小麦SBEⅡa、SSⅡa基因片段的克隆及VIGS重组载体的构建

新疆农业科学２０１３，５０（１１）：１９６１—１９６６　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｄｏｉ：１０．６０４８／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—４３３０．２０１３．１１．００１　小麦ＳＢＥⅡ　、ＳＳ　１Ｉ　ａ基因片段的克隆　及ＶＩＧＳ重组载体的构建　李淼淼，南富波，刘伟，李卫华　（石河ｉｆ－大学农学　新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子８３２００３）　摘要：【目的】克隆小麦ＳＢＥＩＩ。、ＳＳⅡａ基因部分序列并构建二者的ＶＩＧＳ重组载体，为在小麦上利用ＶＩＧＳ　技术研究ＳＢＥ　ｌＩ　ｏ、ＳＳⅡａ基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的小麦ＳＢＥ　ＩＩ　ａ　（ＡＦ２８６３１９．１）、ＳＳⅡ８（ＡＦ１５５２１７．２）基因序列分别设计特异引物，利用ＲＴ—ＰＣＲ技术克隆ＳＢＥｌＩａ、ＳＳⅡａ基　因的特异片段。然后以ＢＳＭＶ：　一ＰＤＳ为原载体，通过酶切连接用ＳＢＥ　ＩＩ　ａ、ＳＳ　Ｉ１　ａ基因片段分别将原载体中　的Ｐ　基因进行替换，从而构建ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥＩ１ａ和ＢＳＭＶ：＾，一ＳＳⅡａ重组载体。【结果】克隆的ＳＢＥＩＩａ和　ＳＳ１Ｉ　ａ基因片段长分别是１７８　ｂｐ和１７１　ｂｐ。序列分析表明：ＳＢＥＩ１　ａ基因片段与小麦ＳＢＥＩＩａ（ＡＦ２８６３１９．１）序　列同源性为１００％Ｉ、ＳＳⅡａ基因片段与ｓＳ１Ｉａ（ＡＦ１５５２１７．２）序列同源性也为１００％；酶切鉴定结果表明成功　构建ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥＩＩａ和ＢＳＭＶ：　一ＳＳｌＩａ重组载体。【结论】构建的ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥＩＩ口和ＢＳＭＶ：　一ｓＳｌＩａ　重组载体将为下一步利用ＶＩＧＳ技术在小麦上研究ＳＢＥ　ＩＩ　ａ、ＳＳⅡｏ基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。　关键词：小麦；ＳＢＥⅡ口；ＳＳＩ１ａ；ＶＩＧＳ载体　中图分类号：￥５１２．１；Ｓ１８８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—４３３０（２０１３）１ｌ一１９６１—０６　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｗｈｅａｔ　ｓＢＥ　１１　ａ　ａｎｄ　ＳＳ　ＩＩ　ａ　Ｇｅｎｅｓ　Ｐａｒｔｉａ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃ：ｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｅｉｒ　ＶＩＧＳ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ＬＩ　Ｍｉａｏ—ｍｉａｏ，ＮＡＮ　Ｆｕ—ｂｏ，ＬＩＵ　Ｗｅｉ，ＬＩ　Ｗｅｉ—ｈｕａ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｏａｓｉｓ　Ｅｃｏ—ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｘｉｎｉｆａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｆＡｇ—ｏ　ｒｏｎｏｍｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　ＸｉＴ￣ｉａｎｇ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｌａｙ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＳＢＥⅡａ、　Ｓ．ｓⅡａ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ｓｔａｒｃｈ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＶＩＧＳ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｗｈｅａｔ　ＳＢＥ　１　ａ　ａｎｄ　ＳＳ　ＩＩ　ａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ＶＩＧＳ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｂｕｉｈ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｗｈｅａｔ　ＳＢＥ　１　ａ　（ＡＦ２８６３１９．１），　Ⅱ０（ＡＦ１５５２１７．