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·麻醉并发症·
在体心脏缺血预处理和缺氧预处理对犬的
心肌保护效果：双体外循环环路法
８３００５４ 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院麻醉科通信作者：郑宏，Ｅｍａｉｌ：ｘｊｚｈｅｎｇｈｏｎｇ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０∕ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４⁃１４１６．２０１６．０９．００３
【摘要】 目的 评价经双体外循环环路实施在体心脏缺血预处理（ＩＰＣ）和缺氧预处理（ＨＰＣ）对犬的心肌保护效果。方法 健康雄性犬１８只，体重１７．５～２４．５ｋｇ，１３～２４月龄，采用随机数字表法分为３组（ｎ＝６）：心肌缺血再灌注组（Ｉ∕Ｒ组）、ＩＰＣ组和ＨＰＣ组。建立双体外循环环路：体循环和冠脉循环，实施独立的体循环与冠脉循环。ＩＰＣ组阻断主动脉，冠脉循环泵停止运转５ｍｉｎ，随后开启冠脉循环泵５ｍｉｎ，重复３次。ＨＰＣ组阻断主动脉，开启冠脉循环，从氧合器吹入纯氮气５ｍｉｎ，随后吹入氧气５ｍｉｎ，重复３次。ＩＰＣ或ＨＰＣ完成后即刻进行体外循环１ｈ。于开胸前（Ｔ１）、双体外循环环Ｔ４，５时采集右侧颈内静脉血标本，测定血清ｃＴｎＩ浓度，Ｔ５时上述指标测定或取材结束后处死动物，取心肌组织，观察心肌超微结构，确定心肌细胞凋亡指数（ＡＩ）。于主动脉阻断前、主动脉开放前即刻和主动脉开放３０ｍｉｎ时取心肌组织，测定心肌细胞ＡＴＰ含量。结果 与Ｉ∕Ｒ组比较，ＩＰＣ组和ＨＰＣ组Ｔ４，５时ＬＶＥＳＰ升高，血清ｃＴｎＩ浓度降低，主动脉开放即刻和开放３０ｍｉｎ时心肌ＡＴＰ含量升高，ＡＩ降低（Ｐ＜０．０５或００１），心肌病理学损伤减轻。与ＩＰＣ组比较，ＨＰＣ组心肌ＡＴＰ含量升高（Ｐ＜０．０５），心肌病理学损伤减轻。结论 经双体外循环环路实施在体ＨＰＣ和ＩＰＣ均可对犬产生心肌保护效果，ＨＰＣ的心肌保护效果优于ＩＰＣ。
【关键词】 缺血预处理，心肌； 缺氧； 心肌再灌注损伤基金项目：国家自然科学基金重点项目（Ｕ１４０３２２３）
Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇａｎｄｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｉｎｉｎｖｉｖｏｈｅａｒｔｓｏｆｄｏｇｓ：ｕｓｉｎｇｄｏｕｂｌｅＣＰＢｃｉｒｃｕｉｔｓ ＣｈｅｎＣｈｕｎｌｉｎｇ，ＸｕａｎＹａｎ，ＸｕＷｅｉｆａｎｇ，ＭａＨａｉｐｉｎｇ，ＹｕＪｉｎ，ＺｈｅｎｇＨｏｎｇ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ８３００５４，Ｃｈｉｎａ（ＣｈｅｎＣＬ，ＸｕａｎＹ，ＸｕＷＦ，ＭａＨＰ，ＹｕＪ，ＺｈｅｎｇＨ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺｈｅｎｇＨｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｘｊｚｈｅｎｇｈｏｎｇ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ
Ｅｉｇｈｔｅｅｎｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅｄｏｇｓ，ｗｅｉｇｈｉｎｇ１７５－
路建立后（Ｔ２）、预处理结束时（Ｔ３）、心脏复跳后６０ｍｉｎ（Ｔ４）和１２０ｍｉｎ（Ｔ５）时记录ＨＲ、ＭＡＰ、ＣＶＰ、左室收缩末压（ＬＶＥＳＰ）、左室舒张末压（ＬＶＥＤＰ）及左室压力上升∕下降最大速率（±ｄｐ∕ｄｔｍａｘ）。于Ｔ１、
陈春玲 宣燕 徐维昉 马海平 俞瑾 郑宏
