陈颖婷;刘芳;王琼;印琳;杨杰;陈峥宏;张永宏
【摘 要】目的：应用实时荧光定量PCR（q PCR）快速检测幽门螺杆菌（H.pylori）核酸。方法：胃镜检查获取的120例胃疾病患者胃黏膜标本,采用分离培养、PCR和q PCR检测H.pylori特异性16Sr DNA的方法诊断H.pylori感染,比较3种方法检测结果的阳性率;收集30例H.pylori感染确诊患者的粪便标本,采用酶联免疫分析法检测H.pylori抗原（H.pylori-Ag）及q PCR法检测H.pylori感染情况,比较两种方法的H.pylori检出率。结果：120例胃肠道病疾患者的胃黏膜中,分离培养出H.pylori 46例,阳性率为38.33%;16Sr DNA PCR检测出H.pylori60例,阳性率为50.00%;q PCR检测出H.pylori 93例,阳性率为77.50%;3种方法阳性率经χ2检验,P〈0.05,q PCR法检出率大于分离培养及普通PCR法;18例14C-UBT阳性患者的粪便H.pylori-Ag的阳性率为5.55%,q PCR阳性率为22.22%,经χ2检验,P〉0.05。结论：q PCR法可快速检测胃黏膜中H.pylori核酸。
【期刊名称】《贵州医科大学学报》 【年(卷),期】2016(041)010 【总页数】5页(P1133-1136,1140)
【关键词】螺杆菌,幽门;胃黏膜;粪便;细胞培养;实时荧光定量PCR 【作 者】陈颖婷;刘芳;王琼;印琳;杨杰;陈峥宏;张永宏
【作者单位】[1]贵州医科大学附院消化内科,贵州贵阳550004;[2]贵州医科大学微生物学教研室,贵州贵阳550025
【正文语种】中 文 【中图分类】R446.5
幽门螺杆菌(helicobacter pylori,H.pylori)是一种定植于胃黏膜上皮细胞表面的微需氧的革兰阴性螺旋杆菌。已有研究表明,慢性活动性胃炎、消化性溃疡及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)与H.pylori感染相关[1-2] 。世界人口H.pylori感染率高达50%, 发展中国家高于发达国家[3]。H.pylori感染的检测方法包括无创性的血清抗体检测、尿素呼气试验、粪便H.pylori抗原检测(H.pylori-Ag)以及经胃镜取材后进行细菌分离培养、组织尿素酶试验及PCR扩增H.pylori[4] ,这些方法均各有优缺点。荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)是近年来发展成熟并且已经用在一些微生物感染诊断中的实验技术,具有高特异度及灵敏度的特点,并能对病原体核酸进行定量分析。本研究采集疑是H.pylori感染者的胃黏膜和粪便,分别以分离培养法、组织16SrDNA PCR、组织和粪便荧光定量PCR以及粪便H.pylori-Ag检测进行H.pylori感染的诊断,探讨qPCR检测H.pylori感染的应用前景。 1.1 标本来源
收集2015年10月～12月消化内科收治的具有恶心、呕吐、反酸、烧心等上消化道不适症状且14C-尿素呼气试验(14C-UBT)均为阳性的30例患者的粪便标本及经胃镜检查显示有胃部疾病患者的胃黏膜组织标本120例，患者均知情并同意,项目通过伦理委员会批准。排除4周内服用过质子泵抑制剂、抗菌药物、铋剂，或合并严重腹泻及消化道出血的患者。 1.2 主要仪器及试剂
PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)、电泳仪(北京市六一仪器厂,DYY-8C型)，MH琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司,110701)，紫外观察仪(上海, ZF-
401)，组织DNA提取试剂盒购自北京天根生物工程有限公司，DNA marker(100 bp)购自北京天根生物工程有限公司，2×Taq PCR Master Mix购自北京天根生物工程有限公司。H.pylori菌种特异性16Sr RNA基因引物,上游引物
5′CTTGCTAGAGTGCTGATTA 3′,下游引物5′TCCCACACTCTAGAATAGT 3′,由北京天根生物工程有限公司合成。H.pylori-Ag检测试剂盒购自上海劲马生物科技有限公司，粪便DNA提取试剂盒购自MP Biomedical，H.pylori核酸测定试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司。 1.3 方法
