HSV-2血清阳性供体与血清阴性供体的比较结果。直方图显示血清阴性，HSV-1血清阳性和HSV-2血清阳性供体的阵列信号。通过T检验将HSV-1血清阳性供体(在图3A中)和HSV-2血清阳性供体(在图3B中)对每种抗原的应答与血清阴性供体的应答比较，并且显示对直方图上覆盖的经Benjamini-Hochberg校正的p值(pBH)。[0025] 图4描绘了HSV-1和HSV-2血清阳性供体之间的比较。比较HSV-1血清阳性供体对每种抗原的应答与HSV-2血清阳性供体的那些应答。
[0026] 图5描绘了识别频率(FR)分析。对每种血清反应性抗原呈血清阳性的数目以群体的百分比显示。图5A显示了由大于40%HSV-1血清阳性群体识别的血清反应性HSV-1抗原；抗原通过按降序处理HSV-1血清阳性群体频率来分级。使US8/gE与UL22/gH和/或UL44/gC多重化的计算结果在插图中以右侧显示。图5B显示了大于50%HSV-2血清阳性群体识别的血清反应性HSV-2抗原；抗原通过按降序处理HSV-2血清阳性群体频率来分级。在两幅小图中以星号(*)标示最强区别性抗原。
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说 明 书
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发明详述
[0028] 本发明主题提供了鉴定、分析和监测针对特定HSV抗原或抗原组的抗体反应性，其具有诊断、预后和治疗价值，具体地就各种疾病和病症而言。本发明主题还提供了经由下列各项的组合精确调查HSV诱导的感染、病症和疾病的工具和方法：抗体反应性检测和监测，及表征血清样品。[0029] 应当注意到，在以下描述中，可以通过编码蛋白质抗原的基因的基因描述符和/或蛋白质抗原的名称鉴定抗原。如此，应当理解，在上下文指示序列或抗原是蛋白质序列的情况中，所述序列或抗原的基因名称表示所述基因的蛋白质产物。在发明概念的一些实施方案中，HSV抗原具有依照NCBI登录号NC_001806和NC_001798的序列(分别对于HSV-1株17和HSV-2株333)。在提及抗体的情况中，公认的是虽然此类抗体可以称为已经自血清获得，所述抗体也可以源自其它来源，包括但不限于粘液、唾液、精液、泪液、尿液、粪、房水、脓液、脑脊液、淋巴液、和滑液。
[0030] 本发明主题还涉及鉴定特定HSV抗原，其触发与各种HSV疾病和病症有关的抗体反应性，其中特定抗原具有来自HSV疾病或病症患者群体的血清的预先确定的抗体反应性。如此，此类特定抗原可以具有在相对较大的HSV感染宿主组中引发抗体应答的统计学高概率。
[0031] 在一个方面，本发明主题关注预测宿主被HSV-1，HSV-2，或HSV-1和HSV-2两者感染(或者已经对其暴露)的可能性的方法，其通过至少部分测定自宿主获得的血清样品中针对一种或多种抗原或其变体的抗体反应性进行。在此类实施方案中，抗原可以选自下组：来自HSV-1的UL1,UL3,UL6,UL7,UL10,UL14,UL16,UL20,UL21,UL22,UL24,UL26,UL26.5,UL30,UL36,UL38,UL39,UL42,UL44,UL46,UL49,UL49.5,UL50,UL51,US1.5,US2,US3,US4,US6,US8,US8.5,US9,US10和US11，和来自HSV-2的UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL11,UL14,UL16,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL36,UL41,UL42,UL44,UL45,UL46,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US8A,US9,US10,和US11。对下列一种或多种反应性的一种或多种抗体的存在指示宿主被HSV感染和/或已经暴露于HSV的可能性升高：来自HSV-1的UL1,UL3,UL6,UL7,UL10,UL14,UL16,UL20,UL21,UL22,UL24,UL26,UL26.5,UL30,UL36,UL38,UL39,UL42,UL44,UL46,UL49,UL49.5,UL50,UL51,US1.5,US2,US3,US4,US6,US8,US8.5,US9,US10和US11和来自HSV-2的UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL11,UL14,UL16,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL36,UL41,UL42,UL44,UL45,UL46,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8,US8A,US9,US10,和US11。