（ＩＰＣ）ａｎｄｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＨＰＣ）ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｄｏｕｂｌｅｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｂｙｐａｓｓ（ＣＰＢ）ｃｉｒｃｕｉｔｓｉｎｉｎｖｉｖｏｈｅａｒｔｓｏｆｄｏｇｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅｍｉａ⁃ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＩ∕Ｒ），ＩＰＣｇｒｏｕｐａｎｄＨＰＣｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｄｏｕｂｌｅＣＰＢｃｉｒｃｕｉｔｓｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｄｃｏｒｏｎａｒｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｄｃｏｒｏｎａｒｙｃｉｒ⁃ｃｕｌａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．ＩｎｇｒｏｕｐＩＰＣ，ｔｈｅａｏｒｔａｗａｓｃｌａｍｐｅｄ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｏｎａｒｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｐｕｍｐｗａｓｓｕｓ⁃ｐｅｎｄｅｄｆｏｒ５ｍｉｎｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙ５ｍｉｎｏｐｅｎｉｎｇ，ｒｅｐｅａｔｉｎｇｆｏｒ３ｃｙｃｌｅｓ．ＩｎｇｒｏｕｐＨＰＣ，ｔｈｅａｏｒｔａｗａｓ５ｍｉｎｏｆｏｘｙｇｅｎｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ，ｒｅｐｅａｔｉｎｇｆｏｒ３ｃｙｃｌｅｓ．ＣＰＢｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｏｒ１ｈｓｔａｒｔｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｔｉｍｅｐｏｉｎｔｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒＩＰＣｏｒＨＰＣ．Ｂｅｆｏｒｅｓｐｌｉｔｔｉｎｇｏｆｓｔｅｒｎｕｍ（Ｔ１），ａｆｔｅｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｄｏｕｂｌｅＣＰＢｃｉｒｃｕｉｔｓ２４５ｋｇ，ａｇｅｄ１３－２４ｍｏｎｔｈｓ，ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝６ｅａｃｈ）ｕｓｉｎｇａｒａｎｄｏｍｎｕｍｂｅｒｔａｂｌｅ：ｍｙ⁃
ｃｌａｍｐｅｄ，ｔｈｅｃｏｒｏｎａｒｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｗａｓｓｔａｒｔｅｄ，ａｎｄｐｕｒｅｎｉｔｒｏｇｅｎｗａｓｉｎｓｕｆｆｌａｔｅｄｆｏｒ５ｍｉｎｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙ
万方数据（Ｔ２），ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（Ｔ３），ａｎｄａｔ６０ａｎｄ１２０ｍｉｎａｆｔｅｒｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｈｅａｒｔ
