颅脑损伤后大鼠海马能量代谢相关蛋白表达变化

张夔鸣 李克勤* 王 琦 庄仲伟 徐巳奕 钟春龙 马继强 陈一鸣 同济大学附属东方医院神经外科 200120 上海

摘要：目的 本研究应用差异蛋白质组学技术，研究颅脑损伤后大鼠海马与能量代谢相关蛋白质组差异表达变化情况。 方法 采用侧方液压冲击装置,建立大鼠中度脑损伤模型，分别取外伤组（n=3）与对照组（n=3）大鼠海马组织总蛋白，通过差异荧光双向凝胶电泳（DIGE）、分离蛋白，获得蛋白质分离图谱，经胶内酶切、抽提酶解肽段、 MALDI-TOF/TOF质谱分析差异的蛋白质点，鉴定差异蛋白。结果 通过DeCyder5.0 及BVA图象分析软件比较， 发现有6个参与糖类能量代谢相关的酶类蛋白点表达水平具有显著差异变化。结论 颅脑创伤后大鼠海马组织蛋白质表达谱存在差异，并初步鉴定出的脑损伤后与代谢及线粒体作用有关的差异表达，为深入研究颅脑创伤后神经细胞能量代谢变化在损伤后细胞凋亡及对多重细胞和分子水平的级联反应调控提供相关依据。

关键词： 颅脑损伤； 蛋白质组学；差异荧光双向凝胶电泳（DIGE）；能量代谢相关蛋白尽管原发性损伤可以在数秒内发生，但脑创伤后的影响则会持续数小时到数天并不断进展，研究表明继发性脑损伤决定创伤的预后。继发性脑损伤关键机制为:脑缺血，兴奋性毒性作用及脑能量代谢的耗竭;神经组织坏死级联反应;脑肿胀以及炎症反应 (3，4)，T B I后的早期脑缺血以及线粒体功能障碍，能量代谢的异常构成了继发性脑损伤发生及发展的主体及核心(5、6、7)。

1　材料与方法1.材料

雄性SD大鼠，体重280－300 g 随机分配于外伤组（n＝3）和假手术组（n＝3）。2.液压冲击中度颅脑损伤模型和标本采集采用液压冲击装置，打击大鼠致中度颅脑损伤。打击后即刻予呼吸机辅助通气，至自主呼吸完全恢复。该侧方液压冲击模型成熟、稳定，本实验继续沿用[10、11]。 3%戊巴比妥（100mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，头部固定于立体定向头架。矢状缝中线旁开3.5mm，冠状缝后1.5mm钻一骨孔，直径5mm，显露硬脑膜。置入并固定打击管，液压打击压力1.9-2.0 atm。假手术组在麻醉后同样行颅骨钻孔和埋管处理，但未遭受打击损伤。

2　结果

对15个蛋白质考染点进行质谱鉴定，共鉴定出15个蛋白质点，其数据库检索值具有统计学意义（P<0.05）。其中11个蛋白质点有PMF可信搜库结果及有TOF-TOF可信搜库结果。共鉴定出11个蛋白质，2个为同一种蛋白，实际差异蛋白数为11个。其中通过分析已经鉴定的蛋白质点，在脑创伤中参与能量及代谢反应相关的差异蛋白最为丰富，包括6种蛋白。本研究发现参与糖类能量代谢相关的酶类包括磷酸甘油酸变位酶1表达上调；甘油醛－3 －磷酸脱氢酶表达上调，3－磷酸甘油酸脱氢酶表达上调。与代谢及线粒体作用有关的酶类，包括脂酰辅酶A水解酶表达下调、延胡索酸酶表达下调，ATP 合成酶,α 亚基, 同工型1与同工型CRA_d表达下调。以及sirtuin 2沉默信息调节因子2表达下调。

3　讨论

原发性脑损伤的病理过程始于机械作用所致组织变形、撕裂和出血引起快速的损伤性肿胀和细胞坏死；脑挫伤损伤灰、白质区域的轴索，损伤神经末梢谷氨酸释放触发继发性分子损害；脑组织PH值降至神经毒性水平、细胞内钠离子和钙离子聚集，蛋白激酶过度激活。同时，血管与炎症反应导致颅内压升高，星形胶质细胞增生，活性氧自由基等病理生理过程导致继发性神经细胞死亡[12、13、14]。创伤性脑损伤后有其独特的分子机制，需要深入研究。阐明其分子机制及病理生理过程，对于颅脑创伤的诊断和治疗具有重要作用。

