(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111419877 A(43)申请公布日 2020.07.17
(21)申请号 202010173848.X(22)申请日 2020.03.13
(71)申请人 北京中瑞联合生物科技有限公司
地址 102206 北京市昌平区回龙观镇生命
园路8号院一区6号楼4层465室(72)发明人 李志刚 黄宇 唐雯
(74)专利代理机构 北京纽乐康知识产权代理事
务所(普通合伙) 11210
代理人 刘艳艳(51)Int.Cl.
A61K 35/35(2015.01)A61P 15/10(2006.01)C12N 5/077(2010.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图2页
(54)发明名称
一种用于治疗男性勃起障碍的药物及其制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种用于治疗男性勃起障碍的药物及其制备方法，该用于治疗男性勃起障碍的药物由脂肪EPC和细胞外基质悬液组成，所述脂肪EPC的数量为1×106~10×106个/mL，所述细胞外基质悬液为细胞外基质的生理盐水悬液。本发明的用于治疗男性勃起障碍的药物，采用脂肪EPC联合细胞外基质使用，细胞外基质中含有丰富的胶原蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白和蛋白聚糖，可以固定脂肪EPC细胞，为脂肪EPC细胞提供良好的微环境，促进细胞增殖,脂肪EPC联合细胞外基质，通过内皮祖细胞血管生成作用以及修复功能，改善阴茎海绵体结构重构，增加内皮、平滑肌细胞数量，促进勃起功能的恢复。
CN 111419877 ACN 111419877 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于治疗男性勃起障碍的药物，其特征在于，由脂肪EPC和细胞外基质悬液组成，所述脂肪EPC的数量为1×106~10×106个/mL。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述细胞外基质悬液为细胞外基质的生理盐水悬液，所述细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:5-1:20。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述脂肪EPC的数量为5×106个/mL，所述细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:10。
4.一种用于治疗男性勃起障碍的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）脂肪中血管组织、红细胞去除：获得脂肪后，使用生理盐水对脂肪进行反复清洗，离心，收集上层脂肪组织层，去除下层红细胞及血管碎片；
2）脂肪中ADSCs的去除：向步骤1）得到的脂肪组织中添加Ⅰ型胶原酶，混匀，震荡消化，离心去除下层沉淀及ADSCs；
3）脂肪EPC和细胞外基质获取：收集步骤2）得到的上层脂肪组织，添加Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶，震荡消化，离心，收集沉淀，去除上层液化的脂肪油滴和消化液，生理盐水重悬沉淀，先使用2000μm细胞筛去除血管组织成分，得到含细胞外基质和脂肪EPC的混合液，使用100μm细胞筛过滤收集细胞外基质，使用与细胞外基质体积比为1：5-1：20的生理盐水重悬获得细胞外基质悬液，-20℃进行冷冻保存；
4）脂肪EPC培养：将步骤3）中过滤脂肪细胞外基质后的滤液离心，收集沉淀，沉淀使用EPC培养基重悬，进行脂肪EPC培养，贴壁细胞形成单克隆后，分别挑取各单克隆细胞继续培养，待细胞融合度达80-90％时，用胰酶消化传代，得到脂肪EPC；
5）含脂肪EPC和细胞外基质悬液制备：37℃融化步骤3）得到的细胞外基质悬液，使用细胞外基质悬液重悬步骤4）得到的脂肪EPC，使脂肪EPC数量保持在1×106~10×106个/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:10，含脂肪EPC和细胞外基质悬液中脂肪EPC数量为5×106个/mL。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中添加的Ⅰ型胶原酶与脂肪组织等体积，Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.05%；步骤3）中添加的Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶均与脂肪组织等体积，Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.05%，胰蛋白酶终浓度为0.125%。