产青霉素酶淋病奈瑟菌重复序列PCR分型研究

・２６６・・实验研究・产青霉素酶淋病奈瑟菌重复序列ＰＣＲ分型研究郭光辉，谭德明（中南大学湘雅医院，湖南长沙４１０００８）［摘要］目的研究某地区产青霉素酶淋病奈瑟菌（ｐｅｍｃ．１ｌｉｍｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ』、ｋｉｓ卵ｒ缸驴加，－施ｏ∞ｅ，ＰＰＮＧ）的基因型特征。方法利用重复序列引物建立重复序列聚合酶链反应（ＰＣＲ）分型方法，并用此方法对１２株ＰＰＮＧ进行基因分型。结果重复序列ＰＣＲ是一种简便、快速、可靠和分辨率高的基因分型方法，１２株ＰＰＮＧ共分为６种基因型，其中Ａ型６株（占５０％），Ｆ型２株，Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型各１株。结论该地区ＰＰＮＧ主要流行株基因型为Ａ型。通过重复序列ＰＣＲ分型研究，可了解ＰＰＮＧ的基因型流行特征，为调查和控制其传播途径及传染源提供分子流行病学依据。［关键词］淋病奈瑟菌；青霉素酶；基因型；分子流行病学；重复序列ＰＣＲ［中图分类号］Ｒ３７８．１＋６［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１—９６３８（２００８）０４一０２６６一０３Ｓｔｕｄｙｏｎｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｐｅｎｉｃｉ¨ｉｎａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＮＰＺｓｓＰ，ｆ口ｇＤ聆Ｄ，ｒ忍Ｄｅ口Ｐｂｙｒｅ甲卜ＰＣＲＧＵＯＧｊ版，ｚｇ－＾“ｉ，了’ＡＮＤ纠咒ｉ，ｚｇ’（Ｘ谊ｎｇ弦Ｈｏｓｐｉ比Ｚ，ＣＰ，ｚ￡ｒ口ＺＳｏ“胁Ｕ矗ｉ优珊ｉ砂，Ｃｋ砣ｇｓ施４１０００８。Ｃ『ｌｉ撇）［Ａｂｓｔｒ敞ｔ］ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｒｏｍａｎＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｐｅｍｃｉｌｌｉｍｓｅ＿ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＮｅ缸Ｐｒ缸ｇＤ加ｒ砌Ｄ∞Ｐ（ＰＰＮＧ）ｉｓｏｌａｔｅｄｔｈｅｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｒｅａ．Ｍｅｔｈｏ凼ｆ炒ｕｓｉｎｇｏｆｌ２ｓｔｒａｉｎｓｏｆＰＰＮＧｂａｓｅｄａｐｒｉｍｅｒ（ｒｅｐ），ｒｅｐ－ＰＣＲ啪ｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｏａＩｌａｌ）呓ｅｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓＲ咖ｌｔｓＲｅｐ＿Ｐ（二Ｒｉｓｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｒｅｌｉａｂｌｅｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄ诵ｔｈｈｉｇｈｄｉｓ—ｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅｔｙｐｅｓ，６ａｂｉｌｉｔｙ．