doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2012.10.014
TianjinMedJ,Oct2012,Vol40No10
Ⅰ期非小细胞肺癌相关血清差异表达蛋白的研究
王冬滨
摘要
张逊△韩洪利徐医军石珍亮
目的：寻找I期非小细胞肺癌（NSCLC）与健康人血清的差异表达蛋白。方法：收集天津市胸科医院经手
术、病理证实的6例I期NSCLC患者血清，等量混合后设为肺癌组；同期15例健康体检血清，等量混合后设为健康对照组。利用双向凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分离、筛选和鉴定2组间的差异表达蛋白。结果：成功获得了2组的双向凝胶电泳图谱，PDquest软件分析显示，2组间差异大于2倍的蛋白质点共有128个，质谱鉴定后确定了10种蛋白质，其中7种表达量上调，分别为α1-酸性糖蛋白、C1酯酶抑制物、血管紧张素原、转铁蛋白、转甲状腺素蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2及无花果酶-3；3种表达量下调，分别为纤连蛋白、补体C4-A及补体C3。结论：应用2-DE及MALDI-TOF-MS在I期NSCLC血清中鉴定出
4种与肿瘤关系密切的差异表达蛋白，可作为开发NSCLC早期诊断标志物的候选蛋白。
关键词
肺肿瘤
癌，非小细胞肺
血清
电泳，凝胶，双向
光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离
早期诊断
StudyonDifferentiallyExpressedSerumProteinsofStageINon-Small
CellLungCancer
WANGDongbin,ZHANGXun,HANHongli,XUYijun,SHIZhenliang
TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China
Abstract
Objective:ToseekdifferentiallyexpressedserumproteinsrelatedtostageInon-smallcelllungcancer
(NSCLC).Methods:Theserasooflungcancergroupwerecollectedandequallymixedfrom6patientswhoweresurgicallyandpathologicallydiagnosedasstageINSCLCinTianjinChestHospital.Theserasamplesofcontrolgroupwerecollectedandequallymixedfrom15healthysubjectsinthecorrespondingperiod.Two-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE)andmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry(MALDI-TOF-MS)wereemployedtoscreenandidentifydifferentiallyexpressedserumproteinsintwogroups.Results:Two-dimensionalelectrophoreticpatternsofserumproteinsweresuccessfullyobtainedfromserasamplesoftwogroups.PDquestsoftwareshowedthat128differentiallyexpressedproteinspotsoftwogroups.TenproteinsweresuccessfullyidentifiedviapeptidemassfingerprintingusingMALDI-TOF-MS.Amongthem,7proteinswereoverexpressed,includingalpha-1-acidglycoprotein,C1inhibitor,angiotensinogen,transferrin,transthyretin,inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH2andficolin-3.Whereasthreeproteinswereunderexpressed,includingfibronectin,complementC4-AandcomplementC3.Conclusion:Fourdifferentiallyexpressedproteins,closelyrelatedtocancer,canbeseparatedandidentifiedinserasamplesofpatientswithstageINSCLCby2-DEandMALDI-TOF-MS,whichmayserveascandidatebiomarkersforearlydetectionofNSCLC.
Keywords
lungneoplasms
carcinoma,non-small-celllung
serum
electrophoresis,gel,two-dimensional
spectrometry,mass,matrix-assistedlaserdesorption-ionizationearlydiagnosis
目前尚缺乏能用于肺癌早期诊断的特异性肿瘤标志物[1-2]。蛋白质组学具有高通量、高灵敏、高效率的特性，应用蛋白质组学技术研发新型高效的肿瘤早期诊断标志物已成为临床研究的热点[3-4]。本研究应用蛋白质组学及生物信息学技术对Ⅰ期非小细胞肺癌（NSCLC）患者与健康人的血清蛋白进行分离、筛选和鉴定，寻找与肺癌相关的差异表达蛋白。