２）ｇｅｎｅｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ，ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅ—　ｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ＳＢＥⅡａ　ａｎｄ　ＳＳ　１１　ａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｈｏｕｇｈ　ＲＴ—ＰＣＲ．ＢＳＭＶ：　一ＰＤＳ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ＰＤＳ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＢＳＭＶ：　—ＰＤＳ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｂｙ　ｗｈｅａｔ　ＳＢＥ　１　ａ　ａｎｄ　ＳＳＩＩａ　ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　ｂｕｉｌｄ　ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥⅡａ　ａｎｄ　ＢＳＭＶ：＾ｙ—ｓｓＩＩ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＳＢＥ　１　ａ　ａｎｄ　ＳＳ　１Ｉ　ａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｒｅ　１　７８　ｂｐ　ａｎｄ　１　７　１　ｂｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｔｈａｔ　１　００％ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＳＢＥ　ＩＩ　ａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ＳＢＥⅡａ（ＡＦ２８６３１９．１），ＳｓⅡａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ＳＳⅡａ（ＡＦ１５５２１７．２）．Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ　ｒｅ一　收稿日期：２０１３—０４—１１　基金项目：国家自然科学基金项目（３１１６０２７９；３１２６０３５７）：　作者简介：李淼淼（１９８８一），男，硕士研究生，研究方向小麦品质遗传改良，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｎｏｎｇｘｕｅｍｉａｏｍｉａｏ＠ｓｉｎａ．ｃｏｎｒ　通讯作者：李卫华（１９６８一），女，教授，博士，研究方向为小麦品质改良和分子机理，（Ｅ—ｍａｉｌ）１ｗｈ—ａｇｒ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｅｌｌ　刘伟（１９７８一），男，副教授，博士，研究方向为分子生物学，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｗｅｉｌｉｕ２２４＠ｓｉｎａ．ｃｏｎ　ｌ９６２　新疆农业科学　５０卷　ｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥ　ＩＩ　ａ　ａｎｄ　ＢＳＭＶ：　一ＳＳ　ＩＩ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．　【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥ　１１　ａ　ａｎｄ　ＢＳＭＶ：　一ＳＳⅡａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｉｌｌ　ｌａｙ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＳＢＥ　ＩＩ　ａ．ＳＳⅡａ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ｓｔａｒｃｈ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＶＩＧＳ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｗｈｅａｔ；ＳＢＥⅡａ；ＳＳＩＩａ；ＶＩＧＳ　ｖｅｃｔｏｒ　０　引言　【研究意义】病毒诱导基因沉默（Ｖｉｒｕｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＶＩＧＳ）是近年来发展起来的一种快　速、高效应用于研究植物基因功能的反向遗传学新技术　Ｊ。小麦ＳＢＥ　ＩＩ　ｎ、ＳＳ　ｌＩ　ａ基因是淀粉合成过　程中的关键酶基因　。研究通过构建ＳＢＥ　１１　ｎ、ＳＳ　ＩＩ　ａ基因的ＶＩＧＳ重组载体，为下一步利用ＶＩＧＳ技术　在小麦上研究ＳＢＥＩＩ口、ＳＳⅡａ基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。【前人研究进展】自Ｈｏｌｚｂｅｒｇ等　首次利用ＶＩＧＳ技术以大麦条纹花叶病毒（Ｂａｒｌｅｙ　ｓｔｒｉｐｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ＢＳＭＶ）为载体在大麦上实现了ＰＤＳ　基因沉默以来，基于ＢＳＭＶ的ＶＩＧＳ（ＢＳＭＶ—ＶＩＧＳ）技术广泛应用于研究包括小麦　Ｊ、大麦　Ｊ、燕麦　等　植物基因功能。