剑麻遗传转化体系的建立与优化

２０１１年６月　热带农业科学　第３１卷第６期　Ｊｕｎｅ．２０１ｌ　ＣＨＩＮＥＳＥ　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＴＲＯＰＩＣＡＬ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ　Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６　剑麻遗传转化体系的建立与优化①　丁　静　，　徐　立　，∞　杜中军　李志英　，。）②　（１海南大学农学院　海南儋州　５７１７３７：　２中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所　海南儋州　５７１７３７：　３农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室　海南儋州　５７１７３７）　摘要　以剑麻无菌苗叶片为试材，研究了潮霉素（Ｈｙｇ）、菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（Ａｓ）及羧苄青霉素　（Ｃａｒ）等因素对剑麻遗传转化的影响。结果表明，剑麻最适遗传转化体系为：Ｈｙｇ选择浓度为２５　ｍｇ／Ｌ，ＯＯｅｏｏ　０．６左右的农杆菌菌液，侵染时间为ｌ０～１５　ｍｉｎ，Ａｓ浓度为２００￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｃａｒ浓度为４００　ｍｇ／Ｌ。　关键词　剑麻；遗传转化；优化；瞬时表达率　分类号￥５６３．８　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇａｖｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＤＩ　ＮＧ　Ｊｉｎｇ　・　ＸＵ　Ｌｉ　ＤＵ　Ｚｈｏｎｇｊｕｎ　ＬＩ　Ｚｈｉｙｉｎｇ　（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７　１　７３７；　２　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｃｒｏｐｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７　１　７３７　３　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７　１　７３７）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　Ａｇａｖｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｇ），ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（Ａｓ）ａｎｄ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｃａｒ）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：２５　ｍｇ／Ｌ，ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ（ＯＤ６００＝０．６）ｆｏｒ　１０～．　１５　ｍｉｎ．Ａｓ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｗａｓ　２００　ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ．Ｃａｒ　ｄｅｎｓｉｙｔ　ｗａｓ　４００　ｍｇ／Ｌ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ａｇａｖｅ　ａｍｅｒｉｃａｎａ　Ｌｉｎｎ．