[0032] 在一个方面，本发明主题关注预测宿主被HSV-1而非HSV-2感染的可能性的方法，其包括从自宿主获得的血清样品测定针对一种或多种抗原或其变体的抗体反应性，其中抗原选自下组：来自HSV-1的US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44。[0033] 在另一个方面，本发明主题关注预测宿主被HSV-2而非HSV-1感染的可能性的方法，其包括从自宿主获得的血清样品测定针对一种或多种抗原或其变体的抗体反应性，其中抗原选自下组：来自HSV-2的UL1,UL3,UL5,UL6,UL7,UL10,UL14,UL17,UL18,UL23,UL26,UL26.5,UL27,UL28,UL32,UL34,UL41,UL42,UL44,UL45,UL49,UL50,UL51,UL54,US6,US7,US8US9和US11。
[0034] 在一个方面，本发明主题关注预测患者患有HSV诱导的感染、疾病或病症的可能
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性的方法，其包括从自宿主获得的血清样品测定针对一种或多种HSV抗原或其变体的抗体反应性，其中抗原选自特定抗原组；其中针对一种或多种所述特定抗原的抗体反应性指示宿主患有HSV诱导的疾病或病症的可能性升高。[0035] 在多个实施方案中，测定至少2，或至少5，或至少10，或至少15，或至少20，或至少25种抗体的反应性水平。抗体与发明概念的抗原的反应性可以通过用合适的仪器表征放射、透射或反射光、酶活性、荧光、光散射、荧光偏振、磷光、化学发光、电化学发光、和/或电流计信号测定。例如，可以在微孔板中实施ELISA，并且在商业微板阅读器中以比色法测量结果。在另一个例子中，测试条结果可以通过视觉检查读出或者可以插入扫描仪中。[0036] 虽然可以以本领域中公知的多种方式实施反应性测定，但是一般优选的是，在多重形式中，并且尤其在阵列，ELISA，或条测定法或“量杆(dipstick)”形式中完成测定。阵列可以是基本上平面的，其中各个抗原以离散“点”在测试表面上固定。在此类平面阵列上的抗体反应性可以例如使用检测测试点处的颜色变化的扫描仪或CCD照相机表征。或者，多重形式可以包含流体阵列，其中对与抗原偶联的悬浮微粒的离散群体测定抗体反应性水平。可以使用流式检测仪，诸如例如表征在其移动通过检测仪时从悬浮微粒发出的荧光的细胞分选仪用此类流体阵列表征抗体反应性。如此，涵盖具有至少1种，更通常至少2种，甚至更通常至少5种，或至少10种，或至少15种，或至少20种，或至少25种抗原的阵列或条测定法。也涵盖具有至少1种，更通常至少3种的ELISA，或条测定法。在另一个方面，本发明主题关注预测宿主具有HSV感染、疾病、或病症的可能性的方法，其包括在自宿主获得的血清样品中测定针对一种或多种特定的HSV抗原或其变体的预后性抗体反应性，并且相对于作用为内部对照的血清样品中一种或多种非预后性抗体反应性的水平标准化。或者，可以利用参照试剂组，其提供可以用于标准化的一种或多种抗体反应性外部对照水平。在此类实施方案中，针对一种或多种所述特定HSV抗原的抗体反应性指示宿主具有疾病或病症的可能性升高。[0038] 在另一个方面，本发明主题关注预测宿主具有HSV感染、疾病或病症的可能性的方法，其包括在自宿主获得的血清样品中测定针对上文呈现的一种或多种HSV抗原或其变体的预后性抗体反应性，并且相对于作用为内部对照的血清样品中一种或多种非预后性抗体反应性的水平标准化。或者，可以利用参照试剂组，其提供可以用于标准化的一种或多种抗体反应性外部对照水平。在此类实施方案中，针对一种或多种所述特定HSV抗原的抗体反应性指示宿主具有疾病或病症的可能性升高。[0039] 在一个不同方面，发明主题包含在表面上固定化的上文呈现的两种或更多种HSV抗原，其中HSV抗原可以与单一疾病或超过一种疾病有关。在发明概念的一些实施方案中，测试表面可以包含HSV抗原变体，包括融合肽，截短形式，缀合形式，非糖基化形式，多聚体形式，重组形式，嵌合形式，等等。[0040] 在一个实施方案中，发明主题关注预测患者被HSV感染的可能性的方法，其如下进行：
