实验一 培养基的配制及灭菌
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。
一、实验目的
1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。
2．明确培养基的配制原理。
3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。
二、实验原理
灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过 180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏 I 号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在 高温下熔化成液体，而在 45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的 pH 偏酸；细菌、放线菌的 pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的 pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：
LB培养基配方（pH 7.0）：
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g
氯化钠（NaCl） 10.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至 7.0，用去离子水定容至1L，在0.1MPa压力下灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH 7.0）：
牛肉膏 3.0 g
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
NaCl 5.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
高氏 I号培养基配方（pH 7.4-7.6）：
可溶性淀粉 20.0 g
NaCl 0.5 g
KNO3 1.0 g
K2HPO4∙3H2O 0.5 g
MgSO4∙7H2O 0.5 g
FeSO4∙7H2O 0.01g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
马铃薯培养基配方（自然 pH）：
马铃薯（去皮） 200.0 g
葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
察氏培养基配方（自然 pH）：
蔗糖（glucose） 30.0 g
NaNO3 2.0 g
K2HPO4 1.0 g
KCl 0.5 g
MgSO4∙7H2O 0.5 g
FeSO4∙7H2O 0.01 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
YPD培养基配方（pH 7.0）：
酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g
蛋白胨（Peptone） 20.0 g
葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000mL
在0.1MPa压力下灭菌20min。
三、实验材料
牛肉膏蛋白胨、高氏 I号、LB、PDA、YPD、察氏等各种培养基。
四、仪器设备及用具
1. 90mm培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH 试纸（pH 5.5～9.0）、记号笔、麻绳、纱布等；
2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅。
五、试剂
无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、NaCl、琼脂粉、5mol/L NaOH、1mol/L HCl、KNO3、K2HPO4∙3H2O、MgSO4∙7H2O、FeSO4∙7H2O等。
六、实验步骤
1．洗涤
用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次，控干水分。
注意事项：
①不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
②用过的器皿应立即洗涤。
③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。
④洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。
2．器皿包扎
（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的不锈钢桶中，然后进行灭菌。
（2）吸管：洗净，烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4～
5cm的纸条，以 30～50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌，使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。
（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎。
3．烘干
洗净的仪器控去水分，放在烘箱内烘干，烘箱温度为 105～110℃烘1小时左右。此法适用于一般仪器。对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电吹风机吹至完全干燥。不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。
4．培养基的配置
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
A、称量
按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中。牛肉膏常用
玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
B、融化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
C、调节 pH
在未调 pH前，先用精密 pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其 pH，直至 pH达 7.6。反之，用 1mol/LHCL 进行调节。对于有些要求 pH较精确的微生物，其 pH的调节可用酸度计进行。 pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。
D、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。
E、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）。
a液体分装：分装高度以试管高度的 l/4 左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减
图 1-1 培养基的分装
A 漏斗分装装置；B 自动分装装置。
1 铁架；2 漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7 装量调节；8开关
少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
b固体分装：分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
c半固体分装：试管一般以试管高度的 1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
在分装过程中，应注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
F、加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当（见图3-2）。加塞时的棉塞的总长度的 3/5应在口内，2/5在口外。
图12 棉塞的制作
G、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
（2）高氏I号培养基配制方法
A、称量和溶化：按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分 FeSO4∙7H2O 可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在 100mL 水中加入 1g 的 FeSO4∙7H2O配成 0.01g/mL，再在 1000mL培养基中加 1mL的 0.0lg/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
B、调pH、分装、包扎：灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
（3）LB培养基配制方法
准确称量胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠（NaCl） 10g放入一烧杯中，摇动容器直至溶质溶解，加入15～20g琼脂粉，用5 mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，分装，0.1MPa灭菌 20 min。
（4）马铃薯培养基配制（PDA）
取去皮马铃薯 200g，切成小块，放入 1500mL的烧杯中煮沸 30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包扎、0.1MPa灭菌 20 min。
（5）察氏培养基配制
方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（6）YPD培养基配制
方法同LB培养基配制。
5. 灭菌
（1）高压蒸气灭菌
A、首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的去离子水，使水面与三角搁架相平
为宜。
B、放回内层锅，并装入待灭菌物品（各种玻璃器皿、培养基等）。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果，三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透人棉塞。
C、加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺拴，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
D、通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾5min，以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上徘气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所得压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
E、灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
（2）干热灭菌
A、装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。
B、升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱
内停止加温，此时如果还未达到所需的160～170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。
C、恒温
当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保温2h。
D、降温
切断电源、自然降温。
E、开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。
6. 无菌捡查
将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
注意事项：
由于纸张和棉花在180℃以上时，容易焦化起火，所以干热灭菌的温度切勿超过180℃；
由于油纸在高温下会产生油滴，滴到电热丝上易着火，所以进行干热灭菌的玻璃器皿严禁用油纸包装；
由于温度的急剧下降，会使玻璃器皿破裂，所以烘箱的温度只有下降到60℃以下，才可打开烘箱门；
烘箱内物品不宜放得太多，以免影响空气流通，而使温度计上的温度指示不准，造成上面温度达不到，下面温度过高，影响灭菌效果。
七、思考题
1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？
2. 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
3. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?
4. 培养基配好后为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后培养基是否无菌？
5. 你配制的高氏 I号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。
6. 细菌能在高氏 I号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？
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