；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ；ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　剑麻　ｇａｙｅ　Ｏ，１Ｆｔｅｒｉｃ肌口Ｌｉｎｎ．）是龙舌兰科　李愿平等人以Ｈ．１　１６４８的珠芽为材料进行快速繁殖．　（Ａｇａｖａｃｅａｅ）／石蒜科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）龙舌兰属　发现了芽分化、芽增殖与生根培养基。吕玲玲等［８］人　ｇａｖｅ　Ｌｉｎｎ．）的多年生单子叶植物．有时也泛指龙　以剑麻的茎尖为材料通过摸索试验建立了Ｈ．１１６４８　舌兰麻类系单子叶植物　］．是经济栽培的种植园作　的高效再生体系．优化了芽分化与芽增殖的最适培　物　２＿。龙舌兰科植物共有２１个属约６７０个种＿３］。剑　养基．生根率也由８２％增至９３．３％　但到目前为止　麻叶片内含有丰富的纤维，剑麻纤维因具有质地韧、　还没有剑麻的转基因报道。本试验以剑麻无菌苗为　耐摩擦、耐酸碱等多种优良性能而被广泛应用［４－５３　材料，应用ＧＵＳ基因瞬时表达技术．建立并优化了　另外剑麻对重金属镉、铜具有一定的耐性，在重金　农杆菌介导的剑麻的遗传转化体系．为今后开展剑　属污染土壤的修复中具有很好的应用前景　］　麻转基因研究提供有效的方法　然而剑麻是多年生植物．定植后生命周期长．　Ｆ　代可育的不多．而且育种基础薄弱及育种效率不　１材料与方法　高，所以新品种的培育难度很大。再加上斑马纹病　１．１　材料　和茎腐病的影响．使剑麻的生产受到严重的威胁。　１．１．１　试剂　①基金项目：　“９４８”项目（Ｎｏ．２０１０一ｓ６）：农业部热带作物种质资源保护项目（Ｎｏ．ＩＯＲＺＺＹ）。　收稿日期：２０１１－０４—２５：责任编辑／张海东；编辑部Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｄｎｋ＠１６３．ｔｏｍ。　②通讯作者：李志英。Ｅ－ｍａｉ１：ｘｌ１ｉｚｈｉｙｉｎｇ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ。　３７　２０１１年６月　热带农业科学　第３ｌ卷第６期　组织培养所用试剂盒其他化学试剂均为国产分　析纯产品。羧苄青霉素（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，Ｃａｒ），母液浓　度为１００　ｍｇ／ｍＬ；潮霉素（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，Ｈｙｇ），母液　和Ｒｉｆ　１００　ｍｇ／Ｌ的２０　ｍＬＬＢ液体培养基中，２８℃、　２００　ｒ／ｍｉｎ震荡培养直至ＯＤｍｏ分别为０．２、０．４、　０．６、０．８、１．０，然后将菌液离心，４ｋｒ／ｍｉｎ×３ｍｉｎ，　浓度为１０　ｍｇ／ｍＬ；卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋｍ），母　液浓度为１００　ｍｇ／ｍＬ；利福平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，Ｒｉｆ），母　液浓度为１０　ｍｇ／ｍＬ：ＧＵＳ染色液【９］：５０　ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸　收集菌体．并用２０　ｍＬ液体的预培养培养基重新悬　浮。用悬浮液侵染叶片１０ｍｉｎ，每个处理３Ｏ个，３　次重复，共培养２ｄ后转移至抗性培养基上，２１　ｄ后　钠缓冲液（ｐＨ　７．０）中含０．