实验计划

通便玉蓉胶囊药效学部分实验计划

1. 选题的目的及意义

随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，生活节律加快，以及人口老龄化等原因，便秘人群日益增加，已成为现代生活的常见病、多发病。根据相关资料统计，便秘患者在30岁以上人群中占23%；在老年住院患者中占50%以上。便秘。便秘不但给人的正常生活带来诸多不便和痛苦，而且因为长期排便困难，会诱发和加重其他疾病，如心血管疾病、癌症、老年痴呆等，因此国内外对便秘日益重视。目前常用的通便药物仍以刺激性的蒽醌类泻药为主，如大黄、番泻叶、芦荟等。而西药通便药物则以二酚类制剂较常见。通过近二十年来的研究发现，蒽醌类药物和二酚类药物均是通过刺激肠道，从而合成和释放一些炎性介质引起肠腔积液而通便，这一过程对消化道产生一系列的毒性反应。

近年来，关于便秘的中医药研究越来越多，治疗便秘的新方层出不穷，但真正药简效捷、服用方便、适用面广、毒副作用小的新方剂型仍然稀缺。通便玉荣胶囊是精选芒硝、当归、肉苁蓉、黄芩在济川煎和前期研究硝菔通结颗粒的基础上研发的。该项目是导师所承担的陕西省教育厅产业化项目之一，并且通过初步的临床试验证实了其较好的疗效。但是由于近年来中药新药的使用过程中，中药毒性反应的增多，使人们逐渐增加对中药毒性的关注。为了证实和确保通便玉荣胶囊的临床使用安全性，本课题研究将严格按照中华人民共和国卫生部于1993年颁发的《中药新药研究指南》和国家药品监督管理局 1999年颁发的《中药新药药理毒理研究的技术要求》正规完成。

通过急性毒性实验了解并估测通便玉蓉胶囊可能存在的毒性反应及毒性程度；观察并记录在急性毒性实验中动物所出现的各种症状；计算本药的治疗指数LD50／ED50之值，最大给药量，为本药的研发提供参考信息。通过长期毒性实验了解中毒开始的时间，出现

的症状，症状发展的过程，停药后器官机能和病理损伤的发展和恢复情况。发现通便玉蓉胶囊可能引起的临床不良反应（包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、可逆性等）；推测重复给药的临床毒性靶器官或靶组织；判断临床试验的起始剂量和重复用药的安全范围；提示临床试验中需重点监测的安全性指标，为临床安全用药提供科学依据。

通过对含有芒硝、当归、肉苁蓉、黄芩的通便玉蓉胶囊的急性毒性实验和长期毒性实验的分析和评价，以清楚描述动物的毒性反应，并推断其与人体的相关性。根据中毒或死亡动物的中毒或死亡原因的分析，以及毒性反应出现的时间和恢复的时间及动物的死亡时间，等获取的数据进行全面和科学的分析，从而正确利用统计学假设检验的结果来确定实验结果的生物学意义。根据实验结果分析讨论需在临床、质量可控性研究中注意的问题。

2．立题依据

中医既往对便秘一症名称不一，《伤寒论》既有阳结，阴结，脾约之称，其后又有风燥，热燥，气秘，热秘，等说，在临床上是一种常见病，多发病，据资料统计在65岁以上的老年人群中发病率高达25%。本并以患者自然排便次数减少，缺乏便意，粪便排出困难或排便间隔时间过长或有便意而排不出为特征。轻者无明显不适，若粪块过于坚硬，可引起痔疮，腹痛，肛裂，甚至压迫骶神经。由于肠道食物残渣，代谢产物及毒素不能及时排出，可引起轻度毒血症，表现为食欲减退，恶心，口苦，精神萎靡，头昏乏力，全身酸痛，继之引起轻度贫血与营养不良等。便秘不但给人的正常生活带来诸多不便和痛苦，而且因为长期排便困难，会诱发和加重其他疾病，如中风或心肌梗死。随着我国人口老龄趋势加快，习惯性便秘已成为一个公共卫生问题。

祖国医学认为脾为后天之本，五脏气血生化之源，主运化，升清，其气宜升；《素问·经脉别论》言：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀

胱，水精四布，五经并行。”《灵枢本藏》篇曰：“脾下则下加于大肠，下加于大肠则藏苦受邪。”胃为水谷之海，主受纳、腐熟水谷。主通降，已降为和。《素问·逆调论篇》曰：“胃者，六腑之海，其气宜下行。阳明逆，不得从其道，故不得卧也。”说明脾气升发，使水谷精气得以上归于肺，输布全身，协调五脏六腑功能，以保持蓬勃生机，这个吸收输送过程的启始动力是脾气；胃气下降，使水谷入口下行经食道、胃、小肠，由小肠转化分清泌浊后继续下行，直至糟粕排出，协调脏腑九窍相通，以保持浊阴出窍，这个通降下行过程的启始动力是胃气。

肠腑之通降既赖脾胃之转输，亦赖肺气之肃降，《医经精义·脏腑之官》说：“大肠之所以能传导者，以其为肺之腑。肺气下达故能传导。”《石室秘录·脏腑治法》云：“大便闭结者，人以为大肠燥甚，谁知是肺气燥乎？肺燥则清肃之气不能下行于大肠。”故肺气不降可致气机郁滞，通降失常传导失职，糟拍内停而致便秘不下。《素灵微蕴·卷四》云：“肺与大肠表里同气,肺气化津,滋灌大肠,则肠滑而便易。”肺为水之上源，通调水道，参与水液代谢，而大肠亦参与水液代谢，能吸收食物中之水分，使大便成形。反之则引起大便秘结。盖肺主一身之气、行治节，受吸入之清气与水谷之气结合而成。肺气虚弱无力抗邪, 常易引起肺气宣肃无权大肠传导失司则大肠运行无力，使糟粕停于肠道过久而便秘。大肠接受小肠下注的浊物，吸收水分后才能形成粪便排出体外。这一生理变化过程，称之为“燥化过程”、“变化出焉”。按照子午流注次序，肺经从寅时开始，流注到大肠为卯时，此时大肠气血充盈，有助于排便。肺与大肠的表里关系，生理上相互为用，病理上相互影响，肺失肃降津液不能下达，可致大便艰涩。肺气不降可致气机郁滞，通降失常传导失职，糟拍内停而致便秘不下。从而说明，便秘一证，虽责其肠胃，然与肺脏息息相关。

中医在虚实辨证的基础上把便秘分为伤寒、热病便秘、杂症便秘、单纯性便秘。

（1）单纯性便秘：表现多无明显寒热，而以气阴之证表现突出。①气滞便秘证：腹胀

胸闷，气窜顶胀，有腹痛无定处，欲便不得之感，便后腹胀可缓解，或便后仍觉不爽，苔薄白，脉沉弦或兼头晕心烦；②气虚便秘证：欲辩难出，临厕努挣乏力，气短，大便不干结，便后疲惫，舌质淡，脉虚弱；③津血不足：便秘干结如羊粪，排便难，肛门裂痛，口干口渴，失眠心烦，苔薄或净，舌质或嫩或红，脉沉细数。

（2）杂证便秘：多为症状性便秘。①热秘：大便干结，小便短赤，身热而红，口臭口干，舌红苔黄，脉滑数，或兼腹胀痛；②气秘：大便秘结，嗳气频做，胸胁痞满，腹胀痛窜，舌苔薄，脉弦；③血瘀便秘：小腹拒按，冷痛，大便秘结，粪硬色黑暗，甚则少腹结块，苔白质暗，脉沉弦或弦涩；④气虚秘：大便秘而不结，虽有便意，临厕努挣乏力，面色白，神疲气怯，苔薄脉虚；⑤血虚秘：大便秘结，面色无华，头晕心悸，舌唇淡，脉细涩。

（3）伤寒、热证便秘：多为外感内伤热证便秘。①表里同病：大便秘结不行，发热恶风，全身酸痛，舌苔薄白，脉浮；②少阳阳明合病：大便秘结，胸胁满痛，拒按，寒热往来，口苦咽干，苔薄黄腻，脉弦滑数；③胆腑实证：大便秘结，腹胀腹痛，痛不喜按，身热或日甫潮热，苔厚黄腻，脉沉弦；④温热津枯：便秘干结，午后发热，阴虚盗汗，口干思饮，舌质红绛，少苔，脉细数或兼弦。