1
1.1
资料与方法
一般资料
（1）血清：肺癌组血清来自天津市胸科医院
2011年9月—11月经手术、病理学检查证实的I期（UICC2009版）NSCLC患者6例，男2例，女4例，年龄52～75岁，
包括4例腺癌、1例鳞癌和1例腺鳞癌；同期选取健康体检样品15例血清为健康对照组。（2）试剂：固相pH梯度干胶条（IPGdrystrippH3～10，17cm）、IEFbuffer（pH3～10）、三丁基
作者单位:300070
△
天津医科大学（王冬滨）；天津市胸科医院（王
冬滨，张逊，韩洪利，徐医军，石珍亮）
通讯作者
E-mail:zhangxun_2000@163.com
天津医药2012年10月第40卷第10期
1013
描后的图像。比较2组2-DE图谱，寻找差异蛋白质点。蛋白的相对表达量用扫描积分光密度值来表示，2组间量升高或者降低2倍者被定义为差异点。在2组的双向电泳凝胶上挖取差异蛋白质点，经脱色、胶内酶解及肽段抽提，进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析，鉴定差异表达蛋白。
膦（Tributylphosphine，TBP）均为Bio-Rad公司产品；尿素、二硫苏糖醇（DTT）、CHAPS、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟基氨基甲烷（Tris）、碘乙酰铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、矿物油、甘油均为Sigma公司产品；硫脲为Fluka公司产品；
PROTEOEXTRACTALBUMIN/IGGREMOVALKIT为Merck
公司产品；考染试剂及其他常用试剂均为国产分析纯。（3）仪器：等电聚焦仪（ProteanIEFcell）、垂直电泳系统（Protean
PlusDodecacell）、透射扫描仪（UmaxPowerLook2100XL）均
购自Bio-Rad公司，图像分析软件为PDquest8.0（Bio-Rad公司），质谱仪ABI4700ProteomicsAnalyzer（美国ABI公司）。
22.1
结果
血清2-DE蛋白表达图谱的建立和比较
2组
1.2方法（1）血清收集：取2组研究对象的清晨空腹肘正
的双向电泳凝胶上均得到了清晰的2-DE蛋白表达图谱。每组的3张2-DE图谱平均蛋白质点数约（330±12）个，经PDquest软件分析，2组间共有128个差异点，其中肺癌组上调的差异点96个，下调的差异点32个，见图1。
中静脉血3mL（肺癌患者于手术日晨取血），于4℃放置60
min，3000r/min离心10min，吸取血清，分装，保存于-80℃
冰箱备用。（2）标本混合：为减少个体间差异，使样本在最大程度上反映组内不同个体的共性，采用混合血清的方法，将肺癌组6份血清分别取50μL进行混合，同方法混合健康对照组15份血清，2组的混合标本应用PROTEOEXTRACT
2.2差异蛋白的质谱鉴定结果在肺癌组和健康
对照组的双向电泳凝胶上共挖取59个差异明显的蛋白质点，经MALDI-TOF-MS分析，成功鉴定出10种差异表达蛋白，其中7种在肺癌组表达量上调，3种在肺癌组表达量下调，见图2、表1。转铁蛋白的肽质量指纹图谱（peptidemassfingerprinting,PMF），见图3。
ALBUMIN/IGGREMOVALKIT去除高丰度蛋白质，Bradford
法测定血清蛋白浓度，进行2-DE分离比较。参考文献[5]和仪器操作手册进行。每张电泳图重复3次。2-DE所得凝胶进行考马斯亮蓝染色。
1.3凝胶图像分析及差异点的质谱鉴定用Umax透射扫
描仪获取染色后的2-DE凝胶图像。用PDquest软件分析扫
Table12-DEproteinprofilesanddifferentialproteinspotsinlungcancergroupandhealthycontrolgroup
表1
对应胶原始编号
蛋白gi号
肺癌组和健康对照组2-DE蛋白表达图谱及差异点
蛋白名称
肺癌组表达量
上调上调上调上调上调上调上调下调下调下调
蛋白得分
蛋白得分C.I.%
等电点（PI）
相对分子质量
2601260235133701520363046619530956125709
1128771240961138805595806345077253718126831310427181175238119370332300669710
α1-酸性糖蛋白C1酯酶抑制物血管紧张素原
间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2转甲状腺素蛋白无花果酶-3转铁蛋白补体C4-A补体C3纤连蛋白
49.175.161.6158.0149.073.550.051.5193.0110.0
98.78999.99799.932100.000100.00099.99699.01699.303100.000100.000
4.936.095.876.565.526.306.816.656.025.46
237245534753405105606159912486579294194247188569266052
蛋白得分C.I.%>95%认为对应蛋白点得到有效鉴定，否则视为未得到鉴定
1009080706050403020100699.0
4700ReflectorSpec#1MC[BP=1494.8,4845]
4845.1
强度（%）1361.82024.6
质荷比（m/z）
2687.43350.24013.0
Figure3Peptidemassfingerprintingoftransferrin
图3
转铁蛋白的肽质量指纹图谱
10143
讨论
TianjinMedJ,Oct2012,Vol40No10
Pathol,2011,4(6):575-586.
