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课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名：
一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 装
订
线
酶的基本性质实验
A、底物专一性
一、实验目的和要求：
1. 了解酶的专一性；
2. 掌握验证酶的专一性的基本原理及方法； 3. 学会排除干扰因素，设计酶学实验。
二、实验内容和原理：
酶催化作用的一个重要特点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化反应。
↗相对专一性 酶的专一性 →绝对专一性
↘立体异构专一性
本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反应的催化作用来观察酶的专一性。采用Benedict试剂检测反应产物。
Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖 的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成砖红色氧化亚铜沉淀。 Na2CO3+ 2H2O → 2NaOH + H2CO3 CuSO4+ 2NaOH → Cu(OH)2+ Na2SO4
还原糖(—CHO or —C=O)+ 2Cu(OH)2 → Cu2O↓ + 2H2O + 糖的氧化产物 ↓ ↓ ↓ 醛基 酮基 砖红色或红色
在分子结构上，淀粉几乎没有，而蔗糖全无半缩醛基，它们均无还原性，因此它们与Benedict试剂无呈色反应。
淀粉被淀粉酶水解，产物为葡萄糖；蔗糖被蔗糖酶水解，其产物为果糖和葡萄糖，它们都为具有自由半缩醛羟基的还原糖，与Benedict试剂共热，即产生红棕色Cu2O沉淀。
本实验以此颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作用。
三、实验材料与试剂：
1、实验材料
⑴ 蔗糖酶液(样品Ⅳ1：10稀释）; ⑵ 新鲜唾液（含唾液淀粉酶）。
2、实验试剂
⑴ 蔗糖酶液(样品Ⅳ1：10稀释）； ⑵ 唾液淀粉酶液（唾液1：200稀释） ⑶ 5%蔗糖（A.R.）溶液；
⑷ 0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）； ⑸ Benedict试剂。
四、实验器材与仪器：
1.漏斗；
2.脱脂棉花；
3.恒温水浴（37℃，100℃）； 4.量筒；
5.试管及试管架； 6.烧杯； 7.吸量管。
五、操作方法和实验步骤：
㈠ 检查试剂
往1，2，3试管中分别取三支试管，加入蒸馏水、5%蔗糖溶 编号 1 ， 2 ， 3 液 、 0.5% 淀 粉
（0.3%NaCl）溶液3ml
将三支试管摇 匀， 置于沸水浴 记录观察结果
中煮沸2~3min 往三支试管中各加入 Benedict 试剂 2ml （二）淀粉专一性
取三支试管， 1 ， 2 ， 3 编号
摇匀，置于37℃水浴中
保温10min
（三）蔗糖酶的专一性
取三支试管， 编号 1，2，3
摇匀，置于37℃水浴中
保温10min
记录观察结果 记录观察结果 往1，2，3试管中分别加入蒸馏水、5%蔗糖溶淀粉 液 、 0.5%
（0.3%NaCl）溶液3ml 往三支试管中各加 入 Benedict 试剂 2ml
往1，2，3试管中各加入唾液淀粉酶液1ml 将三支试管摇匀，置于沸水浴 中煮沸2~3min 往1，2，3试管中分别加入蒸馏水、5%蔗糖溶 液 、 0.5% 淀 粉
（0.3%NaCl）溶液3ml 往三支试管中各加 入 Benedict 试剂 2ml
往1，2，3试管中各 加入蔗糖酶液1ml 将三支试管摇匀，置于沸水浴 中煮沸2~3min 六、实验结果与分析：
（一）检查试剂： 试剂处理 试管编号 0.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液（ml） 5%蔗糖溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） Benedict试剂 （ml） 记录观察结果
1 3 2 2 3 2 3 3 2 摇匀，沸水浴2~3分钟 （二）淀粉酶专一性：
试剂处理 试管编号 0.5%淀粉溶液 （ml） 5%蔗糖溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） 唾液淀粉酶溶液 （ml） 1 3 1 2 3 1 3 3 1 2 摇匀，37℃水浴10分钟 2 2 Benedict试剂 （ml） 摇匀，沸水浴2~3分钟 记录观察结果
（三）蔗糖酶专一性： 试剂处理 试管编号 0.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液 （ml） 5%蔗糖溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） 蔗糖酶溶液 （ml） 1 3 1 2 3 1 3 3 1 2 摇匀，37℃水浴10分钟 2 2 Benedict试剂 （ml） 记录观察结果