１　ｍｏｌ／Ｌ的Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］，　０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｋｓ［Ｆｅ（ＣＮ）６］，０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎｘ一１００，　１０　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＥＤＴＡ，２Ｏ％甲醇，０．５　ｍｇ／ｍＬ　Ｘ－Ｇｌｕｃ　（先溶于少量的ＤＭＳＯ）。　１．１．２受体材料与培养基　剑麻Ｈ．１１６４８　Ｌ４ｇａｙｅ　ｈｒｂ￣ｄ　Ｎｏ．１１６４８＝　．　ａｍａｎ／ｅｎｓ／ｓ　Ｔｒｅｌｅａｓｅ　ｅｔ　Ｗ．Ｎｏｗｅｌｌ×Ａ．ａｎｇｕｓｔｆｉｏｌｉａ　Ｈａｗｏｒｔｈ）×Ａ．ａｍａｎ／ｅｎｓ／ｓ］无菌苗由中国热带农业　科学院热带作物品种资源研究所快繁中心提供。　剑麻无菌苗所用培养基为：　预培养：ＭＳ＋６一ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋　３０　ｇ／Ｌ蔗糖＋７　ｇ／Ｌ卡拉胶，ｐＨ　５．８。　共培养：ＭＳ＋６一ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋　Ａｓ　２００￣ｍｏｌ／Ｌ＋３０　ｇ／Ｌ蔗糖＋７　ｇ／Ｌ卡拉胶。ｐＨ　５．８。　选择培养：ＭＳ＋６一ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋　Ｃａｒ　４００　ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ　２５　ｍｇ／Ｌ＋３０　ｇ／Ｌ蔗糖＋７　ｇ／Ｌ卡　拉胶，ｐＨ　５．８。　１．１．３质粒和菌株　质粒ｐＢＩ１２１及根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４均由中国　热带农业科学院热带作物品种资源研究所快繁中心　保存。　１．２　方法　１．２．１　预培养　将无菌苗的幼嫩叶片切成０．５　ｃｍ。左右的小块．　放到预培养培养基上．２５￣Ｃ暗培养２　ｄ。　１．２．２潮霉素（Ｈｙｇ）基础抗性测定　将剑麻叶片基部的叶段接种于Ｈｙｇ浓度分别　为：０、１０、１５、２０、２５　ｍｇ／Ｌ的培养基上，２１　ｄ后　统计叶片的褪绿程度。　１．２．３茵液浓度对转化的影响　将保存在－８０℃的已转化的农杆菌菌液在含有Ｋｍ　５０　ｍｇ／Ｌ和Ｒｉｆ　１００　ｍｇ／Ｌ的ＬＢ固体培养基上涂板．　２８＂Ｃ倒置培养约４８　ｈ。挑取单菌落接种到含Ｋｍ５０　ｍｇ／Ｌ　一３８一　计算ＧＵＳ瞬时表达率。以确定最佳农杆菌侵染浓度。　１．２．４侵染时间对转化的影响　将预培养的外植体浸泡在盛有农杆菌菌液的小　三角瓶中，分别侵染５、１０、１５、２０、２５ｍｉｎ，然后　共培养２　ｄ后转移至抗性培养基上．２１　ｄ后计算　ＧＵＳ瞬时表达率，以确定最佳侵染时间。　１．２．５　乙酰丁香酮（Ａｓ）的浓度对转化的影响　在共培养培养基中加入不同浓度的Ａｓ（０、１００、　２００、３００、４００　ｍ０ｌ／Ｌ），每个处理３０个农杆菌浸泡过　的外植体，３次重复，以确定最佳Ａｓ的浓度。　１．２．６羧苄青霉素（Ｃａｒ）浓度对诱导愈伤的影响　外植体共培养后．农杆菌会快速生长而抑制了　外植体的生长分化．甚至导致外植体死亡。为了抑　制农杆菌的生长．在培养基中需要添加适宜的抑菌　剂，保证外植体的正常生长。本试验设置５个Ｃａｒ　的浓度：０、１００、２００、３００、４００、５００　ｍｇ／Ｌ，观察　受体材料接种于不同浓度Ｃａｒ中的变化。　１．２．７　ＧＵＳ组织化学染色　将农杆菌侵染后１～４　ｄ的外植体进行ＧＵＳ组　织化学染色，鉴定ＧＵＳ基因的瞬时表达率。取转化　后经选择培养获得的剑麻外植体。置于培养板。加　入适量的ＧＵＳ染色液．盖上盖封好容器于３７℃条　件下反应１４～１８　ｈ。同时取未转化的同步材料做阴　性对照吸掉反应液后加入７０％的乙醇脱色．常温放　置至阴性对照材料呈白色．肉眼观察显色情况并拍　照记录　２结果与分析　２．１　潮霉素（Ｈｖｇ）基础抗性测定　在进行遗传转化之前．