肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.06.029

云oodResearchAndDevelopment食品研究与开发圆园19年3月

第40卷第6期

161肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

*

楼飞1，杨秀敏2，章寅3，（1.上海市农业科学院庄行综合试验站，上海201415；2.沈阳市动物疫病预防控制中心，

辽宁沈阳110034；3.上海德诺产品检测有限公司，上海200436）

摘要：乳铁蛋白是一种极具营养价值的活性糖蛋白，广泛应用到婴幼儿乳粉中，目前国内外未建立乳铁蛋白测定相关的标准。将肝素亲和柱（HiTrapTMHeparinHP柱）或相当者应用到乳铁蛋白检测前处理的净化过程中，建立一种高试样中的乳铁蛋白经磷酸氢二钠溶液（0.20mol/L，效、便捷的食品中乳铁蛋白测定的分析方法。pH=8.00依0.5）提取，提取液经肝素亲和柱净化后，用磷酸氢二钠溶液淋洗，磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，并定容至3.0mL。采用反相高效液相色谱柱分离，以紫外或者二极管阵列检测器于280nm处检测，外标法定量。该方法系首次提出将肝素亲和柱应用到乳铁蛋白检测前处理过程中。该检测方法适合检测机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测。关键词：乳铁蛋白；肝素亲和柱；磷酸盐缓冲液；高效液相色谱法；C4

ApplicationofHeparinAffinityColumnintheDetectionofLactoferrin

（1.ShanghaiAcademyofAgriculturalSciencesZhuanghangComprehensiveExperimentStation，Shanghai

China；3.DenuoProductTestingServiceCO.，Ltd.，Shanghai200436，China）

*

LOUFei1，YANGXiu-min2，ZHANGYin3，201415，China；2.ShenyangAnimalDiseasePreventionandControlCenter，Shenyang110034，Liaoning，

粤遭泽贼则葬糟贼：Lactoferrinisakindofactiveglycoproteinwithgreatnutritionalvalue，whichiswidelyusedininfantHeparinaffinitycolumn（HiTrapTMHeparinHPcolumn）orequivalentwereappliedtothepurificationprocessofmilkpowder.Atpresent，thereisnorelevantstandardforthedeterminationoflactoferrinathomeandabroad.

lactoferrinbeforepretreatment.Anefficientandconvenientmethodforthedeterminationoflactoferrininfoods

0.5）.Theextractwaspurifiedbyheparinaffinitycolumn，washedwithNa2HPO4buffersolution，andNa2HPO4-（HPLC）wasusedwithultravioletabsorptiondetector（UV）ordiodearraydetector（DAD）at280nm，andtheexternalstandardmethodwasquantified.Itwasthefirsttimetoputforwardtheideathatheparinaffinitycolumnwasappliedtothepurificationoflactoferrinbeforedetection.Theimprovedmethodwassuitablefordetectionoflactoferrinindetectionmechanismordairyenterprises.

NaClbuffersolutionwaselutedandthefinalvolumeto3.0mL.Highperformanceliquidchromatography

wasestablished.ThelactoferrininthesamplewasextractedbyNa2HPO4buffersolution（0.20mol/L，pH=8.00依

（1984—）研究方向：食品安全管理、检测。作者简介：楼飞，男（汉），工程师，硕士研究生，章寅（1986—）食品安全管理、检测。*通信作者：，女，工程师，硕士研究生，研究方向：[8]王静.基于傅立叶变换红外光谱和化学计量技术的致病微生物

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收稿日期：2018-07-26

运藻赠憎燥则凿泽：lactoferrin；heparinaffinitycolumn；phosphatebuffer；highperformanceliquidchromatography（HPLC）；C4

引文格式：

楼飞，杨秀敏，章寅.肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化[J].食品研究与开发，2019，40（6）：161-165

LOUFei，YANGXiumin，ZHANGYin.ApplicationofHeparinAffinityColumnintheDetectionofLactoferrin[J].FoodRe原162楼飞，等：肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

检测分析

searchandDevelopment，2019，40（6）：161-165

乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度较快的一种营养添加剂，由于其具有：广谱抗菌，抗病毒感染作用；能调节体内铁平衡；调解骨髓细胞的生成；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，有效地治疗疾病等功效，使其产品在国内外食品加工中的应用范围日益广泛[1-2]。乳铁蛋白是一种极具营养价值的活性糖蛋白，对婴幼儿或者成人的健康具有重要的意义[3-4]。GB14880-2012我国《食品营养强化剂使用标准》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0g/kg，而目前国内外未建立乳铁蛋白测定相关的国家标准。文献中报道的测定乳铁蛋白含量的方法大致可以归为以下几类：酶联免疫吸附法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法oresissodium，SDS-PAGEdodecylsulfate-polyacrylamide管电泳法、高效液gelelectroph相色谱法