摇匀，沸水浴2~3分钟 七、讨论、心得：
1、设计第一组实验的目的是为了检测是否存在干扰因素；第二组实验是为了验证淀粉酶的底物专一
性；第三组实验是为了验证蔗糖酶的底物专一性。 2、三组实验中的蒸馏水都是作为对照用的。
3、淀粉溶液中0.3%NaCl的作用是为了保证淀粉酶的活性，同时氯离子作为激活剂，可以增加酶的活性，使反应现象更加明显。
4、试管要洁净，所有试剂加量要准确，加好试剂后要摇匀。使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染；试剂用好瓶盖要立即盖好，防止试剂间的互相污染。以免实验结果的错误。
B、影响酶活性的因素——激活剂、抑制剂
一、实验目的和要求：
1. 了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响；
2. 学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反应速度的原理和方法。
二、实验内容和原理：
激活剂：能使酶的活性增加的物质。
抑制剂：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的 一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低的 物质。
本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与碘作用的颜色反应如下：
淀粉→→→紫色糊精→→→红色糊精→→→无色糊精→→→麦芽糖→→→葡萄糖 加 碘 液
显蓝色 显紫色 显红色 不显色 不显色 不显色
↓ ↓
还原性 还原性
本实验中，氯离子为唾液淀粉酶的激活剂；铜离子为唾液淀粉酶的抑制剂。
利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同的呈色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活和抑制现象。
淀粉 + 碘 → 蓝色
淀粉 + 淀粉酶 Cl-或Cu2+ 水解产物 + 碘液 → 颜色变化 水解的程度是通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色之变化来判断的。
加 碘 液 加 碘 液 加 碘 液 加 碘 液 加 碘 液
三、实验材料与试剂：
1、实验材料
新鲜唾液（1：200稀释）
2、实验试剂
⑴ 唾液淀粉酶（自制）
⑵ 0.1% 淀粉溶液 ⑶ 1.0% 氯化钠溶液 ⑷ 1.0% 硫酸铜溶液 ⑸ 1.0% 硫酸钠溶液 ⑹ 碘化钾-碘液
四、实验器材与仪器：
1.试管及试管架 2.量筒 3.漏斗 4.脱脂棉花 5.点滴板 6.吸量管
7.恒温水浴（37℃）
五、操作方法和实验步骤：
往八支试管中分别 混匀，分别置于 37℃取八支试管，加入3ml 0.1%淀粉 水浴中保温1，2，3，编号1，2，3，溶液、1ml 蒸馏水和 4，5，6，7，8分钟 4，5，6，7，8 1ml 淀粉酶溶液
分别滴加
记录观察结果 1滴碘液
1号试管呈紫红色，2，3，4，5，6，7，8号试管均呈棕黄色，最终确定最佳反应时间为1 min。 往1，2，3，4号试管中分 取四支试管，编别加入1ml硫酸铜溶液、分别加入3ml 1，2，3，4 号1ml氯化钠溶液、1ml硫酸0.1%淀粉溶液 钠溶液、1ml蒸馏水
试剂处理 试管编号 0.1%淀粉溶液 （ml） 1%CuSO4溶液 （ml） 分别加入1ml唾液淀粉酶液 将各管混匀后，置于37℃水浴中保温1分钟 记录观察结果 六、实验结果与分析： 1 3 1 2 3 3 3 4 3 1%NaCl溶液 （ml） 1%Na2SO4溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） 唾液淀粉酶溶液 （ml） KI-I2溶液 （滴） 记录观察结果
1 1 1 1 1 1 1 1 1 混匀，37℃水浴1分钟 1 1 七、讨论、心得：
1、本实验中，试管1是为了验证抑制剂对酶促反应速率的影响；试管2是为了验证激活剂对酶促反应
速率的影响；试管3是为了排除氯离子和硫酸根离子的干扰；试管4是作为对照的。
2、抑制剂和变性剂是不同的。抑制剂不引起酶蛋白变性，仅仅是降低其活性，除去后酶的活性恢复；而变性剂则会破环酶蛋白原有活性，使酶失去活性，是不可逆的。
3、试管要洁净，所有试剂加量要准确，加好试剂后要摇匀。使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染；试剂用好瓶盖要立即盖好，防止试剂间的互相污染。以免实验结果的错误。
C、影响酶活性的因素——温度 最适温度测定
一、实验目的和要求：
1. 了解温度对酶活力的影响；
2. 学习测定最适温度的原理和方法。
二、实验内容和原理：
酶的催化反应受温度影响很大，每一种酶所催化的反应，在一定条件下，仅在某一温度范围内表现出最大的活力，即反应速度最大时的温度，这个温度称为该酶促反应的最适温度，高于或低于最适温度时，反应速度逐渐下降。因此，酶促反应与温度的关系，用酶活力对温度作图，通常具有钟罩形曲线特征。