其中，ＢＳＭＶ—ＶＩＧＳ技术在小麦上的应用主要是研究植株抗病虫等过程中基因的功能，　如贺洋等　研究了ＴａＴＳＴ基因和小麦白粉病的关系。Ｓｃｏｆｉｅｌｄ等　研究了由Ｌｒ２１介导的抗叶锈病过程　中相关基因的功能。Ｖａｎ等　研究发现ＷＲＫＹ５３基因的转录因子和苯丙氨酸脱氨酶基因与小麦抗蚜虫　有关。此外，利用ＢＳＭＶ—ＶＩＧＳ技术也可以研究与小麦淀粉品质相关的功能基因，Ｍａ等　研究发现　ＨＭＷ—ＧＳ１Ｂｘｌ４和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。Ｂｅｎｎｙｐａｕｌ等　在小麦籽粒中实现了ＧＢＳＳ　基因的沉默，直链淀粉含量显著降低，表明ＧＢＳＳ基因参与直链淀粉的合成。【本研究切人点】但是，目　前利用ＢＳＭＶ—ＶＩＧＳ技术研究和小麦淀粉合成直接相关的小麦淀粉分支酶基因ＳＢＥⅡａ、小麦淀粉合　成酶基因ｓｓ　ＩＩ　ａ的基因功能尚未见公开报道。【拟解决的关键问题】研究选取与小麦淀粉合成直接相　关的ＳＢＥ１Ｉａ、ＳＳ１１　ａ为目的基因，构建ＢＳＭＶ：　—ＳＢＥⅡａ和ＢＳＭＶ：　一　Ⅱａ重组载体，为下一步利用　ＶＩＧＳ技术在小麦上研究ＳＢＥⅡ０、ＳＳ　ｌＩ　ａ基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。　１材料与方法　１．Ｉ　材料　小麦品种新春１１号种子由石河子大学农学院提供；大麦条纹花叶病毒的　、ＪＢ、　及７一ＰＤＳ载体由　加拿大农业部列桥研究中心Ｊｏｈｎ　Ｌｕ博士惠赠；Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒、琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购白天根生　化科技（北京）有限公司；限制性内切酶及ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒购自Ｔｈｅｎｎｏ公司（北京）；ｐＭＤ１９一　Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ、Ｔ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ购自ＴａＫａＲａ公司（大连）；２×Ｅｓ　Ｔａｑ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（含染料）酶购自北京康为世纪　生物科技有限公司；引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。　１．２方法　１．２．１　小麦籽粒总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成　取花后１２　ｄ的小麦籽粒，去胚后，按照本实验室改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ。用核酸分析仪和琼　脂糖凝胶电泳检测总ＲＮＡ质量，并用ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒进行反转录。　１．２．２　ＳＢＥ　Ｉ１　ａ、ＳＳⅡａ基因片段的克隆　根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的小麦ＳＢＥⅡａ（ＡＦ２８６３１９．１）、Ｓｓ　１１　ａ（ＡＦ１５５２１７．２）基因序列，选取特异序列　设计引物，并引入Ｐａｃ　Ｉ和Ｎｏｔ　Ｉ酶切位点。ＳＢＥ　１１　０、ＳＳ　ＩＩ　ａ基因片段的ＰＣＲ扩增体系（１０　）：２×Ｅｓ　Ｔａｑ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ　５　ＩｘＬ、ｃＤＮＡ和上、下游引物（１０　ｍｍｏＬ／Ｌ）各１　ＩｘＬ、ｄｄＨ２Ｏ　２　ｔｘＬ。扩增程序：９４＇１２预变性５　ｍｉｎ；９４ｏＣ变性４０　Ｓ，５７￣Ｃ退火４０　Ｓ，７２￣Ｃ延伸４０　Ｓ，共３０个循环；７２￣Ｃ延伸１０　ｍｉｎ。表１　ＰＣＲ扩增产物用１％的琼脂糖凝胶电泳检测并分别回收目的条带。然后分别与ｐＭＤ１９一Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　连接，转化大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌液ＰＣＲ阳性菌落提取质粒酶切验证，阳性克隆送北京六合华大基因科　１１期　李淼淼等：小麦ＳＢＥⅡ口、｜Ｓ５Ⅱ０基因片段的克隆及ＶＩＧＳ重组载体的构建　１９６３　技股份有限公司进行测序，并命名ｐＭＤ１９一ＳＢＥⅡａ和ｐＭＤ１９一ｓｓｌＩａ。　表１　ＳＢＥ　ＩＩａ、ＳＳ　ＩＩａ基因片段扩增引物　Ｔａｂｌｅ　１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ＳＢＥ　ＩＩ口、ＳＳⅡａ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１．２．３　ＳＢＥ１１口、ＳＳⅡａ基因的ＶＩＧＳ重组载体构建　用限制性内切酶Ｐａｃ　Ｉ／Ｎｏｔ将ＳＢＥ　１１口、ＳＳⅡａ基因片段从ｐＭＤ１９一ＳＢＥⅡ口、ｐＭＤ１９一ＳＳ　ＩＩ　ａ载体　上切下来，分别回收纯化。