-和高效液相串联质谱法）、毛细[5-7]。

其中，酶联免疫吸附法是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种新颖、快速的免疫学分析技术，具有灵敏度高、检测限低、样品无需纯化等特点，因此该法应用范围最广、常用于包括初乳和乳粉等一系列产品中的乳铁蛋白质量浓度的测定，但该法所用试剂盒昂贵，不适于长期大量检测乳铁蛋白。SDS-PAGE法具有测定准确快速、操作简便等特点，适用于初步分离效果的监控，但对纯度较低的乳铁蛋白检测时，由于乳铁蛋白与其他杂蛋白分子量相近，很难达到分离，故仅适用于高纯度的样品测定。毛细管电泳法由于进样量少，因而制备能力差，而且由于毛细管直径比较小，造成了灵敏度较低，重现性差等一系列缺点。

高效液相色谱法拥有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化等优点，是目前食品检测领域应用最广泛的方法之一。乳铁蛋白的等电点为8.2左右，是一种分子量为80kDa，具有大约700个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1耀2个配糖体

（配糖体成分约占7%）[8-10]

。乳铁蛋白一共有两个铁离子

结合位，每个结合位可以与一个铁离子结合。现已有多篇文献研究报道应用高效液相色谱检测乳制品中

的乳铁蛋白含量，前处理方法包括：（1）样品采用脱脂，酸法去除酪蛋白，硫酸铵沉淀富集，纤维素滤膜过滤净化等方法进行预处理[11-12]；（2）通过额外加入的二价铁离子使乳铁蛋白的构型更利于沉淀，然后用体积分数60%乙醇溶液沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸盐缓冲液提取乳铁蛋白并分离掉酪蛋白进行预处理[13-14]；（3）样品采用0.5mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至适当浓度作为预处理等方法[15]。

肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖，有文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子糖胺多糖通过亲和层析结合[16-18]。本标准中采用HiTrapTM肝素亲和柱作为目标化合物纯化和Heparin浓缩的前HP（处1理mL步）

骤[19-20]，由于是首次将该亲和柱应用到乳铁蛋白的检测中，故对应用条件进行了摸索和优化，包括：肝素亲和柱的承载量、淋洗液和洗脱液的浓度、pH值等参数的优化等，建立一种适合乳铁蛋白检测的前处理净化方法。1

1.1材料与方法

乳试铁剂与蛋白仪器

标准物质（批号：SP113101）：Tatua公司

提供；乙腈为（色谱纯）：美国默克公司；无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（均为分析级）：国药集团化学试剂有限公司产品；超纯水：美国赛默飞世尔科技有限公司；高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；HiTrapTM通用电气医疗集团Heparin；JouanHPCeterifuge（1mL）肝MR23i素亲和离柱心：机美：国美1.2国赛默方飞法

世尔科技有限公司。

1.2.1本肝方素法亲中和采柱用的HiTrap应用比TM较

和柱作为目标化合物纯化和浓缩Heparin的前HP处（理1步骤mL）肝。通素过亲

经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品色谱图，分析其1.2.2对乳铁肝蛋白素亲检和测柱应承用载量的可的行肝素亲和柱对乳铁测性蛋白定。

该款纯化和浓缩的前处

理步骤未有报道，亲和柱的承载量对方法的准确度方

（检测分析

楼飞，等：肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

面有很大的影响，故在本方法中进行了承载量的试验。采用40滋g耀10000滋g不同的上柱量测定回收率的方1.2.3式，选定承载量前磷处酸理盐过浓度范围程中的需优值要化

。分离纯化乳铁蛋白，故首先要

求将乳铁蛋白从基质中以溶解的状态释放出来，并保持原先的天然状态，不丢失生物活性。故在本方法中进行磷酸盐浓度的优化，通过奶粉本底和加标回收率0.05的测、定0.1，、在0.2磷酸盐pH=7.0的条件下，依次选择浓度为

1.2.4乳磷铁酸蛋白盐、0.4是一种分子pH、0.8值的mol/L优化

进行比较。量为80kDa，具有大约700

个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1个耀2个配糖体。对于这一类大分子量的蛋白质，pH值对其的结构有一定的影响。故在本方法中进行磷酸盐pH值的优化，通过奶粉本底和加标回收率的测定，在磷酸盐浓度6.0为0.2mol/L的条件下，依次选择1.2.5、7.0、洗洗8.0脱脱、pH值为5.0、步骤液9.0盐进行属浓度比于肝的较。素优亲化