实验①：利用唾液淀粉酶为试验对象，在0℃～65℃之间选择不同的温度，进行酶活力测定。根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温度。
实验②：采用蔗糖酶为试验对象，在室温至75℃之间选择不同温度进行酶活力测定。蔗糖酶的活力常以其反应产物还原糖（葡萄糖）的生成量来表示。本实验选择3,5–二硝基水扬酸法测定还原糖量。在碱性条件下，3,5–二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成红色氨基化合物，并在一定浓度范围内，还原糖的量与反应溶液所呈棕红色物质颜色的深浅程度成正比。因此，可以用分光光度法测定酶促反应后生成的还原糖量，从而测定蔗糖水解的速度和酶活力。
三、实验材料与试剂：
1、实验材料
⑴ 蔗糖酶液(样品Ⅳ1：10稀释）； ⑵ 新鲜唾液（1：200稀释）。
2、实验试剂
⑴ 0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6） ⑵ 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）
⑶ 3,5—二硝基水扬酸（简称DNS）试剂 ⑷ 0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl） ⑸ IK-I2溶液
四、实验器材与仪器：
1. 试管及试管架；
2．恒温水浴(37℃、50℃、65℃、75℃、100℃） ； 3．吸量管； 4．滴管； 5．点滴板； 6．分光光度计； 7．制冰机。
五、操作方法和实验步骤：
一、温度对唾液淀粉酶活力的影响 1．观察温度对酶活动的影响：
将1，2，3，4，5号试
取五支试分别滴加2ml 0.5%淀管分别置于冰中、室温、
管，编号1，粉（0.3%NaCl）溶液 37℃水浴、50℃水浴、
2，3，4，5 65℃水浴中预温5min
分别加入经分别滴加混匀，分别置于各相 过预温的淀1ml碘液 应温度，保温1min 粉酶液1ml 记录观察结果
2、绘制温度-酶活力曲线图，以反应温度为横坐标，反应液颜色的深浅程度（代表酶活力的大小）为纵坐标。绘制温度——酶活力曲线（钟罩形），确定唾液淀粉酶的最适温度。 二、温度对蔗糖酶活力的影响 1、蔗糖酶最适温度的测定
蔗糖酶液（样品IV）稀释10倍，备用。
取六支试管，编号0，1，2，3，4，5 分别加入1ml 0.2mol/L醋酸缓冲液、0.5ml 5%蔗糖溶液 0、1号试管置于室温中，2、3、4、5号试管分别置于37℃、50℃、65℃、75℃水浴中保温3min 0号试管中加入0.5 ml蒸馏水，1~5号管分别加入0.5ml蔗糖酶液。水和蔗糖酶液均经过预温 分别置于相应温度环境中保温10 min 分别加入1ml DNS 混匀，置于沸水浴中5min 分别加入5 ml蒸馏水 测定在520nm下的光吸收值 2、绘制温度——酶的活力曲线图
七、实验结果与分析：
一、温度对唾液淀粉酶活力的影响：
1．观察温度对酶活动的影响： 试剂处理 试管编号 0.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液 （ml） 温度 （℃） 1 2 0 2 2 室温 3 2 37 4 2 50 1 5 2 65 1 1 摇匀，预热5分钟 1 1 1 唾液淀粉酶溶液（预温） （ml） 混匀，置于相应温度中保温1分钟 1 1 1 1 I2-IK溶液 （滴） 记录观察结果
2.温度-酶活力曲线图：
二、温度对蔗糖酶活力的影响：
1、蔗糖酶最适温度的测定：
试剂条件 试管编号 反应温度 （℃） 0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液（ml） 5%蔗糖溶液 （ml） 0 室温 1 0.5 1 室温 1 0.5 2 37 1 0.5 3 50 1 0.5 0.5 1 4 65 1 0.5 0.5 1 5 5 75 1 0.5 0.5 1 5 混匀，预热3分钟 0.5 0.5 蔗糖酶溶液（预温） （ml） H2O 0.5 混匀，保温10分钟 1 1 1 DNS （ml） 混匀，沸水浴2~3分钟 5 5 5 5 蒸馏水 （ml） 记录观察结果
2、绘制温度——酶的活力曲线图：
八、讨论、心得：
1、在把底物与酶混合前要先分别对两者进行预温，使得酶促反应一开始时两者就处在同一温度环境中；
2、在温度对蔗糖酶活力影响实验中，在75℃环境中的反应液光吸收值比在65℃环境中要高，这可能是测定时没有充分摇匀的缘故，也有可能是温度过高，蔗糖酶几乎完全变性沉淀下来有关；
3、试管要洁净，所有试剂加量要准确，加好试剂后要摇匀。使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染；试剂用好瓶盖要立即盖好，防止试剂间的互相污染。以免实验结果的错误。
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