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ｂｅａｔ（Ｔ４，５），ｈｅａｔｒａｔｅ，ｍｅａｎａｒｔｅｒｉａｌｐｒｅｓｓｕｒｅ，ｃｅｎｔｒａｌｖｅｎｏｕｓｐｒｅｓｓｕｒｅ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ⁃ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓ⁃
ｓｕｒｅ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ⁃ｄｉａｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅａｎｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｒａｔｅｏｆｉｎｃｒｅａｓｅ∕ｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄ．ＢｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｉｇｈｔｉｎｔｅｒｎａｌｊｕｇｕｌａｒｖｅｉｎａｔＴ１ａｎｄＴ４，５ｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍｃａｒｄｉａｃｔｒｏｐｏｎｉｎＩｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅａｎｉｍａｌｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄａｆｔｅｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｒａｍｅｔｅｒｏｒａｆｔｅｒｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｉｎｇａｔＴ５，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｕｌ⁃ｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ａｏｒｔｉｃｃｌａｍｐｉｎｇ，ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒａｏｒｔｉｃｕｎｃｌａｍｐｉｎｇａｎｄａｔ３０ｍｉｎａｆｔｅｒａｏｒｔｉｃｕｎｃｌａｍｐｉｎｇ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌＩｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｔＴ４，５，ｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎ⁃ｃｒｅａｓｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒａｏｒｔｉｃｕｎｃｌａｍｐｉｎｇａｎｄａｔ３０ｍｉｎａｆｔｅｒａｏｒｔｉｃｕｎｃｌａｍｐｉｎｇ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘｗａｓｓｉｇ⁃（Ｐ＜００５），ａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｉｎｇｒｏｕｐＨＰＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｔｈａｎＩＰＣｉｎｉｎｖｉｖｏｈｅａｒｔｓｏｆｄｏｇｓ．
ｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＢｅｆｏｒｅＩ∕Ｒｇｒｏｕｐ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ⁃ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍｃａｒｄｉａｃｔｒｏｐｏｎｉｎｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００５ｏｒ００１），ａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｔｔｅｎｕａｔｅｄｉｎＩＰＣａｎｄＨＰＣｇｒｏｕｐｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＩＰＣ，ｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄＩＰＣｃａｎｅｘｅｒｔｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｗｈｅｎｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｄｏｕｂｌｅＣＰＢｃｉｒｃｕｉｔｓ，ａｎｄＨＰＣｐｒｏｖｉｄｅｓｂｅｔｔｅｒ
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ； Ａｎｏｘｉａ； ＭｙｏｃａｒｄｉａｌｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｕ１４０３２２３）
ＢｏｔｈＨＰＣａｎｄＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ
缺血预处理（ＩＰＣ）和缺氧预处理（ＨＰＣ）的心肌保护效果已得到证实［１⁃８］。而这些研究均为细胞实验或离体心脏灌注实验，并不能反映在体实际心肌状动脉造成血管内皮损伤、斑块破裂及可能的血栓脱落问题，或者ＩＰＣ和ＨＰＣ均为全身性预处理，临床可操作性较差。本课题组自主研发的双体外循环模型：独立的体循环和冠脉循环，通过选择性冠脉循环灌注，可实施不涉及体循环的在体心脏缺血或缺氧，避免上述问题。因此本研究通过建立双体外循环环路，评价该方法实施在体心脏ＩＰＣ和ＨＰＣ的心肌保护效果。
材料与方法
动物选择及分组 本研究遵守动物手术研究指南，已获本院动物实验伦理审查委员会批准，实验结束后通过静脉注射大剂量１０％氯化钾处死动物。健康雄性犬１８只，体重１７．５～２４．５ｋｇ，１３～２４月龄，购自新疆医科大学第一附属医院动物实验中心。采用随机数字表法分为３组（ｎ＝６）：心肌缺血再灌注组（Ｉ∕Ｒ组）、ＩＰＣ组和ＨＰＣ组。
体循环的建立 肌肉注射氯胺酮１００ｍｇ后固定于实验台，静脉注射咪达唑仑０．１ｍｇ∕ｋｇ、维库溴铵０．１５ｍｇ∕ｋｇ、芬太尼１０μｇ∕ｋｇ麻醉诱导，气管插管成功后采用Ｓ∕５Ａｅｓｐｉｒｅ７１００型麻醉机（Ｏｈｍｅｄａ公司，美国）行机械通气，潮气量根据血气分析结果进行调整。万方数据股动脉置管监测ＭＡＰ及采集血标本，进行
血气分析，维持ｐＨ值７．３５～７．４５，ＰａＯ２＞１００ｍｍＨｇ
（１ｍｍＨｇ＝０．１３３ｋＰａ），ＰａＣＯ２３５～４５ｍｍＨｇ。颈内静脉置管监测ＣＶＰ和输液。正中开胸后静脉注射肝素３ｍｇ∕ｋｇ进行全身抗凝。主动脉根部插入１４Ｆ小儿动脉导管，上腔静脉插入２０Ｆ静脉导管，下腔静脉插入２４Ｆ静脉导管。采用ＳｔｏｃｋｅｒｔＳ２滚压泵管道。上下腔静脉导管与储血器⁃滚压泵⁃膜式氧合膜式氧合器和管道预充液为羟乙基淀粉１３０∕０４氯化钠注射液３００ｍｌ、复方氯化钠溶液２５０ｍｌ、同种异体血液２５０ｍｌ。建立体外循环后，于左室心尖部放置压力传感器探针，采用ＭＬ８７０ＰｏｗｅｒＬａｂ生物信号采集系统（ＡＤ公司，澳大利亚）监测血流动力学和心功能指标。
冠脉循环的建立 冠脉循环由一套独立的氧合器和管路系统构成。经体循环的储血器引流部分静脉血至冠脉循环氧合器，于主动脉根部将标准儿童停搏液灌注管（天津塑料研究所有限公司）交替置入左右冠状动脉窦。由冠脉循环氧合器的储血器⁃滚压泵⁃体外循环管道⁃主动脉根部灌注管相连接，建立体外循环的冠脉循环部分。冠脉循环氧合器独立充入氧气或氮气进行全心ＨＰＣ；或通过冠脉循环泵启动或停止运转进行ＩＰＣ。