[0041] (a)在自患者获得的样品中测定针对上文呈现的HSV抗原或其变体的抗体的反应性水平，任选地，相对于所述样品中针对HSV抗原(或其变体)的其它抗体的反应性水平，或者相对于抗体反应性水平的参照组标准化测定的反应性水平；
[0037] [0042]
(b)将步骤(a)中获得的数据进行统计学分析；并
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(c)测定所述患者被HSV感染的可能性。[0044] 在又一个方面，发明主题关注为HSV患者制备个人化蛋白质组学的抗体概况的方法，其如下进行：
[0045] (a)将自患者获得的血清或其它样品进行蛋白质阵列分析；
[0046] (b)测定样品中针对HSV抗原或其变体的一种或多种抗体的反应性水平，其中任
选地，相对于对照反应性水平标准化反应性水平；并[0047] (c)创建汇总通过分析获得的数据的报告。
[0048] 报告可以包括预测患者中HSV感染的严重性和/或可能阶段的可能性。在发明概念的一些实施方案中，报告可以包括所述患者的治疗形式的推荐。[0049] 在别的方面，发明主题关注用于检测和/或表征患者中的一种或多种HSV抗体的方法。本发明主题还提供了经由下列各项的组合精确调查HSV感染的工具和方法：抗体检测和检测，和表征血清样品。此类调查可以例如提供涉及个体中HSV疾病进行的信息，其对于临床医生在选择合适的治疗模式中可以是有价值的。或者，在应用于群体时，此类调查可以提供涉及群体内HSV株的流行病学的信息，由此提供可用于诊断和控制HSV感染扩散的有价值信息。
[0050] 可以通过结合构成检测反应的HSV抗原与载体促进患者样品中HSV抗体的检测和/或表征。在发明概念的此类实施方案中，载体可以是固体或不溶性(即颗粒)载体，并且在阵列中的载体上布置多种HSV抗原。进一步涵盖的是，抗原或其片段可以在粗制表达提取物中，为部分纯化形式(例如小于60%的纯度)或者为高度纯化的形式(至少95%的纯度)。在发明概念的一些实施方案中，此类HSV抗原或其片段可以纯化至约1%,2%,5%,10%,20%,30%40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,或99%或更大的纯度。此类阵列中的抗原可以是重组的或天然的。或者，固相不需要限于平面阵列，而且还可以包括微孔板，珠，微粒，磁性应答颗粒，柱，量杆型形式，微射流装置，等等。[0051] 有利地，凭借使用来自感染个体的抗体的鉴定，本文中鉴定的抗原已经鉴定为既是免疫原性的，又能够在人中产生保护性免疫应答。此外，此类抗原尚未经历真核加工，诸如糖基化，因此适合于大规模生产。因而，本文中公开的抗原可以具有作为治疗性和/或保护性疫苗的效用。因此，在发明主题的另一个方面，鉴定为触发显著抗体反应性的HSV抗原可以在抗原组合物中利用。在此类实施方案中，抗原组合物可以包含HSV诱导的感染、疾病或病症的两种或更多种反应性抗原，并且与载体结合，其中此类抗原就HSV感染的群体的血清而言具有量化的且已知的相对反应性，且其中抗原具有已知的与HSV疾病参数的关联。在一个优选的实施方案中，抗原是多肽或其片段。
[0052]
发明概念的此类疫苗实施方案可以通过结合一种或多种抗原与载体促进。因此，在发明概念的此类实施方案中，载体可以是药学可接受载体，并且此类组合物可以配制为疫苗。在此类实施方案中，一般优选的是，疫苗包含多种抗原。在此类实施方案中，疫苗可以包含2,3,4,5,6,7,89,10,或更多种抗原。在发明概念的一个优选的实施方案中，疫苗包含4种抗原。或者，发明概念的疫苗可以包含单一抗原。根据具体的HSV诱导的疾病或病症，涵盖的是，HSV抗原或其片段是至少部分纯化的和/或重组的。此类HSV抗原或其片段可以纯化至约10%,20%,30%40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,或99%或更大的纯度。
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实施例
发明人利用微阵列对来自受感染群体的血清样品实施蛋白质组筛选已经发现了许多能够从多种HSV感染类型和阶段触发抗体反应性的HSV抗原。本文中呈现了依照发明主题的抗原，并且涵盖的是，此类抗原可以单独或更优选地与其它抗原组合用于制造诊断装置、治疗性组合物、和疫苗。[0054] 例示性方法
[0055] 血清样品。从健康供体及从上UCI医学中心以诊断和治疗疱疹感染的患者收集血液样品。所有感染是潜伏的，并且没有检查急性病例。收集所有样品作为具有同意且在地方IRB批准下的免疫学研究的一部分。对于本研究，将血清级分从每份血液样品分离，并在