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中震荡消化的条件为在280r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min，步骤3）中震荡消化的条件为在250r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中使用与细胞外基质体积比为1：10的生理盐水重悬获得细胞外基质悬液。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中使用100μm细胞筛过滤收集的细胞外基质在使用与细胞外基质体积比为1：5-1：20的生理盐水重悬前，使用10mL生理盐水重悬清洗，添加到15mL离心管中，300g离心力，升速5降速5，离心8min，得细胞外基质体积，弃上清生理盐水。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中离心的具体条件为400g离心力，升速9降速9，离心10min。
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说 明 书
一种用于治疗男性勃起障碍的药物及其制备方法
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技术领域
[0001]本发明涉及组织工程领域，具体来说，涉及一种用于治疗男性勃起障碍的药物及其制备方法。
背景技术[0002]勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是影响男性生活质量的常见病之一，国际性医学咨询委员会分析结果显示，40岁以下男性ED患病率约1％～10％，40～49岁约为2％～9％，60～69岁为20％～40％，而超过70 岁者约50％～100％存在不同程度的ED。[0003]大量临床和临床前研究证实，内皮功能障碍是导致ED的重要因素。阴茎海绵体内皮、平滑肌细胞凋亡、萎缩后，一般药物治疗无法诱导组织再生。必须通过补充受损细胞或刺激组织内残存干细胞(stem cells,SCs) 增殖才能再生受损组织。然而，注射部位若具备充足的血流(比如阴茎海绵体血窦)，注射后的细胞将很快被血流冲走，从而影响细胞在局部组织中的滞留率，同样会影响脂肪干细胞(ADSCs)的治疗效果。为了避免重复注射治疗，移植细胞在注射部位的滞留存活率是治疗长期成功的关键。研究人员曾运用细胞遗传工程、水凝胶和生物降解膜、微球组织等的方法来提高细胞的生存率和细胞移植治疗效果。然而，这些方法大多数需要经过复杂的准备程序，并且多为异体物质，容易受到病毒和细菌的污染，并具有免疫排斥作用，并且为代价昂贵。发明内容
[0004]针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于治疗男性勃起障碍的药物及其制备方法，能够克服现有技术的上述不足。[0005]为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：[0006]一种用于治疗男性勃起障碍的药物，该药物由脂肪内皮祖细胞(EPC) 和细胞外基质悬液组成，所述脂肪EPC的数量为1×106～10×106个/mL。[0007]优选地，所述细胞外基质悬液为细胞外基质的生理盐水悬液，所述细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:5-1:20。[0008]优选地，所述脂肪EPC的数量为5×106个/mL，所述细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:10。
[0009]根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗男性勃起障碍的药物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：[0010]1)脂肪中血管组织、红细胞去除：获得脂肪后，使用生理盐水对脂肪进行反复清洗，离心，收集上层脂肪组织层，去除下层红细胞及血管碎片；[0011]2)脂肪中ADSCs的去除：向步骤1)得到的脂肪组织中添加Ⅰ型胶原酶，混匀，震荡消化，离心去除下层沉淀及ADSCs；
[0012]3)脂肪EPC和细胞外基质获取：收集步骤2)得到的上层脂肪组织，添加Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶，震荡消化，离心，收集沉淀，去除上层液化的脂肪油滴和消化液，生理盐水重悬
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说 明 书