～ｌｏｆ１２ｓｔｒａｉｌｌｓｏｆＰＰＮＧｐｍｄｕｃｅｄｒｅｐ－ＰＣＲｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ，ｗｈｉｃｈ、张ｒｅｃｌａＳｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ６ｇｅｎｏ—ａｒＩｄ１、Ｖａｓｔ帅ｅＢ，Ｃ，ＤａｎｄＥｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃ叫Ｉｃｌ璐ｉ叽ｃａｎｓｔｒａｉｎｓ（５０％）ｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｙｐｅＡ，２、＾他ｒｅｔｙｐｅＦＲｅｐ－ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅＰＰＮＧｒｅｖｅａｌｅｄｔｈｅｍａｉｎｇｅｎｏｔｙｐｅｏｆＰＰＮＧｅｐｉｄｅｆｎｉｃｓｔｒａｉｎｓｉｎｔｈｅａｒ朗、张ｓｔｙｐｅＡ，锄ｄｎｌｉｓｓｔｕｄｙｒｏｕｔｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏ“ｈｅｔｒａ舾ｒ１１ｉｓｓｉｏｎａ１１ｄＳｏｕｒｃｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏＩＬ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｎ矗强叮妇毋ｍ０，而俄珊；耐ｃｍｉｍｓｅ；ｇｅｎｏｔｙｐｅ；ｒｍｌｅｃｕｌａｒ印ｉｄｅｍ｜ｏｌｏｇｙ；州ｉｔｉ、它ｓｅｑｕｅｎ盼ｂａ时Ｈ讯［ＣｈｉｎＩｎｆｅｃｔＣｏｎｔｒｏｌ，２（）（）８，７（４）：２６６—２６７，２４１］淋病是由淋病奈瑟菌（Ｎ西ｓｓＰ，．缸ｇｏ加，．砌ｏ∞Ｐ）引起的泌尿生殖系统化脓性感染，是最常见的危害性较大的性传播疾病之一。近年来，由于抗菌药物的广泛应用甚至滥用，导致淋病奈瑟菌耐药性不断增加，而耐药菌株的日益流行，给治疗带来了很大困难并且加速了淋病的传播。淋病奈瑟菌对青霉素的耐药性可分为染色体介导和质粒介导，质粒介导的产青霉素酶淋病奈瑟菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＮｄｓｓ已ｒ妇ｇｏ加ｒ砌Ｄ∞Ｐ，ＰＰＮＧ）表现对青霉素高度耐药。自１９７６年首次报道质粒介导的ＰＰＮＧ以［收稿日期］２０（）８一０４—２２来，其已广泛流行于世界各地，现在发现ＰＰＮＧ常同时对其他多种抗菌药物如四环素、阿奇霉素、喹诺酮类药物等耐药‘卜２｜。细菌分型可监视细菌的流行特点，追溯传染源，了解其传播机制，并对控制耐药菌株的播散有重要意义。ｌ材料与方法１．１材料１．１．１菌株来源１２株ＰＰＮＧ均分离自中南大学［作者简介］郭光辉（１９７３一），男（汉族）．湖南省邵东县人，副主任技师，主要从事临床微生物学研究．［通讯作者］郭光辉Ｅ－ｎ诅ｉｌ：ｇｕａｎｇｈｕｉｇｕ０２（）（Ｊ８＠ｙａｈｏｏ．ｏａｆｒＬｃｎ　湘雅医院２００７年１—６月门诊就诊淋病患者的泌尿生殖道分泌物标本。经革兰染色、糖发酵、菌落形态及氧化酶试验鉴定为淋病奈瑟菌，经碘量法确定为产ｐ内酰胺酶菌株（ＰＰＮＧ），用脱脂牛奶保存于一８０℃冰箱备用。１．１．２主要试剂引物参照文献［３］合成，引物１：５’一ＩＩＩＮＣＧＮＣＧＮＣＡＴＣＮＧＧＣ一３’；引物２：５７一ＮＣＧＮＣＴＴＡＴＣＮＧＧＣＣＴＡＣ一３７（Ｎ：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ任一均可；Ｉ：次黄嘌呤），由上海生工生物工程技术有限公司合成。ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ和１２３ｂｐ的ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。１．１．３主要仪器生物安全柜（香港热力发展有限公司）、ＤＮＡ扩增仪（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）、ＤＹＹ一Ⅲ５型稳压稳流电泳仪和水平电泳槽（北京六一仪器厂）、ＵＶ＿紫外分析仪（珠海黑马医学仪器有限公司）、凝胶成像系统（上海天能公司）。１．２方法１．２．