和柱使用过程中比较关键

的步骤，在此步骤中乳铁蛋白目标化合物将从亲和柱中被洗脱下来，故洗脱液的浓度对整个试验比较关

键。选定Na个不同浓度2HPO的NaCl4的浓度为0.05mol/L，pH=7.0，设定4浓度即0.25、0.50、1.0、2.0mol/L，

通1.2.6过加标回收测定，选定同洗样脱原液理，pH最佳的NaCl浓度。选值定的0.05优化

mol/L的Na浓度2HPO4，1.0mol/L8.01.2.7、9.0的，NaCl本肝通方素过，设定5个不同的pH值即5.0、6.0、7.0、法亲加中和标采柱回用洗收1脱测mL体定积，选规格的定测最的定

佳的pH值。HiTrapTM亲和柱，乳铁蛋白的上柱量控制在100滋g耀Heparin10000滋HP

g，试验设计当乳铁蛋白的上柱量为最大值即10000滋g时5，分别收集第1mL，第2mL，第3mL，第4mL，第1.2.8mL，第目自制6mL前市肝场素耀8上亲mL使和用柱的率性能洗脱最高的液的比，肝较

上机测定。素亲和柱是由美国

通用电气医疗集团生产的HiTrapTM

柱，为了验证乳铁蛋白检测是否只能Heparin依靠该HP款亲亲和和柱，本试验采用偶联有肝素分子的琼脂糖作为填料自Trap制了一批肝素亲和柱。将自制的肝素亲和柱与Hi原

TM行HeparinHP肝素亲和柱在相同的试验条件下进1.3回收率的测定色谱液相色谱条件

。

柱规格：C4，5滋m，300A毅（孔径），250mm伊

4.6163积：50mm（滋L内；流径）速；：检1.0测mL/min波长：280；流动nm相；柱：0.1温：%30三氟乙益；进样酸体溶液和乙腈，梯度洗脱参数见表1。

表1流动相梯度洗脱程序表Table1Optimizationofgradientelution时间0/min

乙腈%三氟乙5

30/%0.155

70酸溶液/%

106045124016303070702

2.1结果与分析

图肝素1为亲经和过柱和的未应经用过比肝较素亲和柱纯化的样品液相

色谱比较图。

6.0804.560

3.021

b40201.50

2

4

6

/min

8

10a

12

14

0

时间蛋白a.未经和过杂净质化的，保留婴时间幼儿为奶粉6.1；b.min经；过色谱净化的峰2样品代表乳；

色谱铁蛋白峰1，代保表乳留时间

铁为6.1min。

图1肝素亲和柱纯化样品比较色谱图

Fig.1HPLCchromatogramoflactoferrinwithheparinaffinity

columncleanupandwithout

从色谱图1中可以看出未纯化的样品成分复杂，难以满足检测需要，经过肝素亲和柱纯化的样品，杂2.2质少，肝峰形素亲好和，符柱合承检载量测的的要测求定。

承载量1mL的测HiTrapTM定结果见Heparin表2。HP肝素亲和柱对乳铁蛋白

表21mLHiTrapTMHeparinHP肝素亲和柱对乳铁蛋白承载量的

测定

（n=3）Table2Determinationofthebearingcapacityoflactoferrinby

1mLHiTrapTMHeparinHP（n=3）

上柱40量/滋g

回收50.8率/%1008077.516093.894.7132000097.097.1105000000103105楼飞，等：肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

检测分析

164从表2可知，当乳铁蛋白的上柱量达到100滋g

时，1mL规格的HiTrapTM收率就达到90%以上，乳Heparin铁蛋白的上HP肝柱素量亲在和100柱的滋g回10000滋g时，回收率在93.8%耀105%之间，符合试验

耀要100求滋。g耀故10本000试验中滋g之将间样品，如中果乳试铁验中蛋白遇的上到高柱浓度量控乳制蛋白含量的样品时，需将样品稀释至合适的浓度后再铁

使2.3用亲和柱；反之则可适当增加称样量和上柱体积磷磷酸酸盐盐浓度浓度的的优优化化

。结果见表3。

表3磷酸缓冲液浓度优化表（n=3）

Table3Optimizationofphosphatebufferconcentration（n=3）添加水平/

（mg/100g）

磷酸盐pH值

磷酸盐浓度/（mol/L）

回收率/%30307.07.00.050.20.1

80.289.130

30307.0

7.07.00.80.4

90.500从表3数据得知，随着磷酸缓冲液浓度的增加，回0.4收缓冲mol/L率先液浓度时增，加为回后0.2收降低率mol/L为至0，，零故，当磷酸缓冲液浓度达到同选时定发乳现铁在蛋白该浓度检测时下目磷标酸峰