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沉淀，先使用2000μm细胞筛去除血管组织成分，得到含细胞外基质和脂肪EPC的混合液，使用100μm细胞筛过滤收集细胞外基质，使用与细胞外基质体积比为1：5-1：20的生理盐水重悬获得细胞外基质悬液，-20℃进行冷冻保存；[0013]4)脂肪EPC培养：将步骤3)中过滤脂肪细胞外基质后的滤液离心，收集沉淀，沉淀使用EPC培养基重悬，进行脂肪EPC培养，贴壁细胞形成单克隆后，分别挑取各单克隆细胞继续培养，待细胞融合度达80-90％时，用胰酶消化传代，得到脂肪EPC；[0014]5)含脂肪EPC和细胞外基质悬液制备：37℃融化步骤3)得到的细胞外基质悬液，使用细胞外基质悬液重悬步骤4)得到的脂肪EPC，使脂肪 EPC数量保持在1×106～10×106个/mL。
[0015]优选地，细胞外基质悬液中细胞外基质与生理盐水的体积比为1:10，含脂肪EPC和细胞外基质悬液中脂肪EPC数量为5×106个/mL。[0016]优选地，步骤2)中添加的Ⅰ型胶原酶与脂肪组织等体积，Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.05％；步骤3)中添加的Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶均与脂肪组织等体积，Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.05％，胰蛋白酶终浓度为0.125％。[0017]优选地，步骤2)中震荡消化的条件为在280r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min，步骤3)中震荡消化的条件为在250r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min。[0018]优选地，步骤3)中使用与细胞外基质体积比为1：10的生理盐水重悬获得细胞外基质悬液。
[0019]优选地，步骤3)中使用100μm细胞筛过滤收集的细胞外基质在使用与细胞外基质体积比为1：5-1：20的生理盐水重悬前，使用10mL生理盐水重悬清洗，添加到15mL离心管中，300g离心力，升速5降速5，离心 8min，得细胞外基质体积，弃上清生理盐水。[0020]优选地，步骤4)中离心的具体条件为400g离心力，升速9降速9，离心10min。[0021]本发明的有益效果：
[0022]1)本发明的用于治疗男性勃起障碍的药物的制备方法根据不同细胞性状及组织内分散程度，分两步消化完成，第一步消化去除脂肪干细胞ADSCs，防止其后期对EPC的污染，第两步消化获取脂肪EPC细胞及细胞外基质部分；[0023]2)联合细胞外基质使用，细胞外基质中含有丰富的胶原蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白和蛋白聚糖，可以固定脂肪EPC细胞，为脂肪EPC细胞提供良好的微环境，促进细胞增殖；[0024]3)脂肪EPC联合细胞外基质，通过内皮祖细胞血管生成作用以及修复功能，改善阴茎海绵体结构重构，增加内皮、平滑肌细胞数量，促进勃起功能的恢复。附图说明
[0025]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1是根据本发明实施例所述的脂肪内皮祖细胞单克隆的细胞形态图；
[0027]图2是根据本发明实施例所述的脂肪内皮祖细胞在细胞融合度达到90％的细胞形态图；
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说 明 书
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图3是根据本发明实施例所述的人脂肪内皮祖细胞表面标志的流式细胞术检测结
果。
具体实施方式
[0029]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]实施例1
[0031]脂肪中血管组织、红细胞去除
[0032]1)使用25mL移液管将脂肪组织从取样瓶转移到50mL离心管中，每管 20mL；[0033]2)向脂肪组织离心管中添加20mL生理盐水；[0034]3)使用25mL移液管反复吹打脂肪组织10-20次，充分洗涤，添加生理盐水至50mL,加盖，反复倾倒混合；[0035]4)300g离心力，升速9降速9，离心8min；[0036]5)离心后，液体分为两层，上层为脂肪层，下层为含脂肪血管组织沉淀的洗涤生理盐水层，脂肪血管组织、红细胞等杂质沉淀到离心管底部，使用 25mL移液管将上层脂肪层吸入新的50mL离心管中，20mL每支备用；重复2、 3、4步骤，再次清洗一边；[0037]6)离心后，收集脂肪层，去除下层脂肪血管组织和红细胞。[0038]实施例2
[0039]脂肪中ADSCs细胞去除
[0040]1)向20mL脂肪组织中按照脂肪体积添加等体积预热的0.1％的Ⅰ型胶原酶20mL，加盖，反复倾倒混合，Ⅰ型胶原酶终浓度为0.05％；[0041]2)在280r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min；[0042]3)消化完成后，500g离心力，升速9降速9，离心10min；[0043]4)离心后，液体分为三层，上层为液化油脂，中层为脂肪细胞层，下层脂肪中ADSCs的消化液层，丢弃上层及下层，用25mL移液管吸取脂肪细胞层。[0044]实施例3