[0053]
使用前于-80℃贮存。通过FDA批准的商业HSV-1和HSV-2ELISA(Focus
Diagnostics)依照制造商的用法说明书测定所有血清。代表与患者相同地理位置(Orange County,CA)的一般成年群体的对照血清在同意的情况下并在地方IRB批准下由UCI一般临床研究中心(GCRC)收集。
[0056] HSV-1和HSV-2蛋白质组微阵列的构建。如下制作蛋白质组微阵列，即PCR扩增基因组DNA中的编码序列，并通过同源重组将扩增子插入T7表达载体中，接着在偶联的体外转录-翻译(IVTT)中表达，并直接打印到微阵列上(Davies,D.H.等2005.Proc Natl Acad Sci U S A102:547-52;Luevano,M.等2010.Virology405:31-40)。PCR引物设计的基因序列获自NCBI(对于HSV-1株17和HSV-2株333分别为登录号NC_001806和NC_001798)。使用的基因命名如发表于洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Laboratory)(http://www.oralgen.lanl.gov/)的组织的口腔病原体基因组序列数据(OralPathogen Genome Sequence Databases,ORALGEN)的。模板DNA是来自Dale Carpenter和Steve Wechsler,加利福利亚大学(University of California),欧文眼科学部(Irvine Department of Ophthalmology)的慷慨赠品。HSV-1株17DNA以克隆入粘粒中的5个重叠基因组片段提供。HSV-2株333DNA从病毒体提取的DNA制备或者购自ATCC(Manassa,Virginia)。
[0057] 用于PCR扩增的引物含有对每种基因特异性的20bp核苷酸及在5’端与线性pXT7载体末端互补的20bp延伸。对于PCR，使用AccuPrimeTM富含GC的DNA聚合酶(Invitrogen,Grand Island,New York)或具有添加DMSO(终浓度2%)和8ng/μl BSA的GC缓冲液的
高保真性PCR主混合物(Thermo Scientific,Waltham,Massac
husetts)使用降落PCR以如下的循环条件扩增基因：于98℃的初始变性/1分钟，接着是98℃/10秒，68℃/20秒其中递减温度为0.5℃/循环，和72℃持续30秒/kb的20个循环，接着是98℃/10秒，58℃/20秒和72℃/30秒/kb的20个循环。在感受态DH5a细胞中在PCR产物和pXT7载体之间发生体内同源重组。使用QIAprep96Turbo试剂盒(Qiagen,Venlo,Netherlands)从此培养物分离重组质粒。通过QC-PCR将所有重组质粒确认为含有插入物，其中使用与初始PCR中使用的引物相同的引物从重组体扩增预期大小的条带。还通过测序确认阵列上产生强信号的质粒。[0058] 对于阵列制作，使用基于大肠杆菌的体外转录/翻译表达系统(Invitrogen ExpresswayTMCell-Free Expression System,Invitrogen,,Grand Island,New York)表达纯化的DNA微量制备。在密封384孔微孔板中制备20μL反应，并将其在平台摇动器上
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以250rpm于24℃温育16小时。在打印前添加蛋白酶抑制剂混合物(Roche
Roche,Penzberg,Germany)和Tween-20至终浓度0.05%。以1x4子阵列形式使用OmniGrid Accent100微阵列打印机(Genomic Solutions,Ann Arbor,Michigan)将表达的蛋白质反应在不进一步纯化的情况下打印到8垫硝酸纤维素包被的Oncyte Nova载玻片(Grace Bio-Labs,Bend,Oregon)上。每个子阵列包含多个阴性对照点，其包含缺乏DNA模板的假表达反应。每个子阵列还包含4个连续稀释的小鼠、大鼠和人IgG混合物和2个连续稀释的人IgM的阳性对照点。使用这些阳性和阴性对照来标准化来自不同阵列的数据。阵列还包括4个连续稀释的纯化的重组埃巴病毒核抗原-1(EBNA-1;DevaTal Inc.,Hamilton,New Jersey)作为血清质量的指导。