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（2011-12-15收稿
α1-酸性糖蛋白（α1-AG）是一种由肝脏合成的
急性时相蛋白。Kasprzyk等[6]采用火箭免疫电泳法检测了46例肺癌患者手术前多种血清急性时相蛋白水平，结果显示T3、T4期肺癌患者血清α1-AG水平明显升高。本研究结果显示，α1-AG在I期
NSCLC血清的双向凝胶电泳图谱中表达量升高，提示其有可能成为NSCLC的早期诊断指标。研究表明
血清游离转铁蛋白（Tf）可以替代生长因子，促进乳腺癌细胞的增殖。Jou等应用蛋白质组学技术并
[7]
[8]
经酶联免疫吸附试验确认唾液Tf是早期口腔癌的生物学标志物。本研究中差异蛋白的质谱鉴定结果显示，在I期NSCLC血清中Tf表达量升高，与上述文献报道相近。
[J].JProteome
Liu等应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SEIDI-TOF-MS）比较肺癌和正常人血清以寻
[9]
找肺癌标志物，发现联合应用转甲状腺素蛋白（TTR）和血清淀粉样蛋白A（SAA）能够有效地诊断肺癌，阳性率达91.6%。本研究结果显示，TTR表达量升高，推测其原因可能是机体发生肺癌时，通过肿瘤免疫机制产生TTR，抑制肿瘤细胞增殖，从而出现血清TTR水平的升高[10]。
间-α-胰蛋白酶抑制剂重链（ITIH）基因是一种抑癌基因[11]。有研究表明吸烟者血清中ITIH3蛋白表达下调，可以作为烟草暴露相关疾病的候选标志物。最近，多项研究认为ITIH4是乳腺癌的肿瘤标
[12]
志物，在乳腺癌患者血清中表达上调，有助于诊断和判断预后[13-14]。本研究结果显示，在I期NSCLC血清2-DE蛋白图谱中ITIH2表达量升高，但其在肺癌发生发展中的具体作用机制及其作为诊断标志物的价值还有待进一步研究。
综上所述，本研究通过蛋白质组学技术成功分离和鉴定了多种I期NSCLC血清的差异表达蛋白，其中α1-AG、Tf、TTR、ITIH2表达升高且与肿瘤发生关系密切，为开发NSCLC新型血清诊断标志物提供了重要的候选蛋白。
（图1、2见插页）
参考文献
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biomarkersforearlydetectionoflungcancer[J].IntJClinExp
[J].JProteomeRes,2011,10(3):
2012-02-24修回）
陆荣展）
（本文编辑
Ⅰ期非小细胞肺癌相关血清差异表达蛋白的研究
（正文见1012页）
A:肺癌组蛋白表达图谱；B:健康对照组蛋白表达图谱；红色“□”是肺癌组上调的差异点，蓝色“△”是肺癌组下调的差异点；
A：肺癌组；B：健康对照组；“↑”箭头所指为肺癌组量增高的差异点，“墼”箭头所指为肺癌组量减低的差异点
A图比B图多出的红色“□”是肺癌组特有的上调差异点
Figure12-DEproteinprofilesanddifferentialproteinspotsinlung
cancergroupandhealthycontrolgroup
图1
肺癌组和健康对照组2-DE蛋白表达图谱及差异点
Figure2Differentialproteinspotsidentifiedvalidlyin2-DEprofiles
oflungcancergroupandhealthycontrolgroup
图2
肺癌组和健康对照组2-DE图谱上鉴定成功的差异蛋白质点
急性心肌梗死合并肠系膜动脉栓塞一例
（正文见1076页）
A：右冠状动脉
three-vessellesions
图1
B：左冠状动脉
Figure2Angiogramdemonstratedtotallyocclusionofsuperiormesentericartery图2
肠系膜上动脉完全闭塞
图3
Figure1Coronaryangiographyshowed
冠状动脉造影示患者三支血管病变
Figure3Angiogramdemonstratedrecanalizationofsuperiormesentericartery
afterthrombolysiswithurokinase尿激酶局部溶栓治疗后肠系膜上动脉
血流再通
马凡综合征并发自发性
（正文见1085页）气胸一例新生儿期肝母细胞瘤
发病误诊一例
（正文见994页）
胸部CT示左侧气胸，左肺尖肺气肿磁共振成像（冠状位，FEISTA序列）示升主动脉根部瘤样扩张
肝细胞轻度异形，细胞索紊乱，血窦形成
Figure1Mioroscopicpictureoffetal
hepatoblastoma（HE×100）
图1
胎儿型肝母细胞瘤（HE染色×100）
Figure1ResultofCTscanofthechest
图1
胸部CT结果
Figure2ResultofMRI图2
磁共振成像结果
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