[0045]脂肪EPC和细胞外基质获取[0046]1)层脂肪组织添加等体积Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶，Ⅰ型胶原酶终浓度为0.05％，胰蛋白酶浓度为0.125％；[0047]2)250r/min转速，37℃的条件下，震荡消化30min，(离心管平放，使得消化过程中，脂肪和Ⅰ型胶原酶可充分混合)；[0048]3)消化完成后，600g离心力，升速9降速9，离心10min；[0049]4)离心后，液体分为三层，上层为液化油脂，中层为消化液层，下层为 EPC细胞和细胞外基质层，去除上层和中层；
[0050]5)向下层添加生理盐水到50mL，混匀，600g离心力，升速9降速9，离心10min，清洗消化液一遍；
[0051]6)用30mL生理盐水重悬，沉淀用2000μm细胞筛再次去除血管及组织成分，得细胞
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外基质和富含EPC细胞混合液；[0052]7)使用100μm细胞筛对混合液进行过滤，100μm细胞筛上的部分为细胞外基质，过滤后的为富含EPC细胞悬液；
[0053]8)收取细胞筛网上的细胞外基质，使用10mL生理盐水重悬，添加到15mL 离心管中，300g离心力，升速5降速5，离心8min，得细胞外基质体积，弃上清生理盐水。[0054]9)使用细胞外基质和为1：10的生理盐水重悬，获得细胞外基质悬液， -20摄氏度进行冷冻保存。
[0055]10)把步骤7过滤后的富含EPC细胞悬液，通过400g离心力，升速9降速9，离心10min，得富含EPC细胞层。[0056]实施例4
[0057]脂肪EPC的培养[0058]1)用Endothelial Cell Medium(sciencell-1001)的完全培养基重悬人内皮祖细胞，诱导贴壁；
[0059]2)36小时后，全量换液，去除未贴壁细胞，添加新鲜完全培养基，隔天半量换液；[0060]3)待贴壁细胞形成单克隆后，分别挑取各单克隆细胞继续培养，待细胞融合度达80-90％时，用0.05％胰酶消化传代，继续培养，收集P3-P5代脂肪来源内皮祖细胞。图1是脂肪内皮祖细胞单克隆的细胞形态图，图2是脂肪内皮祖细胞在细胞融合度达到90％的细胞形态图，图3是脂肪内皮祖细胞表面标志的流式细胞术检测结果，CD31结果为98.85％，CD105结果为99.8％。[0061]实施例5
[0062]富含内皮祖细胞的细胞外基质悬液制备[0063]1)37摄氏度快速融化细胞外基质，获得细胞外基质悬液；[0064]2)使用消化法获得P3-P5代脂肪来源内皮祖细胞，生理盐水清洗去除胰酶；[0065]3)使用时，细胞外基质悬液重悬脂肪来源内皮祖细胞，内皮祖细胞数量保持在5×106个/mL。
[0066]实施例6
[0067]富含内皮祖细胞的细胞外基质悬液应用
[0068]使用实施例5制备自体脂肪富含内皮祖细胞和细胞外基质悬液对雄性勃起障碍进行调理收集实验数据，其中细胞外基质和生理盐水体积比为1：10，内皮祖细胞数量保持在5×106个/mL，采用阴茎海绵体注射，每60天注射一次，3次注射为一个疗程，每次3mL，共6个点。
[0069]效果如表1(根据国际勃起功能指数设计表格)所示，在使用本发明的富含内皮祖细胞的细胞外基质悬液调理之前，受者性生活频率较低，性刺激后多数阴茎部分无法正常勃起，难以完成性生活；部分可以完成性交过程的，平均时间不足2分钟。[0070]经过一个疗程后调理后，多数受者反馈出现晨勃，性生活频率增加，自主感觉勃起强度明显增强同时尺寸明显增大，可以正常完成性交，平均性交时间有所延长。[0071]表1.自体脂肪EPC结合细胞外基质治疗雄性勃起障碍的实验数据
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综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过脂肪EPC联合细胞外基质，内皮祖
细胞血管生成作用以及修复功能，改善阴茎海绵体结构重构，增加内皮、平滑肌细胞数量促进勃起功能的恢复，并且细胞外基质来自于自体，整体安全无排斥，为很好的固定材料。[0075]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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说 明 书 附 图
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图2
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说 明 书 附 图
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