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颁发部门： 质管部 生效日期： 年 月 日
分发清单：
质管部、行政部、质管部QC、研发中心
制定/审批 部 门： 姓 名： 签 名： 日 期： 制定人 质管部QC 审核人 质管部QC 主任 胡敏 审核人 质管部QA 刘瑜瑜 审核人 质管部部长 魏安那 批准人 质量受权人 魏安那 目 的 ........................................................................................................................ 2 适用范围 .................................................................................................................. 2 职责 ......................................................................................................................... 2 定义 ......................................................................................................................... 2 正文 ......................................................................................................................... 2 相关文件 .................................................................................................................. 6 记录与附录 ............................................................................................................... 6 变更记载 .................................................................................................................. 6
刘美榛 微生物检验方法学验证管理规程 质量控制——微生物实验室 文件编号： 版 本 号： 页 码： 受控号 QC7004 V01 2 / 6 1 目 的
建立微生物检验方法验证管理规程，规范微生物检查方法的验证。以确认加入供试品中的微生物都能生长，即该种方法用于检测时，方法适用且结果是可信的。
2 适用范围
本程序适用于本公司质管部的微生物检验方法的验证。
3 职责
3.1 质量管理部：负责本规程的起草、修订、培训、执行及监督。
3.2 相关部门负责人：负责审核本规程，验证委员会主任及副主任负责批准本规程。 3.3 验证相关部门人员应充分理解本规程，并按此执行。
4 定义
无
5 正文
5.1微生物限度检查和控制菌检查简述：
为了确保微生物检查方法的可靠性，需对微生物计数方法和控制菌检查方法进行验证。如果供试品没有抑菌作用，可采用平皿法或直接薄膜过滤法；如果供试品具有抑菌活性，可采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法，或多种方法组合，以消除供试品的抑菌活性。若供试品组分或原检验条件发生改变，可能影响检验结果时，应对该供试品进行重新验证。 5.2 供试液的制备：
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液；若需用水浴加温时，温度应不超过45℃；供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 5.2.1 固体、半固体或黏稠性供试品：
取供试品10g，加pH7.0氯化钠- 蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:10 的供试液；另取1:10的供试液10ml，加pH7.0氯化钠- 蛋白胨缓
微生物检验方法学验证管理规程 质量控制——微生物实验室 文件编号： 版 本 号： 页 码： 受控号 QC7004 V01 3 / 6 冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:100的供试液。必要时可加入温度≤45℃适量的无菌吐温80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 5.2.2 液体供试品：
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10 的供试液。油剂可加入含0.05%吐温80的pH7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混匀的供试品原液作为供试液。 5.2.3 具有抗菌活性的供试品：
当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性。可单独或联合应用以下方法：
5.2.3.1 培养基稀释法：增大稀释液或培养基的体积。例如：取一定量的供试品，至较大
量的培养基或稀释液中，通过降低培养基/稀释液中单位体积内的供试品含量来消除供试品的抑菌性。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，可取同稀释级的供试液1ml等量注入多个平皿中；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
5.2.3.2 离心沉淀法；取一定量的供试液，500转/分离心3 分钟，取全部上清液混合。用
于细菌检查。
5.2.3.3 薄膜过滤法：使用孔径不得大于0.45um的薄膜进行过滤。取一定量的供试品加
至适量的稀释液中，混匀，过滤。用pH7.0氯化钠- 蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不大于100ml，总冲洗量应≤1000ml。 5.2.3.4 中和法：将中和剂加在所用的稀释液或培养基中。