1.3.1 胃黏膜组织中H.pylori分离培养 将活检胃组织标本剪碎制备成组织悬液,取100 μL接种于H.pylori选择性培养基[5](剩余组织悬液用于DNA的提取),置37 ℃微需氧培养3 d。3 d后,挑取可疑菌落进行革兰染色镜检、尿素酶活性试验和传代培养。H.pyloriSS1菌株为质控菌株,作为实验中的阳性对照。
1.3.2 胃黏膜组织中H.pylori 特异性16SrDNA 片段的PCR扩增 应用组织 DNA 提取试剂,按试剂盒说明书操作分别提取胃黏膜组织中DNA及SS1菌株DNA,采用2×Taq Master Mix和H.pylori菌种特异性16Sr DNA引物进行PCR扩增[6]。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,紫外检测仪下观察。
1.3.3 胃黏膜组织中H.pylori 16SrDNA的qPCR扩增 取胃黏膜组织及试剂盒自带的阳性对照和阴性对照品DNA各4 μL作为PCR反应模板，加至36 μL含H.pylori核酸荧光PCR检测混合液与酶(Taq+UNG)的混合液，置于PCR管中,立即进行H.pylori特异性16 SrDNA核酸片段的PCR扩增反应。根据临床样本检测结果绘制受试者工作曲线(ROC)，确定本试剂盒的阳性判断值Ct=38， Ct≤38为H.pylori阳性；Ct值在38～40，重新检测，仍在38～40，表明样本中H.pylori低于检测限，报告为阴性；若未出现相应的溶解曲线为幽门螺杆菌阴性。 1.3.4 粪便中幽门螺杆菌抗原(H.pylori-Ag)酶联免疫分析 留取患者当天粪便,在室
温环境中,用取样棒挑取粪便约200 mg至无菌1.5 mL Epp管中,加入生理盐水400 μL；充分摇匀，2 000 r/min离心5 min,取上清液10 μL加于含稀释液40 μL的酶标板孔内,每孔加入酶标试剂50 μL,测量各孔的吸光度(OD450nm值)，在加终止液后15 min内检测粪便中H.pylori-Ag, 按试剂说明书判断阳性及阴性结果。
1.3.5 粪便中H.pylori核酸的qPCR检测 称取500 mg粪便样本,采用粪便DNA提取试剂盒提取粪便中细菌总DNA,参照1.3.3项下方法检测粪便DNA中H.pylori特异性16 SrDNA核酸片段。 1.4 统计学分析
用SPSS 17.0统计软件进行分析,分离培养、普通PCR和qPCR检测胃黏膜中H.pylori的阳性率比较及qPCR、H.pylori-Ag-ELISA检测粪便标本H.pylori的阳性率比较采用χ2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。 2.1 胃黏膜组织中H.pylori检测结果
120例胃黏膜组织标本中，经微需氧培养3 d,有46例在MH血琼脂平板上见无色针尖样细小菌落,革兰染色镜检为革兰阴性螺杆菌,培养物尿素酶试验阳性；有60例H.pylori 特异性16SrDNA PCR扩增阳性，扩增产物与阳性对照SS1的扩增产物分子量一致,均约为550 bp(图1)； 93例H.pylori 特异性16SrDNA qPCR扩增结果为阳性。3种方法H.pylori阳性率经χ2检验, P<0.05, qPCR法检出率大于分离培养及普通PCR法；见表1。2.2 粪便H.pylori检测结果
阳性对照孔平均OD值=2.034,阴性对照孔平均OD值=0.081,试验有效。临界值=0.081+0.15=0.231。 30例粪便标本中，有22例进行了粪便H.pylori-Ag检测,只有1例样本的OD值大于临界值,其余样品的OD值均小于临界值,其阳性率为4.54%；26例粪便样本进行了粪便H.pylori qPCR检查, 有7例样品阳性,阳性率为26.92%,见表2。30例患者中有18例患者同时行两种非侵入性检测, 粪便
H.pylori-Ag的阳性率为5.55%，H.pylori qPCR检测的阳性率为22.22%。两者相比, P>0.05,见表3。