[0059] 使用针对工程化改造到每种蛋白质中的N端多聚-His(克隆His-1,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)和C端HA(克隆3F10,Roche,Penzberg,Germany)标签的抗体监测每个点中的蛋白质表达。首先，将阵列在蛋白质阵列封闭缓冲液(Whatman,Little Chalfont,United Kingdom)中于周围温度封闭30分钟，然后用在封闭缓冲液中以1/1,000稀释的抗标签抗体探查1小时。然后，将载玻片在含有0.05%(v/v)Tween20的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲盐水(T-TBS)中清洗3次，并与生物素化的二抗(Jackson ImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania)一起温育。在T-TBS中将载玻片清洗3次后，通过与缀合有链霉抗生物素蛋白的
P-3(Columbia Biosciences,Columbia,Maryland)一起温育检测结合的抗体。然后，将载玻片在T-TBS中清洗3次，接着在TBS中清洗3次，并在蒸馏水中浸渍，之后通过短暂离心风干。将载玻片在Perkin Elmer ScanArray共焦激光扫描仪中扫描，并使用ScanArrayExpress软件(Waltham,Massachusetts)获得数据。[0060] 由于在此类测定法中不控制每个点的蛋白质浓度，不同蛋白质可以具有不同浓度，并且在比较给定血清样品的不同蛋白质的信号强度时必须小心。然而，由于将所有阵列打印在一起，给定蛋白质的浓度在不同阵列间是恒定的。如此，可以对不同血清间的给定蛋白质的信号强度进行比较，并且与抗体滴度直接相关联。[0061] 为了用人血清探查，将样品在补充有终浓度10mg/ml蛋白质的大肠杆菌裂解物(Antigen Discovery,Inc.,Irvine,California)的1倍蛋白质阵列封闭缓冲液中稀释至1/100，以封闭抗大肠杆菌抗体，并且于37℃在恒定混合的情况中温育30分钟。同时，将阵列用蛋白质阵列封闭缓冲液封闭30分钟。除去封闭缓冲液，并用预处理的血清于4℃在温和摇动的情况下探查阵列过夜。然后，将载玻片在T-TBS中清洗3次，并在蛋白质阵列封闭缓冲液中以1/200稀释的生物素化的抗人IgG Fc(Jackson Immuno Research,West Grove,Pennsylvania)一起温育。将载玻片每次在T-TBS和TBS中清洗3次后，显现结合的抗体，如上文描述的。类似地探查对照阵列，只是用补充有大肠杆菌裂解物的蛋白质阵列封闭缓冲液替换一抗。
[0062] 阵列数据分析和统计学处理。原始数据以每个点的均值像素信号强度收集。使用阴性和阳性对照点(分别为“无DNA”和IgG点)来实施方差稳定化标准化(VSN)，其使用来自Bioconductor套件(http://Bioconductor.org/)的统计学环境R中的“VSN”包进行。在标准化的信号强度高于“无DNA”对照点的均值加两个标准差(C+2SD)时反应性抗原定义为阳性。通过使用Bayes规则化t检验比较供体组对对照标准化数据计算p值。为了
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解决多重检验条件，通过Benjamini-Hochberg法(Benjamini,Y.,and Y.Hochberg.1995.J.Roy.Stat.Soc.,B57:289-300)计算p值调节以给出BH p值。依照显著性(BH p值<0.05和>0.05)，阳性抗原分类为类型特异性或交叉反应性。通过测试每名供体的信号作为阈值截留用单一抗原的对照转化/标准化阵列数据实施接受者算子特征(Receiver Operator Characteristic,ROC)分析以区别HSV-1和HSV-2感染进行。为了计算每种抗原的曲线下面积(AUC)，用标准化阵列数据实施接受者算子特征(ROC)分析以区别HSV-1和HSV-2感染。使用曲线下面积(AUC)作为每种抗原区别HSV-1和-2感染的能力的相对测量。对于识别频率(FR)分析，使用标准化数据对阵列上的每种抗原限定截留，并且设为血清阴性群体的平均信号+3SD，如由HerpeSelect ELISA(Focus Diagnostics,Cypress,California)限定的。测定每个血清阳性组中高于截留的个体数目，并且以百分比表示。[0063] 富集分析。依照www.uniprot.org的组织数据库，对由HSV-1(毒株17)编码的每种蛋白质分配一种或多种基因本体论(GO)组分。基因组中及属于每种GO分类的血清反应性抗原中的ORF数目以百分比定义，并且基因组对血清反应性的比率用于测定倍数富集。认为富集1.5倍或更多的GO分类相对于蛋白质组在血清反应性抗原间富集。在R环境中使用Fisher氏精确检验计算富集统计学分析的p值。