3.研究内容

（1）古代医籍论治便秘的历史沿革

（2）便秘病在大肠，脾、胃、肺之病是发病的主要因素

（3）气阴亏虚，脾肾亏虚，肠道失润，推动乏力，糟粕停聚为便秘的主要中医病理机

制

（4）益气养阴，软坚润燥，健脾补肾，运下通便为便秘的治疗原则

4.实验设计

4.1前期试验

（1）有效计量的确定实验 昆明小鼠，雌雄各半， 30只，设立大剂量组，中剂量组，小剂量组，随机分组，按照临床应用量（肉苁蓉15g、当归20g、黄芩7g、芒硝10g）换算给小鼠进行灌胃给药。通过收集小鼠每天排便，进行称重，干燥，二次称重以确定有效剂量。

（2）有效工艺的确定为了解决通便玉蓉胶囊中当归和肉苁蓉的挥发油问题，取昆明小鼠60只，雌雄各半，设置组，随机分50%醇提组和水提组每日灌胃一次连续7天，实验结束后禁食不禁水12小时，次晨再给药一次，给药后观察第一粒排便时间，6小时内排便粒数及排便重量。

4.2药效学实验及拆方分析

（1）对正常小鼠排便影响 昆明小鼠90只，雌雄各半，按性别体重随机分为6组，对照组蒸馏水、大中小剂量组、阳性对照组、西药对照组，每日灌胃一次连续7天，实验结束后禁食不禁水12小时，次晨再给药一次，给药后观察第一粒排便时间，6小时内排便粒数及排便重量。

（2）对地芬诺酯引起的便秘模型小鼠排便影响 6组，阴性对照组、模型组、模型加

受试药大中小3个剂量组、模型加阳性对照组、每组15只，每日灌胃一次连续7天，实验结束后禁食不禁水12小时，便秘模型组和各剂量组先灌胃给予地芬若酯，一小时后各剂量组给予受试药物，便秘模型组和阴性对照组给予等容积蒸馏水，间隔20分钟，再以碳素墨汁灌胃给予，观察每组小鼠首次排黑便时间，和6小时内排便粒数及排便重量。

（3）对燥结性便秘模型小鼠排便影响 小鼠60只，15只作为对照组正常饲养，其余造模，禁水大米喂养3天，实验前各组小鼠禁食不禁水12h，将造模组随机分为5组：模型加受试药大中小3个剂量组、模型加阳性对照组、空白对照组和模型对照组给予等容积蒸馏水，药液中及水中含2%的墨汁。给药后连续观察4h,记录小鼠首次排黑便时间，和6小时内排便粒数及排便重量，比较各足动物上述指标差异。

（4）对便秘小鼠排便时间及粒数的影响昆明小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即正常对照组、模型对照组、麻子仁丸组、通便玉蓉胶囊小、中、大剂量组，每组10只。动物禁食不禁水12h，除正常对照组外，其余各组按照文献，灌服地芬诺酯混悬液50mg/kg造模。30分钟后，予所有小鼠称重并记录，正常对照组和模型对照组每天给予生理盐水15ml/kg·d灌胃，麻子仁丸组每于予每天给予麻子仁丸3.2g生药/kg·d灌胃，通便玉蓉胶囊小、中、大剂量组分别予通便玉蓉胶囊8.1g生药/kg·d、16·2生药/kg.d、32.4g生药/kg·d灌胃。上述各组所灌食液中均含有2%的墨汁。给药后将小鼠分别放入铁笼中，在笼下垫上滤纸，连续观察8h，记录小鼠第一次排黑便时间，4h内、8h小鼠排出干粪便总粒数、干粪便重量、稀粪点数和不排便动物数。结束后再次对所有小鼠称重，并记录，观察治疗前后小鼠体重的变化情况。

（5）对便秘小鼠小肠运动的影响 取昆明种小鼠120只，雌雄各半。实验前小鼠禁食不禁水8h。分组、造模方法均同实验（1）。30min后，麻子仁丸组予每天给予麻子仁丸3.2g生药/kg·d灌胃，硝菔通结颗粒小、中、大剂量组分别予硝菔通结颗粒8.1g生药/kg·d、