１模板ＤＮＡ的制备无菌操作下，用接种环挑取少量菌落悬于３００肛Ｌ灭菌双蒸水中，煮沸１５ｍｉｎ，冷却，１２ｏｏｏｇ离心２ｍｉｎ，取上清液作为模板。１．２．２重复序列聚合酶链反应（ＰＣＲ）体系总体积２５弘Ｌ，包括１０×ＰＣＲ缓冲液２．５肛Ｌ、５弘ｍｏｌ／Ｌ弓Ｉ物２肛Ｌ、５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１弘Ｌ、Ｔａｑ酶１Ｕ、模板２肛Ｌ、双蒸水１７．５弘Ｌ。１．２．３扩增条件９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，４５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２Ｔｎｊｎ，共３５个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ，结束反应。１．２．４重复序列ＰＣＲ产物检测取ＰＣＲ产物５ｆｌＬ，在琼脂糖凝胶（ＥＢ浓度为ｏ．５嵋／ｍＬ）中水平电泳，电泳液为１×ＴＡＥ缓冲液，电压５Ｖ／锄，以ＤＮＡＭａｒｋｅｒ作对照，电泳６０ｍｉｎ后于紫外透射仪下观察，凝胶成像系统成像后保存电泳图像。２结果应用重复序列ＰＣＲ对ＰＰＮＧ进行基因分型，结果判断依据电泳条带分析。电泳图谱见图１，扩增片段显示９～１２条，大小约１０（）～２５００ｂｐ。根据条带数目和位置完全相同为同一基因型的分型方法，将１２株ＰＰＮＧ分为６个基因型，其中Ａ型６株，Ｆ型２株，Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型各１株。　・２６７・Ｍ为１２３ｂｐ的ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１、２、３、１０、１１和１２同为基因型Ａ；８和９同为基因型Ｆ；４、５、６和７分别为基因型Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅ图１１２株ＰＰＮＧ重复序列ＰｃＲ电泳图谱Ｆｉ毋肿ｌＲｅｐ－ＰＣＲｅｌｅｃｔｍｐｈｏｒｅｓｉｓｒＩｌａｐｏｆ１２ｓｔｒａｉｎｏｆｐｅＩｌｉ—ｃｉｌｌｉｎａｓＰｐｒｏｄｕｃｉｎｇＭｉｓ５ｅｒ缸ｇ嗍ｒ纠∞ｅａｅ３讨论淋病奈瑟菌分型方法有传统的营养分型法和血清分型法，它们有固有的缺点，如分型能力不够、重复性低和操作复杂、费时等。分子生物学技术为细菌的基因分型提供了有效手段，目前主要有脉冲场凝胶电泳分型（ＰＦＧＥ）、随机扩增多肽性ＲＮＡ（ＲＡＰＤ）、核糖体基因分型、扩增片段长度多肽性分析和重复序列ＰＣＲ分型等，其中ＰＦＧＥ和ＲＡＰＤ技术应用较多。ＰＦＧＥ可靠、重复性好，分辨率高，但此方法需昂贵设备和试剂且费时；融奸Ｄ虽简便、快速，但由于其所用引物短，重复性不理想；而本研究应用重复序列ＰＣＲ分型法对ＰＰＮＧ进行基因分型，简便、快速、可靠且分辨率高。近年研究发现，原核生物基因中广泛存在一些重复ＤＮＡ序列，主要有重复基因外回纹序列（ＲＥＰ）、肠杆菌重复基因间基准序列（ＥＲＩＣ）以及在肺炎球菌基因组发现的ＢＯＸ重复序列，这些序列功能尚不清楚［３］。以这些序列互补序列为引物，扩增细菌基因组得到不同的ＤＮＡ片段，可用于细菌的鉴别和分类，这种ＰＣＲ技术称为重复序列ＰＣＲ。该技术自被报道以来，即被广泛应用于各类细菌的基因分型，如肠杆菌科细菌、非发酵菌、革兰阳性球菌及螺杆菌等。夏云等［４］应用此项技术调查肺科鲍曼不动杆菌的暴发流行，２４名患者共分离２８（下转第２４１页）・２４１・ＨＢＳＡｇ与ＨＢＶＤＮＡ的分泌。已证实上皮细胞内流感病毒特异的ＩｇＡ抗体能有效抑制流感病毒的复制［¨］。在我们的研究中，０．１～５．