首先对材料进行抗生素　筛选，确定外植体对抗生素的敏感性．选出合适的　抗生素浓度。本试验设置了５个Ｈｙｇ浓度梯度．培　养２１　ｄ后进行观察。试验结果见表１。　随着Ｈｙｇ浓度的升高。外植体持绿率急剧下　丁　静等　剑麻遗传转化体系的建立与优化　表１　剑麻叶片的Ｈｙｇ敏感性试验结果　Ｈｙｇ浓度／（ｍｇ・Ｌ　）　持绿率／％　０　９４．８　１０　７Ｏ．３　１５　４１．２　２Ｏ　２８．７　２５　０　降，变　为深褐色或者黑色。当Ｈｙｇ浓度为２５ｍｇ／Ｌ　时．剑麻叶片的持绿率已经降到０（图１Ａ）；当Ｈｙｇ　浓度为１５　ｍｇ／Ｌ时．剑麻叶片的持绿率为４１．２％（图　１Ｂ），约为对照（ｐ＝　＝ｏｍｇ／Ｌ）的一半，即剑麻叶片出　现了半致死现象　在后续实验中采用Ｈｙｇ浓度为　２５　ｍｇ／Ｌ作为外植体选择压力。　＼斟　鲁嚣∽　０　∞　∞　∞　∞　图１Ａ全致死　图１Ｂ半致死　２．２菌液浓度对转化的影响　在农杆菌介导的遗传转化中．合适的菌液浓度　是成功转化的一个关键性的影响因子。试验结果见　图２。　３　２。＿３　０　菌液浓度（ＤＤ　）　图２　菌液浓度对ＧＵＳ瞬时表达率的影响　ＯＤ６ｏｏ值在０．２～０．６时．随着菌液浓度的升　高，ＧＵＳ瞬时表达率也随即升高　当ＤＤ　值达到　Ｏ．６左右时．ＧＵＳ瞬时表达率达到最高：但是当　（）Ｄ㈣值大于０．６时．ＧＵＳ瞬时表达率呈下降趋　势。当（）Ｄ　值大于０．６时，南于菌液浓度太大，　农杆菌过度繁殖导致外植体污染严重．使外植体褐　化甚至死亡．降低ＧＵＳ瞬时表达率　２．３侵染时间对转化的影响　侵染的过程就是农杆菌向外植体表面附着的过　程．掌握好侵染时间．有助于减少后续试验中可能　造成的污染。侵染的时间太短，农杆菌尚未接触到　伤口表面：侵染时间太长，农杆菌会在伤口处大量　繁殖，使外植体软腐，变褐死亡。见图３。　浸染时间／ｍｉｎ　图３侵染时间对ＧＵＳ瞬时表达率的影响　侵染时间在１５ｍｉｎ时，ＧＵＳ瞬时表达率最高．　但是侵染超过１５　ｍｉｎ时．ＧＵＳ瞬时表达率开始降　低。因此在后续试验中，为了减少剑麻叶片受到的　伤害．侵染时间应该控制在ｌ０～１５　ｍｉｎ。　２．４　乙酰丁香酮的浓度对转化的影响　剑麻属于单子叶植物．对农杆菌不敏感。研究　发现．双子叶植物受到创伤后会产生酚类物质乙酰　丁香酮（Ａｓ）。Ａｓ可以诱导农杆菌Ｖｉｒ基因的活化．　而Ｖｉｒ区基因的活化与Ｔ—ＤＮＡ区的转移有着直接的　关系。Ａｓ的加入，大大促进了农杆菌向植物细胞　的附着和转移，从而促进外源基因的整合。从图４　可以看出．在共培养培养基中加入一定量的Ａｓ．　可以明显的提高ＧＵＳ瞬时表达率　当Ａｓ浓度增加　至２００￣ｍｏｌ／Ｌ时，ＧＵＳ瞬时表达率达到最高；但是　当Ａｓ浓度继续增加时，ＧＵＳ瞬时表达率反而降低。　所以．在后续试验中往共培养培养基中加入２００　￣ｍｏｌ／Ｌ的Ａｓ。　３０　１５　。害５　圈．　ｒ］　。．０　１００　２００　３００　４００　Ａｓ浓度　图４　Ａｓ浓度对ＧＵＳ瞬时表达率的影响　一３９一　０　２０１１年６月　２．５羧苄青霉素浓度对诱导愈伤的影响　热带农业科学　第３１卷第６期　在后期的抑菌过程中．虽然羧苄青霉素的浓度　越高．抑菌效果越好．但是会严重影响到剑麻愈伤　组织的诱导。所以采用４００　ｍｇ／Ｌ的羧苄青霉素。在　经侵染共培养后的外植体上附着大量的农杆　菌．如果不及时抑制菌的生长与繁殖．外植体将会　由于菌的污染而导致褐化甚至死亡。试验表明，０、　１００、２００、３００、４００ｍｇ／Ｌ的羧苄青霉素几乎不影响　培养的后期如果发现农杆菌污染．及时用羧苄青霉　素水清洗外植体．这样既保证了外植体愈伤组织的　正常诱导．又避免了农杆菌污染对外植体的影响。　剑麻叶片愈伤组织的诱导　使用５００　ｍｇ／Ｌ的羧苄　青霉素时，剑麻的叶片很难长出愈伤组织。为了能　抑制住菌的污染并且保证转化体细胞的正常分化．　在后续试验中往选择培养培养基中加入４００　ｍｇ／Ｌ　的羧苄青霉素　２．６　ＧＵＳ组织化学染色　表达载体ｐＢＩ１２１中含有３５Ｓ：ＧＵＳ报告基因．　可以对转化后的外植体进行ＧＵＳ组织化学染色检　测。