ＩＰＣ和ＨＰＣ的实施方法 Ｉ∕Ｒ组麻醉后开胸，（Ｓｏｒｉｎ公司，意大利）、膜式氧合器及非肝素涂层的器⁃动脉导管相连接，建立体外循环的体循环部分。
保护效果；即便为在体实验，ＩＰＣ也存在反复夹闭冠
建立双体外循环环路，不实施任何预处理，３０ｍｉｎ
后制备体外循环模型；ＩＰＣ组建立双体外循环环路，
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５ｍｉｎ，以实现心肌缺血，随后开启冠脉循环泵
使用阻断钳阻断主动脉，冠脉循环泵停止运转数÷总细胞数×１００％）。
统计学处理 采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结 果
ＭＡＰ、ＬＶＥＳＰ和±ｄｐ∕ｄｔ降低，Ｔ时ＣＶＰ和Ｔ时与Ｔ１时比较，Ｉ∕Ｒ组、ＩＰＣ组和ＨＰＣ组在Ｔ４，５时
５ｍｉｎ，恢复心肌血供，重复３次；ＨＰＣ组建立双体外从氧合器吹入纯氮气５ｍｉｎ，以实现心肌缺氧，随后吹入氧气５ｍｉｎ，重复３次。
体外循环模型的制备 ＩＰＣ或ＨＰＣ完成后即３０ｍｉｎ后再灌注停搏液５ｍｌ∕ｋｇ，体外循环１ｈ后松开主动脉阻断钳，复跳２ｈ。通过热交换水箱（Ｔｅｒｕ⁃循环环路，使用阻断钳阻断主动脉，开启冠脉循环，
刻间断顺灌４℃ＳＴ．ＴｈｏｍａｓⅡ晶体停搏液１０ｍｌ∕ｋｇ，
ｍｏ３６℃Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ心功能与血流动力学指标的监测，通过调节动脉流量维持公司，美国）ＭＡＰ维持体表温度５０～ ８０于开胸前
ｍｍＨｇ。
３２～（Ｔ（Ｔ１）、双体外循环环路建立后（Ｔ２录３ＨＲ、ＭＡＰ、ＣＶＰ、）、心脏复跳后６０左室收缩末压ｍｉｎ（Ｔ４）和）、预处理结束时（１２０ＬＶＥＳＰ）、ｍｉｎ（Ｔ５左室舒）时记张末压ｄｐ∕ｄｔ（ＬＶＥＤＰ）及左室压力上升∕下降最大速率（±心肌细胞ｍａｘ）。
ＡＴＰ含量的测定 于主动脉阻断前、
主动脉开放前即刻和主动脉开放３０ｍｉｎ时取心肌组织，约２．０～３．５ｇ，采用活检穿刺针采集右室前壁心肌组织，液氮冻存，采用化学发光法［ＡＴＰ荧光检测试剂盒（Ｓｉｇｍａ公司，美国）］测定胞内ＡＴＰ的水平。
血清ｃＴｎＩ浓度的测定 于Ｔｍｌ，３０００转∕ｍｉｎ１、Ｔ离心４，５时采集右侧
颈内静脉血标本３１０ｍｉｎ，离心半径为１５ｃｍ，收集血清，储存于－８０℃冰箱。采用ＥＬＩＳＡ法（试剂盒购自上海西塘生物有限公司）测定血清ｃＴｎＩ。检测结果采用Ｔａｌｏｒ公式进行校正。
心肌超微结构的观察 Ｔ材结束后，处死动物，取心尖部心肌组织５时上述指标测定或取
，２．５％戊二醛固定２ｈ后，切成约１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍ组织块，再次用戊二醛固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后将标本置入１％锇酸再固定２ｈ。不同浓度丙酮脱水，ＥＰＯＮ８１２环氧树脂包埋ＪＥＯＬ１２３０，行乙酸双氧铀⁃柠檬酸铅双染色，微结构。
电子显微镜（１００００倍）观察心肌细胞超采用心肌细胞凋亡指数的确定 取心室肌组织在福尔马ＴＵＮＥＬ林中司）。染色为褐色的细胞为法确定凋亡细胞固定２４ｈ，然（后试剂盒购自美国石蜡包埋、切片。采用ＴＵＮＥＬ阳性细胞Ｒｏｃｈｅ，即凋公亡细胞。随机选取５个４００倍视野，计数每１００个
细胞中的凋亡细胞数
万方数据，计算凋亡指数（ＡＩ，凋亡细胞ＬＶＥＤＰ时比较升高，Ｉ∕Ｒ组Ｔｍａｘ２～５４，５４，５时ＨＲ增快（Ｐ＜０．０１）；与Ｔ２ＩＰＣ组和，Ｉ∕ＲＨＰＣ组和组ＴＩＰＣ组组ＴＬＶＥＳＰ４，５时ＭＡＰ降低，Ｉ∕Ｒ组、４，５时和±ｄｐ∕ｄｔ组ＨＲ增快（Ｐ＜０．０１）；ｍａｘ降低，ＣＶＰ和ＬＶＥＤＰ升高，Ｉ∕Ｒ与Ｔ较，Ｉ∕Ｒ组、ＩＰＣ组和ＨＰＣ组Ｔ３时比４，５时ＣＶＰ和ＬＶＥＤＰ升高＋ｄｐ∕ｄｔ，－ｄｐ∕ｄｔｍａｘ和ＬＶＥＳＰ降低，Ｉ∕Ｒ组Ｔ４，５时ＭＡＰ和（Ｐ＜０．０１）。ｍａｘ降低与，ＩＰＣＩ∕Ｒ组比较组和ＨＰＣ，ＩＰＣ组组和Ｔ４时＋ＨＰＣｄｐ∕ｄｔ组ｍａｘＴ降低