０ＩＵ／ｍＬＨＢＩＧ的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞培养上清中ＨＢｓＡｇ与ＨＢＶ［４］ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉ九１ｓｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇ∞ａＩｌｄ讲ｒｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊｖｉｒｏｌ，２００３，７７（１６）：８８８２—８８９２．ＫｏｂａｙａｓＫｔｍｎｓｃ”ｏｓｉｓＮ，ｓｕｚｕｌ‘ｉＹ，ＴｓｕｇｅＴ，以“．ＦｃＲｎ—ｍｅｄｉａｔ。ｄｏ“舢ｕｎＯｇｌｏｂｕｌｉｎＧｉｎｈＩＩｍ饥ｒｅｒｌａｌｐｒ０，ｄｍ“ｔｕ—ｂｕｌａｒ印ｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＲｅｍｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００２，２８２（２）：Ｆ３５８一Ｆ３６５．ＤＮＡ分泌减少，其可能的原因是肝细胞内吞［５］的抗ＨＢｓ减少ＨＢＶ的分泌或干扰包含ＨＢＶＤＮＡ核衣壳的包封［３］，但细胞内ＨＢｖＤＮＡ是否减少有待继续研究。体外实验具有稳定性、均一性，并具有更好的可重复性。但体外培养的细胞与体内生长的细胞存在差异，同时药物作用于机体是一个非常复杂的过程，多有免疫反应参与，体外实验难以模拟。本研究表明，ＨＢＩＧ在体外实验具有抑制ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ待进一步研究。［参考文献］ｓ，ＭｃＭａｈｏＩｌＢＪ．ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．ＨｅｐａｔｏＩｏｇｙ，ＤＮＡｓｅｌｌｓＭＡ，ｃｈ∞ＭＬ，ＡｃｓＧ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｎｌｓｐａ州ｃｌ姻ｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｔｒａＪｌｓｆｅｃｔｅｄ谢ｔｈｃｌｏｎｅｄｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉ—九ｌｓＤＮＡ口］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄｓｃｉｕｓＡ，１９８７，８４（４）：１００５—１００９．［６］彭忠田，申璀，谭德明，等．脱氧野尻霉索衍生物抗乙型肝炎病毒的体外实验研究口］．中国药房．２００７，１８（１）：２２—２４．［７］ＪｉａＦ，ｚｌｌａｎｇＹｚ，ＬｉｕｃＭｉｎｔｅｒｆｅｒ朗ｃｅｂａｓｅｄｓｔａｂｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉ—ｍｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｆｌｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＨｅｐＧ２．２．１５ｃｅｌｌｓｂｙＲＮＡｏｎｒｅｔｒｏ“ｎｌｓｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ］．ＪＢｉｏｔｅｃｈＩｌｏｌ，分泌的作用，但是否能抑制体内ＨＢｖ的复制还有２００７，１２８（１）：３２—４０．［８］ＨａｙａｓｈｉＹ，Ｋｏｉｋｅ∞ｔｉｏｎｉｎａＫＩｎｔｅｒｆｅｍｎｉｎｈｉｂｉｔｓｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ访ｎｌｓｒ印＊ｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｔｍｓｆｅｃｔｅｄｖｉｒａｌＤＮＡ［Ｊ］．Ｊｖｉｒｏｌ，１９８９，６３（７）：２９３６—２９４０．［９］杨永峰。谭德明，谢玉桃．等．干扰素ａ抗乙型肝炎病毒作用的体外实验研究［Ｊ］．