图1　A TBI组大鼠海马蛋白质2D考染图像，红色标记为TBI组表达量增加

的蛋白点图1　B 对照组大鼠海马蛋白质2D考染图像，红色标记为TBI组表达量下降

的蛋白点

图2　A为差异蛋白点823（经质谱鉴定为srtuin 2蛋白）在TBI组及假手术组相对表达丰度图，图2B为该差异蛋白点表达量的3D模拟图像，图2C为鉴定蛋白点的肽质量指纹图谱。TBI组中沉默信息调节因子2蛋白srtuin 2表达上调1.45倍，差异非常显著 (P＜0.05)。Figure.3 A: Relative abundance map of 823 points for the difference in protein ( srtuin 2 protein) in the TBI group and the sham group, B: 3-D simulated images of the protein spots. C: Peptide mass fingerprinting of the identified protein. silent information regulator 2 protein in TBI group expression increased 1.45 times, the

difference is significant (P <0.05).

表1　TBI与假手术大鼠海马差异表达蛋白质DeCyder软件图像分析结果

蛋白点编号 （Master No）

Mr（kD） (Data in gel)

pI

(Data in gel)

P值（T-test）

TBI组/假手术组 （Av. Ratio）

1.45 1.38 1.28 1.27 1.25 1.24 1.23 1.22 1.20-1.22-1.24-1.31-1.34-1.52-2.23823 35 7 0.015 721 40 4.5 0.013 1100 25 4.5 0.011 1291 22 5 0.025 276 66 6 0.034 935 40 6.5 0.044 271 66 6 0.024 1050 31 7 0.017 489 60 6.5 0.0023 1327 20 4.5 0.038 413 60 6 0.0038 492 60 8.5 0.038 798 40 7 0.044 575 45 7.5 0.0065 406 60 8 0.0017 TBI组/假手术组：TBI组中某一蛋白点蛋白含量与假手术组相应蛋白点蛋白含量的比值，其中“-”表示蛋白表达下调

湖南中医药大学学报　2018 年6 月第38 卷　S1　Journal of Hunan University of Chinese Medicine, June 2018, Vol.38·963·

表2　TBI与假手术大鼠海马能量及代谢相关差异表达蛋白的MALDI-TOF质谱鉴定结果

蛋白点编号NCBI数据库编号

9351050489492798575823

gi|62653546gi|114326546gi|13928850gi|149029483gi|6981462gi|227665gi|56605812

期望值0.000258.9e-140.000264.4e-101e-122e-070.0053

蛋白名称覆盖率(%)

预测蛋白：甘油醛－3－ 磷酸脱氢酶，PREDICTED: similar to glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase29磷酸甘油酸变旋酶1，phosphoglycerate mutase 1 553－磷酸甘油酸脱氢酶，3-phosphoglycerate dehydrogenase 16ATP 合成酶,α 亚基,同工型ATP synthase, alpha subunit, isoform 1, 35

isoform CRA_d28

脂酰辅酶A水解酶，acyl-CoA hydrolase18

延胡索酸酶，Fumarase20

沉默信息调节因子2同源物，srtuin 2(silent mating type information

regulation 2 homolog)等电点(pI）分子量（Mr）表达变化

8.44

6.676.288.247.169.146.67

36045289285725654632379365471339921

上调上调上调下调下调下调上调

期望值：错误鉴定的几率。覆盖率：已经鉴定的肽段序列占蛋白质总序列的百[3]杨树源，王晨。神经蛋白质组学-神经科学研究的新方向。中华神经外科分比。Mr 杂志2005, 21(7): 386-387.

[4]周铁成 秦庆 杨小云等. 中枢神经系统疾病患者脑脊液多种酶活性与其损伤

参考文献：程度. 中国临床康复. 2005, 9(17): 72-73

[1]王晨，张学敏，杨树源，等。急性重型脑外伤后脑蛋白表达变化的蛋白质组研究。中华神经外科杂志，2005, 21(6): 363-366.作者简介：张夔鸣 ，男，1973年生，博士，主治医师，同济大学附属东方医院，

[2]江基尧。蛋白质技术在神经系统疾病诊治中的价值及前景（专家论坛）。神经外科。zhangkuiming@163.com 中国现代神经疾病杂志，2005, 5: 289-291.通讯作者：李克勤，ldszz@163.com。