浓香型白酒酒醅古菌群落结构及其变化规律研究

食品与发酵科技　而０ｄ　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　第４９卷（第６期）Ｖｏ１．４９，Ｎｏ．６　浓香型白酒酒醅古菌群落结构及其变化规律研究　冯治平，赵斌，黄治国　，邓杰，刘燕梅，祝云飞，王艳丽　（四川理工学院，酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡６４３０００）　摘要：该试验采用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术研究了浓香型白酒酒醅发酵过程中古茵群落的变化规律，结果发现：所有酒醅　样品均出现５～ｌＯ条较清晰的条带，其中第２、４、９号条带在所有样品中均有检出，且优势度较高；所有样品古茵群　落生物多样性指数都在１．５３～２．０１之间，在发酵过程中波动较小；酒醅古茵ＳＳＣＰ图谱相似性指数较高，表明古茵　群落在发酵过程中的变化较小　关键词：白酒酒醅；古茵：ＰＣＲ—ＳＳＣＰ；１６Ｓ　ｒＤＮＡ　中图分类号：ＴＳ２６２．３　１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４—５０６Ｘ（２０１３）０６—００６８—０００５　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ａｒｃｈａｅａ　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｇｉｎｇ　Ｌａｗｓ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　Ｇｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｌｕｚｈｏｕ－ｆｌａｖｏｒ　Ｌｉｑｕｏｒ　ＦＥＮＧ　Ｚｈｉ－ｐｉｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｂｉｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｚｈｉ－ｇｕｏ　，ＤＥＮＧ　Ｊｉｅ，ＬＩＵ　Ｙａｎ—ｍｅｉ，　ＺＨＵ　Ｙｕｎ—ｆｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ—ｌｉ　（Ｌｉｑｕｏｒ—ｍａｋｉｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｕｏｌｏｇｙ＆Ａｐｐｌｗ￣ｉｏｎ　ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ。Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ　Ｓｉｃｈｕａｎ　６４３０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｌａｗｓ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｇｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｌｕｚｈｏｕ－ｆｉａｖｏｒ　ｌｉｑｕｏｒ　ｂｙ　ＰＣＲ－ＳＳＣＰ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｃｌｅａｒ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　５　ｔｏ　１０　ｗｅｒｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｃｌｅａｒｌｙ　ｉｎ　ａｌｌ　ｇｒａｉｎｓ　ｓａｍｐｌｅｓ，ＮＯ．２、４、９　ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｙ　ｈａｄ　ａ　ｈｉｇｈ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｄｅｇｒｅｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ａｌｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｋｅｐｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１．５３　ａｎｄ　２．０１．ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｇｅｎｅｒｌｌａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｍａｌｌ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｉｎｄｅｘｓ　ｏｆ　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈ，ｗｈｉｃｈ　ｍｅａｎｓ　ａｒｃｈａｅａ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｈａｄ　ｓｍａｌｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｑｕｏｒ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｇｒａｉｎｓ；ａｒｃｈａｅａ；ＰＣＲ－ＳＳＣＰ；１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１６７４—５０６Ｘ．２０１３．Ｏ６—０１４　浓香型白酒的生产过程与微生物菌群的演化　交替密不可分，窖池微生物经过长期的驯化和发　多年来科学家们一直认为地球上的生命由原核　生物和真核生物两大类组成。１９７７年，Ｗｏｅｓｅ等［２　３在　研究了６０多种不同细菌的１６Ｓ　ｒＲＮＡ序列后，发现　了一群序列奇异的细菌一甲烷细菌，他们认为这是地　展，慢慢形成了独特的微生物群落，酒醅微生物与　窖池微生态环境相互作用并在窖池中进行复杂的　物质能量代谢，积累了丰富多样的代谢产物．这些　代谢产物是浓香型白酒酒体风味与口感形成的重　要物质基础［”。　球上的第三生命形式。命名为古细菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）。　古菌是一群具有独特的基因结构或系统发育生物大　分子序列的单细胞生物，多生活在地球上极端的生　收稿日期：２０１３—１２—２５　基金项目：四川省科技厅应用基础项目（０７ＪＹＯ２９—０２６）；四川理工学院引进人才项目（２００７—１８）。　作者简介：冯治平（１９６６～），男，硕士，教授。主要从事食品加工技术及食品分析研究。　通讯作者：黄治国（１９７８一），男，博士，副教授。主要从事发酵工程方面的研究。　第４９卷（总第１７８期）　冯治平等：浓香型白酒酒醅古菌群落结构及其变化规律研究　境或生命出现初期的自然环境中，自营自养和异养　生活，具有特殊的生理功能，如在超高温、高酸碱度、　高盐及无氧状态，具有独特的细胞结构，如细胞壁骨　架假肽聚糖，细胞膜含甘油醚键，以及代谢中的酶作　用方式既不同于细菌又不同于真核生物［　。　随着分子生物学技术的发展．基因指纹图谱技　术越来越多的应用于白酒酿造微生物群落结构研　究　］。有学者已经鉴定出酒醅中所含的优势细菌和　真菌类群［６－７］，也有学者证实过窖泥中含有古菌［８］。　本试验率先采用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术．研究发酵过程中　酒醅古菌群落结构及其变化规律。为浓香型白酒发　酵机理研究提供理论基础。　１试验材料与方法　１．１试验材料　１．１．１　样品　酒醅样品采自四川旭水酒业有限公司生产窖池　边上位置（距窖壁０．２ｍ，距窖顶０．５ｍ），每７ｄ采一次　样，迅速置于冰盒运回实验室，一２０℃保藏。　１．１．２主要试剂　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（大连宝生物工程有限公司）：　去离子甲酰胺（德国ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）。　１．１．３主要仪器　ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ—ＲＡＤ公司Ｍｙ　ｃｙｃｌｅ）；ＤＧＧＥ　电泳仪（美国ＢＩＯＲＡＤ公司Ｄｃｏｄｅ）；高速冷冻离心　机（德国Ｈｅｔｔｉｃｈ公司ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ　３２Ｒ）；凝胶成像　系统（美国ＳＩＭ公司Ｂｉｏ—Ｂｅｓｔ２００Ｅ）。　１．２　引物设计　采用１６Ｓ　ｒＤＮＡ基因引物序列选用Ａｒｃ３４４ｆ（５一　ＡＣＧＧＧＧＹＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＧＡ一３）和Ａｒｃ５　１９ｒ（５一　，ｒｒＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ一３）来扩增酒醅ＤＮＡ。目的片　段为１５０ｂｐ　ｃ　，引物由上海英俊生物技术公司合成。　１．３　酒醅微生物总ＤＮＡ提取及纯化　用ＳＤＳ一酚氯仿抽提法Ｅｌ０］提取酒醅微生物基因　组ＤＮＡ，然后用核酸蛋白仪检测ＤＮＡ的浓度和纯　度，保存于一２０℃备用。　１．４　ＰＣＲ扩增　ＰＣＲ反应体系为５０ｔｒＬ：１．