例示性结果
[0065] 图1中描绘了来自可表达HSV可读框文库(“ORFeome”)构建的例示性结果。图1A显示了来自按预期大小排列的PCR文库的凝胶电泳的结果。一些基因不能在使用的任何PCR条件下扩增，如由相应凝胶道中的阴性结果显示的。图1B显示了在将PCR扩增子重组克隆入pXi中后相应HSV-2和代表性HSV-1DNA微量制备的凝胶电泳的结果。所有质粒是环状/非线性化的。在此图中，C-pXi=对照(非重组)pXi质粒。不能克隆的基因一般对应于那些不能扩增的基因。
[0066] 图2中显示了来自与HSV-1和HSV-2抗原阵列起反应的人血清样品的HSV-1和HSV-2抗体概况的热图概述。柱(column)对应于用于探查阵列的个别血清样品，在图的底部显示样品大小。在图的指定行中还显示使用HerpeSelect-1和-2IgG ELISA(Focus Diagnostics,Cypress,California)的血清分型的结果，并且用作样品分类的参照。将患者血清分类为血清阴性(“neg”n=47)，仅HSV-1血清阳性(“1”n=32)，仅HSV-2血清阳性(“2”n=6)，和HSV-1和-2血清阳性(1/2,n=5)组。还在阵列上探查每种ELISA试剂盒(“试剂盒”，n=各4个)提供的对照血清，包括阴性，不确定和两份阳性样品。为了比较，将来自一般群体的血清合并(“群体”，n=21)。除了ELISA结果外，热图中的行对应于阵列上的抗原。这些分成HSV-1和HSV-2抗原，并且在图的右侧列出。仅显示了针对来自HSV-1或HSV-2血清阳性群体的血清有反应性的抗原的数据。在任一群体的平均信号强度大于由缺乏DNA模板的体外翻译反应组成的对照点的平均值+2SD值时，如上文描述的(C+2SD)，抗原定义为反应性。显示的其它抗原是：(1)纯化的、滴度的人IgG，其被二抗识别，并且用于帮助监测阵列间探查，和(2)纯化的、滴度的埃巴核抗原-1(EBNA-1)，其充当血清质量的对照，因为大多数个体在此抗原方面呈血清阳性。从扣除背景对照点的信号的原始阵列数据产生热图，并且通过按降序处理相应血清阳性群体的平均信号对抗原分级。还通过按升序处理平均信号在7组之每组内对血清分级。
[0064] [0067]
ELISA血清阴性临床样品仅针对阵列上的HSV-1或HSV-2抗原显示微弱的反应性。
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相反，大多数HSV-1血清阳性供体显示相对于血清阴性供体升高的对HSV-1抗原的反应性，及与HSV-2抗原的最小交叉反应性。HSV-1血清阳性组的概况的宽度高度可变，其可以与临床症状相关联。与HSV-1血清阳性组(其对HSV-1抗原显示非常特异性的反应性)形成对比，HSV-2血清阳性供体显示升高的对HSV-2和HSV-1抗原两者的反应性，这与对HSV-1的交叉反应性一致。如预期的，HSV-1/HSV-2双重阳性供体的反应性在HSV-1和HSV-2抗原之间同等分布。最后，约一半的一般群体(以21份样品表示)似乎对HSV-1呈血清阳性。一般群体中HSV-2的血清流行性略低，并且两名个体显示特别宽的概况。下文在识别频率(FR)分析中呈现了与参照ELISA血清分型相比的阵列数据的一致性。
[0068] 图3描绘了HSV-1或HSV-2血清阳性供体的抗体反应性概况和血清阴性供体的抗体反应性概况之间的比较。直方图显示了血清阴性(黑色填充)、HSV-1血清阳性(灰色填充)、和HSV-2血清阳性(无填充)供体的平均阵列信号+SEM。仅显示了血清反应性抗原(即，平均信号超出C+2SD的那些血清反应性抗原)。图3A显示了来自HSV-1血清阳性供体的结果的比较，而图3B显示了使用T检验比较来自HSV-2血清阳性供体的结果与血清阴性供体的结果。显示了对直方图上覆盖的经Benjamini-Hochberg校正的p值(pBH)，并且用于将抗原分类成显著的和非显著的应答(分别为pBH<0.05和>0.05)。pBH线的缺口表示经校正的p指<10-30。