ＬＶＥＳＰ（升高４，５时统计学意义Ｐ＞０．０５）。（（ＩＰＣＰ＜０．０５），Ｐ＞０．０５）。组和ＨＰＣ其余指标差异无统计学意义见表组上述各指标比较差异无１。
表１ 三组犬各时点血流动力学和心功能
指标的比较（ｎ＝６，ｘ±ｓ）
组别指标ＴＩ∕Ｒ５
ＩＰＣ组ＨＰＣ组ＨＲ（次∕ｍｉｎ）
１１３１
Ｔ２
组１１４±１５１１７１２７Ｔ３
Ｉ∕Ｒ组
１１５±１１５±１２１±１９１３９±Ｔ４
１６ａｂ９６±１３１１１１３±１５１５１１３±１７１３０±１４３±Ｔ１３ａｂａｂｃ
ＩＰＣ９７±±８９９１±９０±９±１０１１８６±１２４１６１２５７３±±１８７１２２±６９±１４１１ＨＰＣ组ＭＡＰ（ｍｍＨｇ）
７４±±９ａｂｃＩ∕Ｒ组
组９４±１１
７４６．２８９±±１．２８８２±１１ａ８５±８±１３７９±±１２ａｂ７ａ
ＩＰＣＨＰＣ组ＣＶＰ（ｍｍＨｇ）４．５组４．２±１．１６．８７．５１１７．０±±１．５ａ１．４ａ７．８±±１．１ａ０．８ａ９．５±１．９ａｂｃ１．９ａｂｃ
１０．３±７ａｂ８０９．７±１０ａ
９．３±±１．６ａｂｃ１．６ａｂｃＩ∕ＲＩＰＣ组
４．７±组ＬＶＥＳＰ（ｍｍＨｇ）
９９±１．２±１．６１００７
１０．０１００９５±±１８９７．５９３±１．４ａ５５±±２．１ａｂｃ９．８６４±±２．１ａｂｃ１００±１１±７ａｂｃ６８９ａｂｃｄ±８ａｂｃ７８１２ａｂｃｄＩ∕ＲＨＰＣ组
组９．０±９．１±１０１．３８．５９８±１３９５±９６±１０±６７８．７±１２．２６９±±１．７１０ａｂｃｄ
ａｂｃ１２．１８１±１２ａｂｃｄ
ＩＰＣＨＰＣ组
ＬＶＥＤＰ（ｍｍＨｇ）８．０组组＋ｄｐ∕ｄｔ９．３±±１．７１．３９．０±１．３±１．６８．２±１１．５８．５±１．５±１．５１．２
１２．６１２．８±１２．３±±１．３ａｂｃ２ａｂｃ１８９８±２８７１９９１±２．３ａｂｃ±１．７ａｂｃ
１２．０±１．８ａｂｃＩＰＣＩ∕Ｒ组
ｍａｘ（ｍｍＨｇ∕ｓ）１８６０±３６５２９２３１６６１５８ａｂｃ１１６３±１００ａｂｃ
ＨＰＣＩ∕Ｒ组组１－ｄｐ∕ｄｔｍａｘ（ｍｍＨｇ∕ｓ）１８６２１８６１±２９３±１６０±２６９１００３±３４５１７１０±±２５１３２４１２８９１６９１２７７±±３６１１７５５±３６２３０２±±２６０ａｂｃ１３０６３５１±１４７±１７９２３９１１２６１９１±１６０±２０１ａｂｃ１１２７ａｂｃ１４７７４８９±±２０５ａｂ１１１３ａｂＩＰＣ组
１６５４１２５１２９６±±１８１２００
１１９８±±１９３２０６６９６８５５±１３７ａｂｃＨＰＣ 组
注：与Ｔ６４８±±１３７ａｂｃ１４０ａｂｃ
８５５８９２±±１８２ａｂｃ１４１ａｂｃ
１时比较，ａＰ＜０．０１ 与Ｔ２时比较，ｂＰ＜０．０１ 与Ｔ３时比较，ｃＰ＜０．０１ 与Ｉ∕Ｒ组比较，ｄＰ＜０．０５
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排列紊乱或溶解，线粒体肿胀呈空泡化，未发现肌小节。ＩＰＣ组虽然核形不规则，但心肌细胞肿胀程度轻，肌浆网轻微肿胀。ＨＰＣ组心肌细胞轻微肿胀，接近正常。
Ｉ∕Ｒ组、ＩＰＣ组和ＨＰＣ组ＡＩ分别为（１８５±２３）％、
Ｉ∕Ｒ组心肌细胞表现为严重水肿，核不规则，肌丝
环后心功能降低，心肌病理学损伤明显，心肌酶学指标升高，表明体外循环诱发犬心肌缺血再灌注损伤模型制备成功。
本研究参照文献［７］的方法实施ＩＰＣ和ＨＰＣ。本实验结果表明，实施ＩＰＣ和ＨＰＣ后，犬心肌缺血再灌注早期心肌酶降低，心肌病理学损伤减轻，血流动力学和心功能指标得到改善，表明经双体外循环环路实施的在体ＨＰＣ和ＩＰＣ均可对犬产生心肌保护效果。Ｃａｉ等［１０］进行的在体ＨＰＣ（５个循环的缺（１３７±１８）％和（１００±１８）％。与Ｉ∕Ｒ组比较，ＩＰＣＡＩ降低（Ｐ＜０．０１）。