若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌种没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物检验标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在一种或多种试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。 5.2.4 验证试验用菌：
试验用菌应具有广泛代表性，应包括G- 菌、G+菌、酵母菌和霉菌类微生物。在控制菌检查方法验证时，采用与被检微生物相同的标准菌株作为试验菌。
微生物检验方法学验证管理规程 质量控制——微生物实验室 文件编号： 版 本 号： 页 码： 受控号 QC7004 V01 4 / 6 5.2.4.1 试验用菌：
验证菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌的生物学特性。并对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 5.2.4.2 验证用菌悬液的制备：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌菌液制备：接
种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。取此培养液用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。按平皿倾注法进行菌落计数。 生孢梭菌菌液制备：接种生孢梭菌的新鲜培养物至10ml硫乙醇酸盐流体培养基中，
30～35℃培养18～24小时。取此培养液1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。按平皿倾注法进行菌落计数。
白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，
23～28℃培养24～48小时；取此培养液用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。按平皿倾注法进行菌落计数。
黑曲霉菌菌液制备：接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～
28℃培养5～7天，加入3～5ml 含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱（用管口带有薄的无菌棉花的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。按平皿倾注法进行菌落计数。 5. 3 计数方法的验证
至少应进行3次独立的试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 5.3.1验证方法
包括试验组、菌液组、供试品对照组及稀释剂对照组(若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组)。 5.3.2 计数方法验证用菌悬液的含菌数为50～100cfu/ml。 5.3.2.1 回收率计算
试验组的菌数回收率（%）=
试验组的平均菌落数供试品的平均菌落数100%
菌液组的平均菌落数稀释剂对照组的平均菌落数100%
菌液组的平均菌落数稀释剂对照组的菌数回收率（%）=
微生物检验方法学验证管理规程 质量控制——微生物实验室 文件编号： 版 本 号： 页 码： 受控号 QC7004 V01 5 / 6 5.3.3 结果判定
菌数回收率均应不低于70%。
若验证均符合上述标准，按此供试液制备和检查方法进行检查；
若试验组任何一组菌数的回收率低于70%，应采用5.2.3的任何一种方法或联合使用这些方法以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.4 控制菌检查方法验证 5.4.1 验证方法：
取规定量供试液或供试品及10～100cfu试验菌至相应的培养基中，按相应控制菌检查方法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。 5.4.2 结果判定：
若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 5.7 再验证：
在下列情况下需要考虑对微生物检验方法进行再验证（再验证的程度根据改变情况来决定）
5.7.1 微生物检验方法发生变更
5.7.2 对微生物检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统误差 5.8 微生物检验方法验证步骤
5.8.1 验证方案由验证小组组长负责组织起草工作。 5.8.2 验证的实施
5.8.2.1 经会审后的验证方案由相关审核人员及批准人员签字后即可开始实施。详细参见
《验证组织和实施管理规程》
5.8.2.2 验证小组的成员，按方案内容逐步进行确认，完成相关记录。 5.8.2.3 QA人员监控验证实施的过程。 5.8.3 记录及数据的要求 5.8.3.1 填写验证记录整个过程
5.8.3.2 数据要求真实完整，按要求进行更改。
微生物检验方法学验证管理规程 质量控制——微生物实验室 文件编号： 版 本 号： 页 码： 受控号 QC7004 V01 6 / 6 5.8.3.3 记录应按日期填写检验人/日期和复核人/日期。 5.8.4 验证报告：
验证结束后，验证小组统计分析验证结果，完成验证报告，并报验证委员会审核。 5.8.5 每一份方案执行完毕，验证小组要及时整理记录数据并完成验证报告，验证实施过
程中发现的偏差必须体现在报告中，并经相关验证委员会成员审核批准。详细参见《偏差处理管理规程》 5.9 文件归档：
验证报告审核批准后，由验证小组组长将验证方案和验证报告等交于文件档案管理员归档。
6 相关文件
QA1003 QA6002 偏差处理管理规程 验证组织和实施管理规程 7 记录与附录
QC7004R01 QC7004R02 QC7004R03 QC7004R04 微生物限度检验方法学验证记录（平皿法） 微生物限度检验方法学验证记录（薄膜过滤法） 微生物限度检验方法学验证记录（控制菌检验方法验证Ⅰ） 微生物限度检验方法学验证记录（控制菌检验方法验证Ⅱ） 8 变更记载
版本号 V01
生效日期 变更原因、依据及详细变更内容 新制订程序。
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