[0069] HSV-1血清阳性和血清阴性供体之间的此比较揭示了几种有意义的HSV-1抗原。无意义的抗原(即，那些在血清阴性和血清阳性中给出相似信号的抗原)都是低信号且接近截留(C+2SD)，并且可以使用更严格的标准消除。许多HSV-2抗原也是HSV-1血清阳性供体识别的，尽管信号相对较低，进一步确认来自仅HSV-1的群体的血清仅显示适度的与HSV-2抗原的交叉反应性。HSV-2血清阳性和血清阴性供体之间的比较(图3B)也揭示了几种有意义的HSV-2抗原。然而，来自HSV-2供体的血清也显示广泛的与HSV-1抗原的交叉反应性。为了测定这些有意义的抗原之任一种是否具有区别HSV-1和HSV-2感染的潜在诊断效用，发现有必要比较HSV-1抗体概况与HSV-2抗体概况。
[0070] 图4描绘了HSV-1血清阳性供体和HSV-2血清阳性供体的抗体反应性概况之间的比较。如在图3中，实施T检验，并且显示对直方图上覆盖的经Benjamini-Hochberg校正的p值(pBH)。令人惊讶地，大多数反应性HSV-1抗原没有意义，确认从热图产生的观察，即来自HSV-1和HSV-2血清阳性供体两者的血清识别HSV-1抗原。在图1中，将血清反应性HSV-1抗原列出，并且通过HSV-1和HSV-2血清阳性供体之间比较结果的T检验分类成有意义的或有差别的(pBH<0.05)和无意义的或交叉反应性(pBH>0.05)，以与它们在图4中显示的相同次序。蛋白质身份获自Uniprot(http://www.uniprot.org/)和Oralgen(http://www.oralgen.lanl.gov/)，别的注解来自目前的质谱术数据。
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表1
[0075] 注意到虽然这些中几种抗原鉴定为糖蛋白，形成这些结果基础的多肽不是糖基化的。这些抗原中许多也代表不在HSV-1表面上表达，并且通常不会认为通过常规方法进行测定法(assay)或疫苗开发的候选物的蛋白质。[0076] 如表1中可以看到的，少数HSV-1抗原是有意义的，并且观察到这些中仅一个(US8/糖蛋白E)的信号强度在HSV-1血清阳性供体中较大。剩余的有意义的抗原用来自HSV-2血清阳性供体的血清给出更大的信号强度。此未曾料到的结果可以是由于来自HSV-2血清阳性供体的血清的交叉反应性。例如，HSV-2US9壳皮蛋白在HSV-2感染中是强烈识别的，而相应的HSV-1抗原在HSV-1感染中不是强烈识别的。UL7显示类似的性能。这些HSV-1和-2直向同系物之间的同源性较高，这提示了抗体有可能起交叉反应。[0077] 发现用反应性HSV-2抗原的结果与HSV-1的结果不同，因为大多数在HSV-2血清阳性供体的情况下给出显著更高的信号。在表2中，将血清反应性HSV-2抗原列出，并且通过HSV-2和HSV-1血清阳性供体之间的比较结果的T检验分类成有意义或有差别的(pBH<0.05)和无意义的或交叉反应性的(pBH>0.05)，以与它们在图4中显示相同的次序。蛋白质身份获自Uniprot(http://www.uniprot.org/)和Oralgen(http://www.oralgen.lanl.gov/)，别的注解来自目前的质谱术数据。
[0074] [0078]
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仅两种抗原(US8.5和US10)是无意义的或与来自HSV-1血清阳性供体的血清有交叉反应性。注意到虽然这些中几种抗原鉴定为糖蛋白，形成这些结果基础的多肽不是糖基化的。这些抗原中许多也代表不在HSV-1表面上表达，并且通常不会认为通过常规方法进行测定法或疫苗开发的候选物的蛋白质。
[0082] 虽然T检验提供了区别HSV-1和HSV-2血清阳性群体的抗原的引导，但是对于诊断学，也重要的是测定这些候选区别性抗原的识别频率(FR)。图5中显示了来自此类识别频率(FR)分析的典型结果。识别的截留数值定义为血清阴性群体的对照转化/标准化数据的均值+3SD。然后，在每个群体中测定每种血清反应性抗原的血清阳性的数目，并且将数值转化成所述群体的百分比。大多数区别性抗原在两幅小图中以星号(*)显示。