同时用Ｐａｃ　Ｉ／Ｎｏｔ　Ｉ双酶切ＢＳＭＶ：７一ＰＤＳ载体，回收纯化大片段ＢＳＭＶ：。　然后分别将回收的ＳＢＥ　１１　ｎ、ＳＳⅡａ基因片段和ＢＳＭＶ：Ｔ连接，转化大肠杆菌ＴＯＰＩＯ，菌液ＰＣＲ阳性菌落　提取质粒酶切验证。　２结果与分析　２．１　小麦籽粒总ＲＮＡ质量分析　用本实验室改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的小麦胚乳总ＲＮＡ经核酸分析仪检测显示ＯＤ：印／ＯＤ　。。：１．９５—　１．９８，ＯＤ２印／ＯＤ２３０：２．０—２．２５，浓度在２　８４６—３　６２８　ｎ　Ｌ。电泳结果显示，２８Ｓ和１８Ｓ条带明亮、清晰，　说明提取的总ＲＮＡ质量较好。图１　搀喜　图１　小麦胚乳总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳图　Ｆｉｇ．１　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２．２　ＳＢＥ¨ａ、ＳＳ¨ａ基因片段的克隆结果　ＳＢＥ　１Ｉ　ａ、ＳＳ１Ｉ　ａ基因片段的ＰＣＲ扩增结果显示电泳条带清晰，大小与预期一致。ＳＢＥ　１Ｉ口、ＳＳⅡａ基　因片段分别与ｐＭＤ１９一Ｔ连接，转化大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌液ＰＣＲ阳性菌落提取质粒酶切验证，酶切条　带大小与预期相符。测序结果显示：克隆的ＳＢＥⅡａ和　Ⅱａ基因片段分别长１７８　ｂｐ、１７１　ｂｐ。序列分　析表明：ＳＢＥⅡａ基因片段与小麦ＳＢＥⅡａ（ＡＦ２８６３１９．１）序列同源性１００％．、ＳＳⅡａ基因片段与　Ⅱａ　（ＡＦ１５５２１７．２）序列同源性也为１００％。表２，图２，３　２。３　ＳＢＥ¨ｎ、　¨ａ基因的ＶＩＧＳ重组载体构建　将构建ＢＳＭＶ：＾ｙ—ＳＢＥ　ＩＩ　ａ和ＢＳＭＶ：　一ＳＳ　ＩＩ　ａ重组载体分别转化大肠杆菌ＴＯＰＩＯ，菌液ＰＣＲ阳性　菌落提取质粒酶切验证。双酶切鉴定结果表明，目的条带大小与预期相符，说明成功构建了ＢＳＭＶ：＾ｙ—　ＳＢＥＩＩａ、ＢＳＭＶ：　一　１Ｉａ重组载体。图４　李淼淼等：小麦ＳＢＥ　１１　０、　ｌａ基因片段的克隆及ＶＩＧＳ重组载体的枸建　１９６５　ｂ　ｌ　２　嚷　１　注：Ｍ：ＤＮＡ标准分子量；１、２：限制性内切酶Ｐａｃ　Ｉ／Ｎｏｔ　Ｉ双酶切ＢＳＭＶ：ｙ—ＳＢＥⅡａ和ＢＳＭＶ：　一ＳＳ１１　ｎ；　Ｎｏｔｅ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　２０００；１　ａｎｄ　２：ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥ１ＩⅡａｎｄ　ＢＳＭＶ：￣／一ＳＳⅡａ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｐａｃ　１／Ｎｏｔ　Ｉ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　图４　ＢＳＭＶ：　—ＳＢＥＩＩａ、ＢＳＭＶ：＂ｙ—ＳＳⅡａ载体酶切图　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＳＭＶ：　—ＳＢＥ　ＩＩ口、ＢＳＭＶ：　—ＳＳ　ＩＩ　ａ　ｖｅｃｔｏｒｓ　等缺点　，而ＶＩＧＳ技术能够突破这些局限　，使得其成为研究植物基因功能新手段。研究利用　ＶＩＧＳ技术通过克隆小麦淀粉分支酶基因ＳＢＥ　ＩＩ　ａ、小麦淀粉合成酶基因Ｓ５Ⅱａ的部分序列，构建　ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥ１１　ａ和ＢＳＭＶ：　一ＳＳ１１。重组载体，下一步进行体外转录，然后采用摩擦法接种刚抽穗的　小麦穗部，在发育的小麦籽粒中研究小麦ＳＢＥＩＩａ、ＳＳ　ＩＩ　ａ基因与小麦淀粉合成的关系。　４　结论　研究通过将构建的ＢＳＭＶ：　一ＳＢＥ１Ｉｏ和ＢＳＭＶ：ｙ—ＳＳⅡａ重组载体进行酶切鉴定，成功构建了与　小麦淀粉合成直接相关的淀粉分支酶基因ＳＢＥⅡｎ、淀粉合成酶基因　Ⅱａ的ＶＩＧＳ重组载体，期望下一　步在小麦上通过ＶＩＧＳ技术实现ＳＢＥⅡ。、ＳＳ　ＩＩ　ａ基因沉默，研究基因对小麦淀粉合成的影响，从而进一　步丰富和扩大ＶＩＧＳ技术在小麦中的应用范围。　参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　［１］Ｂｕｒｃｈ～Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｄｉｎｅｓｈ—Ｋｕｍａｒ　ｓ．Ｐ．（２００４）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，３９（５）：ＰＰ．７３４－７４６．　［２］Ｓａｈｕ，Ｐ．Ｐ．，Ｐｕｒａｎｉｋ，Ｓ．，Ｋｈａｎ，Ｍ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｍ．（２０１２）．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｏｍａｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＶＩＧＳ［Ｊ］．Ｐｒ０一　ｔｏｐ￣ａｚｍａ，２４９（４＞：ＰＰ．１￣）１７—１ｏ２１．　［３］Ｂａｌｌ，Ｓ．Ｇ．，Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．Ｋ．（２００３）．Ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｉｒａｌ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｔｏ　ｓｔａｒｃｈ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｔｒａｃｈ　ｇｒａｎｕｌｅ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，５４：ＰＰ．２０７—２３３．　［４］Ｈｏｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｂｒｅｓｉｏ，Ｐ．，Ｐｏｇｕｅ，Ｇ．Ｐ，ｅｔ　ａ１．（２００２）．Ｂａｒｌｅｙ　ｓｔｒｉｐｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　ａ　ｍｏｎｏｃｏｔ　ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，３０（３）：ｐｐ．３１５—３２７．　［５］Ｂｅｎｎｙｐａｕｌ，Ｈ．Ｓ．，Ｍｕｔｔｉ，Ｊ．Ｓ．，Ｒｕｓｔｇｉ，ｓ．，ｅｔ　ａ１．（２０１２）．Ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＶＩＧＳ）ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ　ｒｏｏｔ，ｌｅａｆ，ａｎｄ　ｍｅｉｏｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ＆Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２（１）：ＰＰ．１４３—１５６．　［６］Ｐａｃａｋ，Ａ．，Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｋ．，｝ｒｇｅｎｓｅｎ，Ｂ．，ｅｔ　１ａ．（２０１０）．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈａｒｌｅｙ　ｓｔｉｒｐｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ａｓ　ａ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ｒｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｉｎ　Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｅｈｙｏｎ　ａｎｄ　ｏａｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，６；２６．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１—６—２６．　［７］贺洋，岳洁瑜，王华忠．利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因ＴａＴＳＴ与小麦抗白粉病反应的关系［Ｊ］．作物学　报。２０１２，３８（２）：２３１—２３９．　ＨＥ　Ｙａｎｇ，ＹＵＥ　Ｊｉｅ—ｙｕ，ＷＡＮＧ　Ｈｕａ—ｚｈｏｎｇ．（２０１２）．Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＴａＴＳＴ，ａ　ｗｈｅａｔ　ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ　ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｔｏ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｇｒｏｎ　Ｓｉｎ，３８（０２）：ＰＰ．２３１—　２３９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　ｌ９６６　新疆农业科学　５０卷　Ｅ８　３　Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒａｎｄｔ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ　ａ１．（２ｏｏ５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆａ　ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ—ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ　ｈｅｘａｐｌ０ｉｄｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｌｒ２１一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｌｅａｆ　ｒｕｓｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１３８（４）：ｐｐ．