IQ5校准步骤

 进行校正前的准备:

必须准备好下列的物品才能进行校正:

1. iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set

2. External Well Factor Solution (与iQ Calibrator Dye Solution Set在一起) 3. 3块96孔PCR反应板 4. QPCR专用封膜

校正前3块96孔PCR反应板的准备:

1. Plate A： 校正液板 ( well factor solution plate)

a. 先将10x 的External Well Factor Solution用水稀释至1x ： 待External Well Factor Solution（10×）融化后，取600ul至小烧杯中，加蒸馏水（或去离子水）5,400ul, 混匀，即为1×工作液。

b. 将上述1x工作液以等体积加入板A的每个反应孔内, 每孔50ul。 c. 用封膜将板封好。

2. Plate B：空板

取一空的96孔板，用封膜封好。

3. Plate C ：纯染料板（ Pure dyes plate）.

a. 从calibrator solution kit中取出 FAM、HEX、TAMRA、TexasRed和Cy5五种标准染料，待融化后，按下图所示加入板C中，每孔50ul。（每种染料共加8个孔）

b. 用封膜将板封好。

 校正标准流程的小结:

共需要进行下面4步校正：

1. Mask – 需使用Plate A

2. Background – 需使用Plate B 3. Well Factors – 需使用Plate A 4. Pure Dyes –需使用Plate C

 具体的操作说明:

在进行校正前提前10分钟左右打开iQ5.

一．Mask Alignment:

1. 将Plate A 放入iQ5的热循环base部位.

2. 切换至软件的Calibration模块的Mask按键. 3. 点击Home. 4. 点击Filter Position 3 option button. 5. 点击Take an Exposure. 6. 点击Show Mask.

7. 如果在Mask上有粉红色的像素出现, 减少暴光时间再次进行暴光直至Mask没有粉红色的像素出现为止. 8. 点击 Optimize Mask.

9. 点击 Save Mask. Mask校正即完成。

二． Background Calibration(背景校正)

（注：按Plates/Film和tube/demo caps共做两次背景校正。）

1. 将上述Plate B放入iQ5的热循环base部位。 点击Background键，进入背景校正界面。 2. 在Seal Type中选择 Film (见下图). 3. 在Vessel Type中选Plates (见下图).

4. 点击Collect Background Factors(见下图).

5. 当iQ5完成了背景的校正后, 会弹出一个对话框 \"Background Calibration Run Complete.\" 6. 点击 OK 退出.

（从步骤2开始，选 domed cap/tubes, 再进行一次较正。保存结果）

三．Persistent Well Factor Generation:

1. 将上述Plate A 放入iQ5的热循环base部位.点击Well Factor键进入Well Factor 界面。 2. 选择反应体积数为50ul (见下图). 3. 在Seal Type中选择Film (见下图). 4. 在Vessel Type中选择Plates (见下图).

5. 点击Collect Persistent Well Factors(见下图).

6. 当iQ5完成了永久孔间校正因子的校正后,会弹出一个对话框, \"Persistent Well Factor Calibration Run Complete\". 点击OK 退出.

（注：从步骤2开始，选 domed cap/tubes, 再进行一次Persistent Well Factor收集。保存结果）

四．Pure Dye Calibration:

1. 将上述Plate C 放入iQ5的热循环base部位. 点击Pure Dye按键，进入Pure Dye校正界面 2. 点击右侧 Edit键，进入板编辑界面。

3. 在Sample Volume中输入50

4. 点击Save & Exist Plate Editing, 保存文件

5. 点击Run Pure Dye Calibration.

6. 当iQ5完成Pure Dye Calibration后会弹出一个对话框, \"Pure Dye Calibration Run Complete\". 7. 点击 OK 并退出.

（注：按上述方法，将Sample Volume 仍设为50， Seal Type 和 Vessel Type分别选domed cap/tubes再进行一遍校正。保存结果。）

五．设置修订及数据备份

1．用记事本打开C:/Program Files/Bio-Rad/iQ5/Global Application 文件，将value=\"30\"改为value=\"999\"，保存文件，关闭。

2．打开C:/Program Files/Bio-Rad/iQ5, 将整个iQ5文件夹备份。在用户电脑做一备份，另外工程师请带U盘备份到自己电脑一份，文件名请标示清楚，例如：iQ5-洛阳CDC－（Optical系列号）。