中国医师杂志，２００４，６（５）：６４４—６４６．［１］Ｌ０ｋＡ［１０］曹鸿鹏，陶佩珍．拉米夫定等六种药物的体外抗乙型肝炎病毒作用［Ｊ］．中华医学杂志，２００１，８１（１６）：１（Ｊ０４—１００７．２００７，４５（２）：５０７—５３８．［２］刘映霞．乙型肝炎病毒耐药及其防治［Ｊ］．中国感染控制杂志，２００７．６（５）：２８９—２９１．［１１］Ｍ啦耻ｃＭＰｒｏｃＢ，Ｋａｅｔ勰ｌｃｓ，ＩａｍｍｖｉｒＩｌｓＭＥ，“４ｚ．Ｉｎｔ珀ｃｅｌｌｕｌａｒｎ即ｔｍｌｉ琵ｔｉ∞ｏｆｂｙｉＩｌｌ吼ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉＩｌＡ柚ｔｉｂｏｌｄｉｅｓ［Ｊ］．［３］ＳｃＫｌｌｉＩｌｇＢＲ，Ｉｊａｚｓ，眈“ｄｏｆｆＭ，“口ｆ．ＥｒＩｄｏｃｙｔｏｓｉｓ０ｆｈｅｐａｔｉｔｉｓｉｌｌｔｏＮａｔｌ趾ａｄＳｄＵＳＡ，１９９２，８９：６９０１—６９０６．ｉ皿ｍｕｎｅｇｌｄｂｕｌｉｎｈｅｐａｔｏｃ”ｅｓｉＩｌｌｌｉｂｉｔｓｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉ∞ｏｆ（上接第２６７页）株鲍曼不动杆菌，２８株菌按耐药谱分为３种型别，基因分型可分为６种型别，其中优势菌株Ａ型因在重症监护室（ＩＣＵ）内交叉感染，引起暴发流行。刘瑛等［５］应用细菌重复ＰＣＲ指纹图谱法对ＩＣＵ内患者痰标本和环境中分离的铜绿假单胞菌进行同源性分析，以调查铜绿假单胞菌暴发流行的原因。本研究采用以ＲＥＰ为引物的重复序列ＰＣＲ技术对ＰＰＮＧ进行基因分型，以了解ＰＰＮＧ分子流行病学特点。细菌ＤＮＡ模板的提取，我们采用直接煮沸裂解法，简单、快速，文献报道［３］常用的退火温度为４０℃，我们将退火温度提高至４５℃，其重复性更好；每份标本重复２次，都获得相同ＤＮＡ指纹。１２株ＰＰＮＧ有６种不同的重复序列ＰＣＲ基因型，其中Ａ型菌株占５０％，是本地区的主要流行株。这些结果表明重复序列ＰＣＲ是一种简便、快速、可靠和分辨率较高的基因分型方法，尤其适合淋病奈瑟菌营养型／血清型的亚分型和对耐药菌株的进一步分型。［参考文献］［１］Ｍ，ＧｕｗＭ，以“．ＡｎｔｉｌＩｌｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＹａＩｌｇＹ，ＬｉａｏａｎｄｍｏｌｅｃＩｌｉａｒｄｅｔｅｍｉｎａｎｔｓｏｆ－ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｉｓｏｌａｔ髂ｆｒｏＩｎｒｅｓｉｓｔａｒｌｃｅｉＩｌ＾ｋｉ５妒ｒ缸ｇ伽ｒｍＤ犯Ｆｓｈａｎｇｈａｉ［Ｊ］．ＪＡＪｌｔｉｒＩｌｉｃｒｏｂｃｈｅ—ｍｏｔｈｅｒ，２（）（Ｊ６，５８（４）：８６８—８７２．［２］顾伟鸣。杨阳，吴磊，等．１９８８—２００２年上海分离的淋病奈瑟菌对抗菌药的敏感性监测口］．中华皮肤科杂志，２【Ｊ【１４，３７（６）：３２３—３２５．［３］Ｖｅｒ豫ＩｏｖｉｃＪ，Ｋ∞ｕｔｈＴ，Ｌｕｐｓｌ【ｉＪＲＤｉｓｔ曲ｕｔｉｏｎｏｆｒｅｐｅｔｉｖｅＤＮＡｓｅｑｕ叽ｃｅｈｅｕｂａｃｔｅｒｉａａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｆｉｒ培ｅｒｐｄｎｔｉＴｌｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｒｎｅｓ［Ｊ］．ＮｕｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，１９９１，１９（２４）：６８２３—６８３１．［４］夏云，张玉洪，曹何．等．应用重复Ｐ（’Ｒ指纹技术调查肺科鲍曼不动杆菌的暴发流行口］．陕西医学检验，２【Ｊ００，１５（１）：１６—１７．［５］刘瑛，陈峰，沈立松，等．重复序列引物聚合酶链反应在医院感染流行病学调查中的应用［Ｊ］．中华检验医学杂志，２（）０５．２８（６）：６２５—６２６．