ＯＩ￣Ｌ　Ｔａｑ酶（５Ｕ／￣Ｌ），　５．０ｔｘＬ　１０　ｘｂｕｆｆｅｒ，３．０１￣Ｌ　ＭｇＣ１２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），４．０　Ｌ　ｄＮＴＰｓ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），引物（１Ｏ￣ｍｏｌ／Ｌ）各　１　Ｌ，２ｌｘＬ模板ＤＮＡ，灭菌双蒸水补齐。ＰＣＲ扩增程　序：采用ｔｄ　ＰＣＲ：９４ｏＣ预变性５ｍｉｎ。９４℃１０ｓ，６５—　５５℃，３０ｓ（每个循环降低０．５℃），７２ｏＣ　４０ｓ，２０个循　环，保持退火温度５５℃１０个循环；然后７２℃延伸　１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用ｌ％琼脂糖凝胶检测。　１．５　酒醅古菌ＳＳＣＰ分析　在ｌＯｌＬ　ＰＣＲ产物中加入ｌＯｌＬ变性缓冲液　（９５％甲酰胺，０．０３％－甲苯青，０．０５％溴酚蓝，ＥＤＴＡ　２０ｍｍｏｌ／Ｌ），１００￣Ｃ煮沸变性１０ｒａｉｎ后，立即冰浴　１０ｍｉｎ，随即放置于一２Ｏ℃条件下放置２０ｍｉｎ：取　１４　Ｌ处理好的样品，点样于浓度为８％的非变性聚　丙烯酰胺凝胶中（交联度为２９：１，不加甘油），电泳缓　冲液为０．５ｘＴＢＥ，常温下先２００Ｖ，电泳４ｍｉｎ，然后　１８０Ｖ下恒压电泳５ｈ，银染拍照。　１．６数据分析　研究群落多样性的方法很多。本研究主要用丰　度（Ｓ）、优势度、样品间相似性指数（Ｃｓ）和ｓｈａｎｎｏｎ—　ｗｉｅｎｅｒ指数（Ｈ）来表示。通过ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｎｅ　４．６．２软　件对ＳＳＣＰ图谱进行分析：　（１）丰度（Ｓ）：用ＳＳＣＰ图谱中条带的个数来表示。　（２）优势度：用某一特定条带的峰面积占样品总　体峰面积的百分数来表示。　（３）Ｓｈａｎｎｏｎ—Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数［　］：反映群落种　类与均匀度的混合参数。　５　１　Ｈ一　ｐ，ｌｉｐ，　ｉ＝１　式中：日——Ｓｈａｎｎｏｎ—Ｗｉｅｎｅｒ多样性指标值：　ｐ广一第ｉ个物种所占的百分比，即是第ｉ种　的个体数与个体总数的比例；　ｓ——样品中含有多少种不同的物种的数量，　即该样品总ＳＳＣＰ条带数。　（４）相似性用索伦森配对相似性系数Ｓｏｒｅｎｓｏｎ　Ｐａｉｒｗｉｓｅ　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）　。　来计算　Ｃｓ＝２ｊ　／（ａ＋ｂ）　式中：　——索伦森配对相似性系数：　某一样品的ＳＳＣＰ图谱的条带数目：　６——另一样品的ＳＳＣＰ图谱的条带数目；　——两个泳道所共有条带的数目。　２试验结果与分析　２．１　酒醅古菌１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ扩增结果　本试验采用引物Ａｒｃ３４４ｆ和Ａｒｃ５１９ｒ扩增酒醅　古菌１６Ｓ　ｒＤＮＡ，得到１５０ｂｐ左右的片段（图１），符　合引物设计的片段。　２．２　酒醅古茵１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ图谱　由酒醅古菌１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ图谱（图２）　中可以看出　所有样品均出现５～１０条较清晰的条　带，说明酒醅古菌１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ产物通过ＳＳＣＰ　得到了较好的分离。　第４９卷（总第１７８期）　冯治平等：浓香型白酒酒醅古菌群落结构及其变化规律研究　７１　２．５　变化规律，结果发现：酒醅古菌多样性指数都在　２・０　１．５３—２．０１之间（图４）。随着发酵时间的增加，多样　１．５　性指数略呈先下降后上升再下降，然后保持平稳的　１．０　趋势。发酵第２１ｄ时，多样性指数达到最大值２．０１，　０．５　之后开始下降．发酵５６ｄ以后，多样性指数略有回　０　１　７　１４　２１　２８　３５　４２　４９　５６　６３　７０　７７　升，但基本保持相对平稳。　发酵时间／ｄ　２．６　酒醅古茵ＳＳＣＰ图谱相似性指数　图４酒醅古菌群落多样性指数的变化规律　本试验分析了酒醅古菌群落ＳＳＣＰ图谱的相似　Ｆｉｇ．４　Ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｌａｗｓ　ｏｆ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ａｒｃｈａｅａ　性。结果发现：发酵第６３ｄ和第７０ｄ的相似性指数最　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｇｒａｉｎｓ　高为０．