２，１６５—２。１７３．　［９］Ｖａｎ　Ｅｃｋ，Ｌ．，Ｓｃｈｕｈｚ，Ｔ．，Ｌｅａｃｈ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ　ａ１．（２０１０）．Ｖｉｕｓ—ｉｒｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ＷＲＫＹ５３　ａｎｄ　ａｎ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｈｅｎ　ｎ　，　口ｍｍＤ—　ｎｉａ—ｌｙａｓｅ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ａｐｈｉｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，８：ＰＰ．１，０２３—１，０３２．ｄｏｉ：１０．Ｉ１ｌｌ／ｊ．１４６７—７６５２．２０１０．　００５３９．ｘ．　［１０］ＭＡ　Ｍｅｎｇ，ＹＡＮ　Ｙａｎ，ＬＩＨｕａｎｇ，ｅｔａ１．（２０１２）．Ｖｉｕｓ—ｉｒｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ—ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｗｈｅａｔ　ｓｐｉｋｅｓ　ａｎｄ　ｇｒａｉｎｓ　ａｎｄｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＨＭｗ—ＧＳ—ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣＰｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２（１）：Ｐ．１４１．ｄ０ｉ：１０．１１８６／１４７１—２２２９—１２—１４１．（ｉｎ　Ｅｎｓｌｉｓｈ）　［１１］Ｙａｍａｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｓ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ　ａ１．（２０００）．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｔａｒｃｈ　ｇｒａｎｕｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＧＰ一１　ｏｆｗｈｅａｔ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ａｎ　ｌａｔｅｒｅｄ　ｓｔａｒｃｈ　ｗｉｔｈ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｈｉｇｈ　ａｍｙｌｏｓｅ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄＡｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｌＯ１（１—２）：ＰＰ．２１—２９．　［１２］Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｓ．，Ｍｉｃｈｅｌａ，Ｊ．，Ａｎｇｅｌａ，Ｄ．，ｅｔ　ａ１．（２０１０）．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｄｕｕｍ　ｒｗｈｅａｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＢＥＩＩａ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌＯ（１）：Ｐ．１４４．ｄｏｉ：１０．Ｉ１８６／１４７１—２２２９—１０—１４４　［１３］Ｂｏｕｅｈ４，Ｎ・，Ｂｏｕｃｈｅｚ，Ｄ．（２００１）．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｗａｎｔｅｄ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｏｌｙ，ｇ４（２）：ＰＰ．１１１　一ｌ１７．　［１４］ＦＵ　Ｄａｏ—ｌｉｎ，Ｕａｕｙ，Ｃ．，Ｂｌｅｃｈｌ，Ａ．，Ｄｕｂｃｏｖｓｋｙ．Ｊ．（２００７）．ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆｒｗｈｅａｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈ，１６（６）：ＰＰ．６８９—７０１．　［１５］Ｐｕｒｋａｙａｓｔｈａ，Ａ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｉ，（２００９）．Ｖｉｒｕｓ～ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７（１１—１２）：ＰＰ．９６７—９７６．　本刊重要启示　本刊已许可中国学术期刊（光盘版）电子杂志社在中国知网及其系列数据库产品中，以数字化方式　复制、汇编、发行、信息网络传播本刊全文。该社著作权使用费与本刊稿酬一并支付（或：相关稿酬不再　另行支付）。作者向本刊提交文章发表的行为即视为同意我社上述声明。　《新疆农业科学》编辑部