16·2生药/kg.d、32.4g生药/kg·d灌胃；正常对照组、模型对照组含给予等量生理盐水（15ml/kg·d）灌胃。末次给药30min后，各组小鼠均按0.02ml/g的剂量给予碳末混悬液（9%生理盐水100mL+10g阿拉伯树胶+10g碳末）。再过后20min后，小鼠脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门、下端至回肠部的肠管，置于托盘上。轻轻将小肠摆成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至墨汁前沿的距离作为“碳末在肠内推进距离”。用公式计算墨汁推进百分率，并注意观察各组小肠容积是否增大。

碳末推进率(%)＝碳末推进距离(cm)/小肠总长度(cm)×100％

（6）对便秘小鼠大肠动力的影响

对便秘小鼠大肠运动的直接影响：取昆明种小鼠90只，雄各半。实验前禁食不禁水12h。实验前一天予小鼠腹腔注射乌拉坦（1g/kg），剪去腹中部的毛，在腹中部沿腹中线做5～6cm长的切口，打开腹腔。把内径为1mm的塑料管由回盲部插入结肠1cm，结扎固定。塑料导管通过肌肉皮肤从背部引出，以备给药。腹部切口缝合后将小鼠放回笼内，术后小鼠禁食不禁水。

次日将手术过的90鼠分为6组，分组、造模方法、各组所给药物及剂量均同实验（1）。末次给药30min后，各组小鼠由塑料导管向结肠内所灌注的药液中均含有2%的墨汁。所有小鼠灌注药液后立即计时；给药后10分钟将小鼠猛击头部处死。立即找开腹腔，用眼科剪将结肠由肛门到盲肠端剪下，放在用水湿润的小木板上（或玻璃板上），仔细分离肠系膜，并将结肠摆直，用米尺测量结肠总长度和墨汁推进距离，按下式计算墨汁推进百分率。

墨汁推进百分率(%)＝墨汁推进距离(cm)/结肠总长度(cm)×100％

对便秘小鼠肠运动的间接影响：所有小鼠禁食不禁水12h后，分组、造模方法、各组所给药物及剂量均同实验（1），但所有灌食液中均不含色素指示剂。每只小鼠灌胃后立即放入钟罩内浅麻醉，背位固定在手术台上，剪去腹部的毛，沿腹中线做5～6cm长切口。找到回盲部，各组小鼠均由回盲部用注射器灌注含墨汁的生理盐水2ml/kg。在靠近回盲部的回肠用双线做结扎，在两线之间剪断回肠，立即计时。将肠放回腹腔、缝合切口。2h后处死小鼠，按上法剪下结肠、测量结肠总长度和墨汁推进距离，计算推进百分率。

（7）对便秘小鼠不同肠段水分吸收的影响：昆明种健康小鼠90，雌雄各半，禁食不禁水12h后，称重并标号。所有小鼠分组、造模方法、各组所给药物及剂量均同实验（1），且所有灌食液体体积相等。给药后2h将各组小鼠用脱颈处死，然后用手术剪刀剪开腹部皮肤及腹膜，暴露肠管；用眼科剪刀剪开肠系膜，小心自幽门下端用线结扎，剪断肠管；再于回盲部上边结扎，剪断肠管，取出该段小肠。再于直肠末端结扎，剪断肠管，取出大肠。分别用天平称量各鼠的小肠和大肠湿重并记录，然后将各鼠小肠和大肠均放在方盘内，再将方盘放在干燥箱里烘干，取出称重。然后按下式计算肠内水分含量。

水分含量(%)＝[湿重(g)－干重(g)]/干重(g)×100%

（8）拆方分析试验昆明种健康小鼠60只，雌雄各半，分为肉苁蓉组、当归组、黄芩组，芒硝组以及混合制剂组，日灌胃一次连续7天，实验结束后禁食不禁水12小时，次晨再给药一次，给药后观察第一粒排便时间，6小时内排便粒数及排便重量。

5.实验经费预算

昆明小鼠：1500 只*元=

实验试剂：

垫料、笼具及饲料：

仪器使用及其他费用：