８７．发酵第７ｄ和第３５ｄ相似性指数最低为　０．３３（表２）；基于相似性数据，构建ＵＰＧＭＡ聚类图，　２．５　酒醅古茵ＳＳＣＰ图谱多样性指数变化规律　结果发现：发酵第７ｄ．１４ｄ。２１ｄ聚为一大支，发酵第　本试验分析了古菌群落ＳＳＣＰ图谱多样性指数　４９ｄ，６３ｄ，７０ｄ聚为一大支（图５）。　表２不同发酵时期酒醅细菌群落相似性　Ｔａｂ．２　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　ａｒｃｈａｅａ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｇｒａｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｅｒｉｏｄ　发酵时间，ｄ　第１ｄ　第７ｄ　第１４ｄ　第２１ｄ　第２８ｄ　第３５ｄ　第４２ｄ　第４９ｄ　第５６ｄ　第６３ｄ　第７０ｄ　第７７ｄ　数。ＳＳＣＰ将无法检测ＤＮＡ在基因组中的含量少于　１．５％的种群。因此ＳＳＣＰ图谱所反映的是样品中的　优势菌群［５］。本试验所得的酒醅古菌ＳＳＣＰ图谱的丰　２　度为５—１Ｏ，优势条带在３—４条之间，其中既有所有　样品的共有条带，也有部分样品的共有条带。随着发　酵时间的增加．样品条带丰度总体上呈先下降后上　１　升再下降然后保持稳定的趋势。　０　条带的优势度反映的是该条带的量在整个样品　注：样１：发酵第１ｄ；＃２：发酵第７ｄ；井３：发酵第１４ｄ；舭：　发酵第２１ｄ　＃５：发酵第２８ｄ：＃６：发酵第３５ｄ：＃７：发酵第　中所占的比例大小＿１”。对具有代表性的优势条带的　４２ｄ；＃８：发酵第４９ｄ；＃９：发酵第５６ｄ；＃１０：发酵第６３ｄ；　＃１１：发酵第７０ｄ；＃１２：发酵第７７ｄ；　优势度分析，可在一定程度上代表酒醅古菌群落在　发酵过程中演变情况。本试验分析了酒醅古菌ＳＳＣＰ　图５酒醅古茵群落ＵＰＧＭＡ聚类图　图谱的优势度。结果发现：在所有的酒醅样品ＳＳＣＰ　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ｏｎ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｕｒｐｌｅ－ｒｅｄ　ｐｉｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｏｄ　ａｎｄ　ｓｅｅｄ　图谱中，都检出第２、４、９号３条共有条带，且相对于　其他条带而言。优势度较高，说明这３条带所代表的古　３讨论　菌类群，可能在窖池微生态系统中起重要的作用。其中　生物多样性研究中，丰度代表一定区域的物种　第２、４号条带优势度随发酵时间的变化趋势较为相　７２　食品与发酵科技　２０１３年第６期　似，且和第９号条带的优势度变化趋势相反。表明第　２、４号条带所代表的古菌类群可能存在共生关系，与　第９号条带所代表的古菌类群可能存在竞争关系。　生物多样性是生态系统稳定性的基础。较高水　平的生物多样性有利于生态系统功能的发挥Ｎ２１。本　试验研究发现：酒醅古茵ＳＳＣＰ图谱的Ｈ值为１．５３—　２．０ｌ。发酵前期，随着发酵时间的增加．多样性指数　略呈先下降后上升再下降，然后保持平稳的趋势。虽　然发酵过程中．发酵产生的乙醇以及酸类物质会在　一［３］　东秀珠．古菌一原核生物到真核生物的过渡？［Ｊ］．微生物　学通报，１９９９，３７（１１）：４２６—４３０．　［４］　罗惠波，黄治国，李浩，等．浓香型大曲原核微生物群　落的ＰＣＲ—ＳＳＣＰ解析［Ｊ］．微生物学通报，２００９，３６（９）：　１３６３—１３６７．　［５］　罗惠波，甄攀，黄治国．浓香型白酒窖池细菌群落［Ｊ］．微　生物学通报，２０１０，３７（１１）：１６２１—１６２７．　［６］乔宗伟，张文学，张丽莺，等．浓香型白酒发酵过程中酒　醅的微生物区系分析［Ｊ］．酿酒，２００５（１）：１９—２０．　［７］张文学，乔宗伟，胡承，等．浓香型白酒糟醅中真菌菌群　的多样性分析［Ｊ］．四川大学学报：工程科学版，２００６，３８　（５）：９７—１０１．　定程度上影响微生物群落多样性，但在发酵全过　程中，古菌多样性指数波动幅度较小。这可能是由于　古菌可以承受高热、高盐度、缺氧的极端环境［１３－１５］，　所以古菌多样性指数波动较小。　相似性指数主要反映各样品条带数量之间的相　似性关系，它只是一个最基本的多样性分析指数。王　娜等　利用ＤＧＧＥ技术分析扇贝养殖海区真核浮　游生物种群多样性．发现月份相近的样品中浮游生　［８］　向文良．中国浓香型白酒窖池微生物生态研究［Ｄ］．２００４．　『９］Ｔｅｓｋｅ　Ａ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ　Ｋ　Ｂ．Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｒｅｈａｅａ　ｉｎ　ｄｅｅｐ　ｍａｒｉｎｅ　ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ：ｈａｖｅ　ｗｅ　ｃａｕｇｈｔ　ｔｈｅｍ　ａｌｌ？［Ｊ］．ＩＳＭＥ　Ｊ，２００８，２（１）：３－１７．　［１０］陈美军，孔繁翔，陈非洲，等．太湖不同湖区真核微型浮　游生物基因多样性的研究［Ｊ］．环境科学，２００８，２９（３）：　７６９－７７５．　［１１］黄治国，甄攀，罗惠波．浓香型白酒窖池古菌群落研究［Ｊ］．　西南大学学报：自然科学版，２０１０，３２（１２）：９１—９６．　［１２］赵平，彭少麟，张经炜．恢复生态学一退化生态系统生物多　样性恢复的有效途径［Ｊ］．生态学杂志，２０００，１９（１）：５３－５８．　物微生物群落的相似性较好。谢冰等ｌ１　利用ＰＣＲ—　ＳＳＣＰ技术分析芦苇人工湿地底泥微生物群落的相　似性，发现季节变化和进水水质变化对微生物群落　结构有较大影响。本试验对酒醅古菌群落ＳＳＣＰ图　谱相似性进行分析，发现各样品图谱间的相似性指　数较高，这表明在发酵过程中的酒醅样品古菌群落　间的差异较小。　参考文献　［１］　赵东，乔宗伟，彭志云．浓香型白酒发酵过程中酒醅微生物　区系及其生态因子演变研究［Ｊ１＿酿酒科技，２００７（７）：３７－３９．　［２］Ｗｏｅｓｅ　Ｃ　Ｒ，Ｆｏｘ　Ｇ　Ｅ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｋｉｎｇ－ｄｏｍｓ［Ｊ］．Ｐｒｏ－　ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ，　［１３］李曙光，皮昀丹，Ｚｈａｎｇ　Ｃ　Ｌｕｎ．古菌研究及其展望［Ｊ］．　中国科学技术大学学报，２００７，３７（８）：８３０—８３５．　［１４］刘冰冰，唐蜀昆，明红，等．新疆罗布泊地区可培养嗜盐　古菌多样性及其功能酶筛选［Ｊ］．微生物学报，２０１１，５１　（９）：１２２２—１２３１．　［１５］李涛，王鹏，汪品先．南海南部陆坡表层沉积物细菌和古　菌多样性［Ｊ］．微生物学报，２００８，４８（３）：３２３—３２９．　［１６］王娜，蔡玉勇，李贽，等．应用ＤＧＧＥ技术分析扇贝养殖　海区真核浮游生物种群多样性［Ｊ］．中国海洋大学学报，　２０１０，４０（１２）：５１－５６．　［１７］谢冰，董亮．芦苇人工湿地底泥微生物群落结构的ＰＣＲ—　ＳＳＣＰ技术研究［Ｊ］．农业系统科学与综合研究，２００７，２３　（２）：２０５—２１０．　１９７７，７４（１　１）：５０８８—５０９０．　（上接第５８页）　［４］太琼志，黄萍，黄敏，等．免刷手方法在外科手消毒中的　应用［Ｊｊ．中华医院感染学杂志，２０１３，２３（１　１）：２６８７－２７０７．　ｂｉｏｆｉｌｍ．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，７３（４）：１２５６—　１２６５．　［９］　卫生部卫生法制与监督司．消毒技术规范［Ｓ］．北京：中　［５］　张磊，王艳．医院感染环节的调查分析与质控对策［Ｊ］．　中华医院感染学杂志．１９９５：１２７—１２８．　华人民共和国卫生部，２ｏｏ２：１５—４５．　［１０］邓金花，吴清平，程胜中，等．一种手消毒液杀菌效果的　试验观察［Ｊ］．中国消毒学杂志，２００７，２４（５）：４４８—４５０．　［６］蓝才燕．国内手部皮肤消毒的研究现状［Ｊ］．疾病控制杂　志，２００２，６（１）：８９—９０．　［１１］李啸波，李骥波．两种手消毒液杀菌效果观察［Ｊ］．中华　医院感染学杂志，２０１ｌ，２１（８）：１５０６—１５０７．　『１２］Ｓｅｎａ　Ｎ　Ｔ，Ｇｏｍｅｓ　Ｂ　Ｐ，Ｖｉａｎｎａ　Ｍ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ　ａｎｄ　［７］张文福．医学消毒学［Ｍ］．北京：军事医学科学出版社，　２００２：３５０—３５１．　［８］Ｋｉｍ　Ｈ，Ｒｙｕ　Ｊ　Ｈ，Ｂｅｕｃｈａｔ　Ｌ　Ｒ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｄｉｓ—　ｉｎｆｅｃｔａｎｔｓ　ｉｎ　ｋｉｌｌｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓａｋａｚａｋｉｉ　ｉｎ　ｓｕｓｐｅｎ—　ｓｉｏｎ，ｄｒｉｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｓｔａｉｎｌｅｓｓ　ｓｔｅｅｌ，ａｎｄ　ｉｎ　ａ　ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｉｏｆｉｌｍｓ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｅｎｄｏｄ　Ｊ，２００６，３９（１１）：８７８—８８５．