随机抽取几个转化后的剑麻叶片（图５Ａ），进　行ＧＵＳ染色鉴定：同时取几个未转化的叶片作对照　（图５Ｂ）　ＧＵＳ基因的组织化学染色结果发现，剑麻　叶片出现不同程度的蓝斑．说明ＧＵＳ基因已转入剑　麻叶片中　图５Ａ　ＧＵＳ染色　图５Ｂ对照ＣＫ　３讨论　遗传转化细胞的再生要求受体材料有高效稳定　的再生能力［１０】。在本实验中．剑麻叶片愈伤组织的　诱导过程中经常碰到玻璃化现象．愈伤组织变得水　渍化．软腐失去分化能力，在培养过程中应采取一　些措施尽量降低培养皿内的湿度Ⅲ　．比如稍微增　加卡拉胶的浓度．液体培养基凝固后封口以及采用　透气性好的材料等ｆｌ３］。　在对外植体侵染的过程中。本实验只使用了一　种菌种ＬＢＡ４４０４．不同的菌种对植物材料的侵染能　力不同．在以后的研究中可以采用其他菌种进行实　验比较．选出最佳的农杆菌菌种。　一４０　一　参考文献　［１］裴超群．龙舌兰科植物资源调查报告［Ｊ］．广西热作科　技，１９９７（１）：ｌ５—２１．　［２］Ｔｅｍｐａｎｙ　Ｓ　Ｈ，Ｇｒｉｓｔ　Ｄ　Ｈ．Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｌｏｎｇｍａｎｓ，Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａ－　ｎｙ，１９５８．５０．　［３］林伯达．加速选育龙舌兰麻新良种［Ｊ］．福建热作科技。　１９９０（１）：ｌＯ一１７．　，　［４］西海．石棉纤维的替代产品——剑麻纤维［Ｊ］．建材　工业信息．２００３（１１）：４４．　［５］周文钊．罗练芳．提高剑麻科技创新能力的战略思路　［Ｊ］．中国麻业科学，２００７．２９（增１）：１０４一ｌｌ１．　［６］郭彬，全霞，张黎明，等．剑麻对镉耐受、积累及　修复效应的初步研究［Ｍ］．全国土壤污染控制修复与盐　土改良技术交流论文集．２００６：１８６—１８９．　［７］李福燕，张黎明，李许明，等．剑麻对铜的耐性与累积　效应研究初探咖．中国农学通报，２００６，１２（２２）：４１７—４２０．　［８］吕玲玲，易克贤，徐雪荣．Ｈ．１１６４８麻高效再生体系的　建立［Ｊ］．中国麻业，２００６，２８（２）：７９—８３．　［９］王关林．方宏筠．植物基因工程原理与技术［Ｍ］．北京：　科学出版社．１９９８．４７７—４８０．　［１Ｏ］曾黎辉．吕柳新．木本果树遗传转化研究进展［Ｊ］．果　树学报．２００２．１９（３）：１９１—１９８．　［１１］Ｂｏｔｔｃｈｅｒ　Ｉ，Ｚｏｇｌａｕｅｒ　Ｋ，Ｇｏｒｉｎｇ　Ｈ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｐｌａｎｔ．１９８８（７２）：５６０—５６４　［１２］Ｚｉｖ　Ｍ，Ｍｅｉｒ　Ｇ，Ｈａｒｌｅｖｙ　Ａ．Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｕｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｒｄｅｎｅｄ　ｇｌａｕｃｏｕｓ　Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｏｒ—　ｇａｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ．１９８２，２（１）：５５—６５　［１３］Ｅａｒｌｅ　Ｅ　Ｄ，Ｌｕｎｇｂａｕｓ　Ｒ　Ｗ．Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｈｏｏｔ　１ｉｐｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　１ｉｑｕｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．　Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．．１９７５．１０：６０８—６１０