组和ＨＰＣ组ＡＩ降低（Ｐ＜０．０１）；与ＩＰＣ组比较，ＨＰＣ组
与Ｉ∕Ｒ组比较，ＩＰＣ组和ＨＰＣ组Ｔ４，５时血清ｃＴｎＩ
浓度降低ｃＴｎＩｃＴｎＩ浓度降低（Ｐ＜０．０５）；（Ｐ＜０与０５）；ＩＰＣ与组比较Ｔ，ＨＰＣ组Ｔ４，５时血清１时比较，３组Ｔ４，５表２浓度升高 三组犬各时点血清（Ｐ＜０．０５）。ｃＴｎＩ见表浓度的比较２。
时血清（ｎｇ∕ｍｌ，ｎ＝６，ｘ±ｓ）
组别ＴＩ∕Ｒ０．０４２１
６．０３２Ｔ±４
ＩＰＣ组组
０．０３３±０．０１４０．８４３ｃ
６．８７１±Ｔ５
０．９１８ｃ
ａｃ
ＨＰＣ 注组
０．０３４±０．０２１４．５７４±０．６５３ａｃ
：与Ｉ∕Ｒ组比较±０．０２３
，ａＰ＜０．０５ ３．８７１与ＩＰＣ±０．７７４ａｂｃ
５．３２８组比较，ｂＰ４．９２５±＜０．０５ ±０．８２７０．７５９ａｂｃ
与Ｔ＜０．０５
１时比较，ｃＰ与Ｉ∕Ｒ组比较，ＨＰＣ组和ＩＰＣ组主动脉开放即刻和开放３０ｍｉｎ时心肌ＡＴＰ含量升高（Ｐ＜０．０５）；与ＩＰＣ组比较，ＨＰＣ组开放即刻和开放３０ｍｉｎ时心肌Ｉ∕ＲＡＴＰＡＴＰ组和含量升高ＩＰＣ组主动脉开放即刻和（Ｐ＜０．０５）。与主动脉阻断前比较３０ｍｉｎ，含量降低含量降低（Ｐ＜０．０５）。，ＨＰＣ组主动脉开放即刻心肌时心肌见表３。
ＡＴＰ表３ 三组犬各时点心肌ＡＴＰ含量的比较（ｎｍｏｌ∕ｍｇ，ｎ＝６，ｘ±ｓ）
组别主动脉阻断前
主动脉开放即刻
主动脉开放３０ｍｉｎ
Ｉ∕ＲＩＰＣ组组
４１４１±８２４±４ｃ
４ａｃ
２６ａｃＨＰＣ４１±±９３
ａｂｃ
３２±±４ｂｃ４ 注组
２８±：与Ｉ∕Ｒ组比较，ａＰ＜０．０５ 与３０±ＩＰＣ５组比较，ｂＰ＜０．０５ ３５±６ａｂ
与主动脉阻断前比较，ｃ
Ｐ＜０．０５
讨 论
本研究建立的双体外循环环路实现了在体经冠状动脉对心肌进行ＩＰＣ和ＨＰＣ，具有较高的临床操作性。独立的体循环实施全身灌注，避免除心脏以外的其他重要脏器的缺血缺氧性损伤。而独立的冠脉循环ＨＰＣ，动脉痉挛或完全阻塞时的情况通过冠脉循环停泵实施，通过向冠脉循环氧合器吹入氮气ＩＰＣ，模拟临床上冠状，实现心脏［９］的方法建立体外循环模型，结果表明。本研究参照文献
万方数据，犬体外循
氧６ｍｉｎ⁃复氧６ｍｉｎ）研究表明，ＨＰＣ的心肌保护作用出现于再灌注２４ｈ后，因此没有早期心肌保护作用，这与本研究结果不一致。究其原因可能其研究实施的是全身缺氧，采用的是离体心脏灌注，本研究采用的是在体心脏ＨＰＣ，未对其他器官和组织产生影响。
ＡＴＰ本研究结果表明，ＨＰＣ组再灌注后心肌组织
轻，提示含量较ＨＰＣＩＰＣ对犬的心肌保护效果优于组明显升高，心肌病理学损伤减ＩＰＣ。而对大鼠离体心脏研究表明，ＨＰＣ和ＩＰＣ的心肌保护效果相似［７］冠状动脉虽然缺氧，与本研究结果不一致，但仍然存在血流。本研究中，可带走无氧代ＨＰＣ组谢所产生的各种酸性代谢产物，从而减轻了这些有害物质对冠状动脉及心肌的损害，ＩＰＣ组冠状动脉既缺血又缺氧，因而ＨＰＣ心肌保护效果优于ＩＰＣ组。
心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的主要机
制［１０⁃１２］心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡水平降低。本研究结果显示，实施ＨＰＣ和ＩＰＣ后，犬ＨＰＣ凋亡有关和ＩＰＣ，证实。Ｓｃｈｍｉｔｔ的心肌保护作用机制与抑制心肌细胞等［１３］研究表明，ＨＰＣ和ＩＰＣ均可降低急性心梗塞患者心肌再灌注后细胞凋亡，与本研究结果一致。
ＩＰＣ在体研究和临床转化提供了有效支持本研究建立的双体外循环环路为实施ＨＰＣ。目前和
本课题将进一步探讨基于双体外循环环路ＨＰＣ的缺氧时限和氧浓度选择尚无一致意见［１４⁃１５］ＨＰＣ的，
适宜方法。
ＩＰＣ综上所述，经双体外循环环路实施在体ＨＰＣ和
效果优于均可对犬产生心肌保护效果ＩＰＣ。
，ＨＰＣ的心肌保护参 考 文 献
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