[0083] 图5A显示了由超过40%的HSV-1血清阳性群体识别的血清反应性HSV-1抗原。如显示的，抗原通过按降序处理HSV-1血清阳性群体内的识别频率来分级。识别的大多数抗原与HSV-2血清阳性群体具有高度交叉反应性。值得注意的是，此类抗原对设计用于一般诊断HSV感染而不区别HSV-1和HSV-2的测试可以具有效用。对于HSV-1特异性测试，仅3种反应性抗原(糖蛋白E,H和C)显示低得可接受的与HSV-2血清阳性供体的交叉反应性。这些之中，HSV-1US8/gE(其通过T检验较早测定为最佳地能够区别HSV-1和HSV-2感染的HSV-1抗原)在HSV-1和HSV-2血清阳性中分别具有最佳的FR值62.5%和0%。两种其它鉴定的抗原(UL22/gH和UL44/gC)在HSV-1和HSV-2血清阳性供体中分别具有FR值43.8%和0%。最高的FR通过组合所有三种抗原(分别为78.1%对0%HSV-1和HSV-2血清阳性供体)与在血清阴性群体中假阳性检测的相应较小增加实现。[0084] 类似地，图5B显示了由50%或更多的HSV-2血清阳性群体识别的血清反应性HSV-2抗原的FR数据。如显示的，抗原通过按降序处理HSV-2血清阳性群体内的识别频率来分类。FR分析挑选HSV-2UL44/gC为最佳分类者，其分别由100%和0%HSV-2和HSV-1血清阳性供体识别。其它糖蛋白，值得注意的是UL1/gL和US7/gI也给出中等的辨别力。
[0081]
如上文记录的，通过T检验揭示为区别HSV-1和HSV-2血清阳性个体的抗原进一步进行ROC分析。表3显示了对来自区别性抗原的数据的代表性ROC分析。按AUC的分级与按经BH校正的p值的分级良好相关联。总体上，通过T检验和ROC分析揭示为区别性的反应性抗原在RF分析中也显示有用的辨别力。例如，62.5%和0%的这两个群体分别识别HSV-1US8/gE(其通过T检验和ROC揭示为是最佳地区别HSV-1和HSV-2血清阳性供体的HSV-1抗原)。类似地，HSV-2UL44/gC(其具有最显著的pBH和AUC)也显示阵列形式中通过FR分析的最佳辨别力。
[0085]
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表3
[0088] 表1和表2中列出的反应性抗原的身份显示了大量结构性蛋白质是反应性的，值得注意的是糖蛋白诸如US4/gG,US6/gD,US8/gE,UL10/gM,UL22/gH和UL44/gC。因此，有可能的是，HSV-1和/或HSV-2抗体应答偏向于某些类型的病毒蛋白质。为了表征这点，进一步实施对HSV-1抗体反应性概况的富集分析。依照www.uniprot.org的数据库，对由HSV-1编码的每种蛋白质分配一种或多种基因本体论(GO)组分。测定归入存在于蛋白质组和血清反应性抗原中的每种GO组分的基因的总数的百分比，并且使用比率来测定富集是否是明显的。表4中的分析结果显示了与7.3%血清反应性抗原相比，病毒体膜蛋白占HSV-1基因组中编码的基因的5.0%，这指示略微的(1.5倍)富集。可以显示偏爱的唯一另一种GO组分是“宿主细胞核膜”。然而，无一组分是统计学显著的(p>0.05)。然而，公认的是，富集在其它数据集中可以是明显的，且某些蛋白质家族中的高比率反应性的此类证据可以对HSV-1和HSV-2检测和治疗提供有价值的了解。
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[0089]
[0090] 表4
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如此，已经公开了HSV抗原和抗体组合物和方法的具体实施方案和应用。然而，对于本领域技术人员应当显而易见的是，除了那些已经做出的描述外的更多的许多修改在不偏离本文中的发明概念的前提下是有可能的。因此，发明主题不应受限，除非在所附权利要求书的精神中。此外，在解读说明书和权利要求书两者中，所有术语应当以与上下文一致的最宽的可能方式解读。具体地，术语“包含”应当解读为以非排他方式提及要素、组分或步骤，这指示提及的要素、组分或步骤可以与没有明确提及的其它要素、组分或步骤一起存在，或利用，或组合。此外，在参考文献(其通过提及并入本文)中的术语的定义或使用与本文中提供的所述术语的定义不一致或冲突的情况下，适用本文中提供的所述术语的定义，而参考文献中的所述术语的定义不适用。
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图1
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图2
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图3
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图4
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图5
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