附2.4近的磷磷杂酸酸质盐盐最pHpH少值值，符的的合优优试化化

验要求。结果见表4。

表4

磷酸缓冲液pH优化表

（n=3）Table4OptimizationofphosphatebufferpH（n=3）

添加水平/磷酸盐浓度/（mg/100g）

（mol/L）

磷酸盐pH值

回收率/%30300.20.25.072.385.33030

30

0.20.2

0.2

8.07.0

6.09.091.390.5

87.6从表4可知，随着磷酸缓冲液pH值的增加，回收率先增加后降低，整体数值在72.3%~91.3%之间，当磷酸缓冲液pH值为8.0时回收率为最大，同时此pH值下2.5目洗洗标脱脱峰液液附近的杂质最少，符合试验要求。盐盐浓度浓度的的优优化化

结果见表5。

从表5可知，随着NaCl浓度的增加，回收率相应增加。高浓度的NaCl有利于乳铁蛋白从亲和柱中的洗脱。但2.0mol/L的NaCl容易造成液相色谱仪的损

表5洗脱液盐浓度优化表

（n=3）Table5OptimizationofNaClconcentration（n=3）添加量/mg

洗脱液pH值

NaCl浓度（/mol/L）回收率/%

0.30.3

7.07.0

0.250.5000.3

0.37.07.01.023.22.096.497.8NaCl伤，不作为利于洗机脱器浓度稳定。

状态的保持，故选定1.0mol/L的

2.6洗洗脱脱液液pHpH值值的的优优化化

结果见表6。

表6磷酸缓冲液pH优化表

（n=3）Table6OptimizationofphosphatebufferpH（n=3）

添加量/mg

NaCl浓度（/mol/L）洗脱液pH值

回收率/%0.30.30.3

1.01.06.05.095.294.90.30.3

1.01.0

1.0

7.0

9.08.0

97.698.0

96.4

从表6试验结果可以得知，不同的pH值下，回收3.2率范围%，故为选94.9定常规%耀98.0的pH=8%，最。

高值和最低值的相对相差

2.7肝肝素素亲亲和和柱柱洗洗脱脱体体积积的的测测定定

结果见表7。

表7肝素亲和柱洗脱体积的测定

（n=3）Table7Optimizationofelutionvolume（n=3）

洗脱体积峰面积标样浓度/标样峰定容体计算结

洗脱

（滋g/mL）面积积/mL果/mg

率/%第1mL

818.450129206.3463.4第2mL427.350129203.3133.1第3mL39.25012910.0150.15第4mL050129100第5mL050129100第86mLmL耀0

50

129

3

0

0

由表7可知1mL规格的HiTrapTM素亲和柱，乳铁蛋白的上柱量为10000Heparin滋g时，收HP集到肝

的第1mL和第2mL的洗脱液中乳铁蛋白总的洗脱率达到96.5%以上，第3mL洗脱液中乳铁蛋白的洗脱率为0.15%，第4mL，第5mL，第6mL耀8mL的洗脱液中未检测到乳铁蛋白，故本试验中选定收集洗脱液的2.8体积自制自制为3.0肝肝素素mL亲亲。

和和柱柱性能性能的的比比较较

结果见表8。

检测分析

楼飞，等：肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

（n=3）表8自制肝素亲和柱性能的比较

Table8Comparisonofthepropertiesofhomemadeheparinaffinitycolumns（n=3）

名称

回收率1/%

回收率2/%

回收率3/%

平均回收率/%

165相对相差/%

自制的肝素亲和柱99.296.4HiTrapTMHeparinHP肝素亲和柱102.498.6由表8可知，在相同的试验条件下上海德诺产品检97.6测%有，限公司相对相的实验差1.4%室，HiTrap自制的亲和柱平均回收率为TM柱的平均回收率100.4%，相对相Heparin差1.9%HP，柱肝效比素亲较和

接近，证明同类型的肝素亲和柱可以使用到本方法中用于乳铁蛋白的检测。3

结论

本文首次提出将肝素亲和柱应用到乳铁蛋白检测前处理过程中，优化之后的前处理过程包括：试样8.00中的依乳0.5铁）蛋白提取，经HiTrap磷酸氢二钠溶液（0.20mol/L，pH=

TM

柱经上述磷酸氢二钠溶液Heparin活化后，HP上1样mL，经规格过磷的亲酸和

氢0.05二钠mol/L溶液淋，NaCl洗，磷1酸mol/L氢二钠，pH=8.00-氯化依钠0.5溶液

）洗（脱磷3.0具有mL检，测成上机本低、测定。操本作方方法便与简文献单、耗中时报道较短的方，并酸、重复法定氢二钠相容性比至好，、

灵敏度高的优势，能满足目前乳铁蛋白的日常检测任务。参考文献：

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收稿日期：2018-08-02