H.pylori的诊断方法分为侵入性和非侵入性,前者需借助胃镜采集胃黏膜标本进行检查,包括细菌培养、直接染色镜检、组织脲酶分解试验 (RUT)、PCR检测组织中H.pylori核酸；非侵入性检查常用碳标记呼吸实验 (UBT)以及血清学诊断。各个诊断方法各有利弊,但从传染病学角度来看,诊断的金标准是分离培养检测。分离培养法是将胃黏膜活检标本接种在培养基上,微需氧环境下培养,如培养出幽门螺杆菌即可诊断为幽门螺杆菌感染。但它需要经费、时间和人力较多,临床无法开展,主要用于科学研究。且胃黏膜组织中细菌量过少,细菌繁殖能力差、受运送条件的影响较大以及对氧敏感等因素可能会影响H.pylori的培养而导致假阴性。目前临床上应用最普遍的检测H.pylori的方法是13C或 14C-呼气试验(UBT),此方法的优点是无创、方法简便, 但14C-尿素呼气试验需口服放射性同位素,对人体及环境[7]有一定的影响,而且对于明确有胃下垂、胃轻瘫、晚期胃癌、幽门梗阻、十二指肠淤滞症和高位梗阻的患者,不宜采用尿素呼气试验[8]。并且有研究发现在患有上消化道疾病患者的胃内还存在其它具有尿素酶活性的非幽门螺杆菌菌群,因此13C或14C-尿素呼气试验也会出现一定的假阳性[9]。在本课题组中所进行的另一项关于C14尿素呼气试验阳性患者胃内细菌的选择性培养的研究中,发现以H.pylori选择性培养基,从352例患有上消化道疾病病人的胃黏膜组织中,分离培养出H.pylori 135株(阳性率38.4%)；分离培养出非H.pylori 124株(阳性率35.2%),其中尿素酶阳性的菌株为76株,提示13C或 14C-呼气试验(UBT)存在假阳性。
多数观点认为粪便抗原检测法无任何不良反应,患者不需要口服任何试剂,为完全非侵入性检查,无任何毒性反应,适用于所有年龄和所有类型的患者,且操作简便,无须昂贵仪器,可在没有尿素呼气试验条件时替代呼气试验[10]。此外,由于检测的是
H.pylori抗原,因此可反映H.pylori现症感染情况[11]。然而,本研究中18例同时进行粪便抗原及粪便实时荧光定量PCR的检测结果显示,H.pylori-Ag的阳性率仅为5.55%,检出率较低,这可能因为试剂运输、贮藏条件不适造成准确性下降,并且检测结果的准确性也受到在样品制备过程中操作人员和操作方法差异的影响[12]。 近年来,越来越多学者开始探究具有特异性强、灵敏度高、快速简便,受外界干扰因素较少的检测H.pylori感染的方法。H.pylori生长缓慢,有些H.pylori菌株具有感染性却处于“活的不可培养状态”(viable nonculturable, VNC) ,同时H.pylori有可能在病例采集、处理及保存过程中失活,导致检出率不高,但其DNA仍然能检测出[13]。H.pylori特异性16SrDNA PCR能对H.pylori的特异性核酸片段进行扩增,具有灵敏度高,特异性强的特点,因此可被用来检测H.pylori的感染。本研究对120例胃肠道疾病患者的胃黏膜组织通过分离培养和16SrDNA PCR检测H.pylori感染,发现16SrDNA PCR的检出率要高于分离培养法。普通PCR技术虽然特异性高,但由于其采用凝胶电泳检测PCR产物,易产生交叉污染,可能导致假阳性,并且模板DNA的质和量不符要求,也会出现假阴性。qPCR实行完全闭管式操作,很大程度上减少了扩增产物污染的机会,不仅能自动读数并且可以对扩增产物进行适时定量,提高反应的精确度,而且操作简便,结果可靠[14],与其它方法相比具有许多优点[15]。本实验运用qPCR检测胃黏膜中H.pylori,发现其H.pylori检出率为(77.50%),显著高于普通PCR法(50.00%)和分离培养法(38.33%)。虽然本研究中粪便H.pylori qPCR检测与粪便H.pylori-Ag检测相比,检出率差异虽无统计学意义,但粪便qPCR检测灵敏度高,特异性好,同时可对患者进行定量检测H.pylori核酸数量,在检测H.pylori感染的同时可为临床根除H.pylori感染的药物治疗提供科学依据。由于H.pylori治疗后qPCR可以发现H.pylori基因拷贝量的下降,因此,qPCR用于评价药物疗效也是极敏感的指标,可作为随访的方法。并且对于幽门螺杆菌感染流行病学的调查研究具有取材方便、标本易于保存、检查耗时短的优点,
适合进行幽门螺杆菌感染大规模筛查,因此值得进一步采集临床样本进行验证。
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