1. 供试微生物
革兰氏阳性细菌3种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 11562）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970）。
革兰氏阴性细菌5种：根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens ATCC 11158）、大肠杆菌（Escherchia coli ATCC 29425）、黄瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans ATCC 11921）、沙门氏寒菌（Salmoneua typhimurium ATCC 14028）；番茄疮痂病菌（Xanthomonas vesicatoria ATCC 11633）。
供试真菌2种： 稻瘟病菌 （Magnaporthe oryzae strain P131）、白色念珠菌（Candida albicans ATCC 10321）。
2. 生长培养基
2.1 LB琼脂培养基（Luria-Bertani agar medium）用于单体化合物抗细菌活性测定，配方为：氯化钠5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，琼脂20g，加去离子水定容至1000 mL，其中LB液体培养基不加琼脂。
2.2 马铃薯葡萄糖液体培养基（Potato dextrose broth, PDB）用于抗白色念珠菌活性测定。配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加去离子水定容至1000 mL。
2.3 燕麦西红柿培养基（Oat-tomato agar medium, OTA）用于稻瘟菌培养和产孢。配方为：燕麦30g，西红丝汁150mL，琼脂20g，加水定容至1000 mL。
3 多孔板-MTT显色法 （主要用于供试细菌和白色念珠菌的活性测定）
3.1 MTT反应原理
MTT，又名噻唑蓝，[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]，采用MTT比色分析法可间接反映细胞的增殖和活力水平。基本原理是活细胞体内的线粒体脱氢酶能够将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的化合物Formazane，该化合物可溶于酸性异丙醇、二甲基亚砜（DMSO）等有机溶剂中，通过多孔板分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光值。生成Formazane的量与反应的活细胞数量成正比，而死亡的细胞不能将MTT转化以至没有颜色变化或颜色变化较小，因此吸光值的大小可以反映活细胞的数量和活性程度，间接反映化合物对供试菌细胞活力的抑制作用（边兴艳等，1998）。 3.2 MTT溶液的配制
准确称取MTT黄色粉末250mg，加入50 mL pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸缓冲液，超声振荡混匀后，放置在4℃冰箱待用。
3.3 测试样品母液的配制
分别称取4 mg化合物溶于1.0 mL DMSO或无水乙醇或丙酮（30%=300+700）中，配成4mg/mL的母液，然后用30％DMSO或30%乙醇或30%丙酮将化合物稀释，浓度范围在31. 25 µg/mL到4000 µg/mL不等（初始浓度：4000，2000，1500，1000，500，250，125，62.5，31. 25 ug/mL），（终浓度：400，200，150，100，50，25，12.5，6.25，3.125 ug/mL）。
用于细菌活性测定的阳性对照为硫酸链霉素，配方如下：称取2 mg硫酸链霉素溶于1.0 mL乙醇（30%=300+700）中，配成2mg/mL的母液，然后用30％乙醇稀释，浓度范围在15.625µg/mL到2000µg/mL不等。初始浓度：（2000，1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 ug/mL），（终浓度：200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625 ug/mL）。
用于白色念珠菌活性测定的阳性对照为两性霉素，配方如下：称取10 mg两性霉素溶于1.0mL DMSO（30%=300+700 µL）中，配成10 mg/mL的母液，然后用30％ DMSO稀释，浓度范围在15.625µg/mL到2000µg/mL等。初始浓度：（2000，1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 ug/mL），（终浓度：200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625 ug/mL）。 3.4 菌液制备
将供试细菌接种到LB琼脂培养基上，28°C培养24 h进行活化。然后将细菌接种到25 mL LB液体培养基中，28ºC摇培，转速为150-180 rpm，培养9~12 h。当澄清的LB培养基变混浊时，表明细菌增值明显，生长旺盛，然后将菌液转接到新的LB液体培养基中进行稀释，菌液浓度调至为106 cfu/mL （OD620=1.0）。
白色念珠菌的菌液制备与细菌的制备大致相同，只是将LB培养基换成PDB培养基。 3.5 单体化合物对供试菌MIC值测定
往洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为106 cfu / mL的供试菌液90 μL，然后加入不同浓度梯度的测试样品母液10 μL，阳性对照为不同浓度的硫酸链霉素10 μL（当供试菌为白色念珠菌时，阳性对照为两性霉素10 μL）。同时设空白对照和溶剂对照（30％乙醇或30％DMSO或30%丙酮），每个处理4个重复。化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。将96孔板于28 ºC下在TS-8转移脱色摇床上振荡（15 rpm），黑暗条件下培养24 h，然后向每孔中加入5mg/mL MTT溶液10 μL，共培养4 h后，在1500 g下离心20 min，去上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 150 μL，再振荡30 min充分溶解Formazane。通过肉眼观察，多孔板中无蓝色物质生成的药剂浓度即为MIC（minimum inhibitory concentration value）值。
3.6 单体化合物对供试菌的抑制中浓度测定
采用多孔板-MTT-分光光度法测定化合物对供试菌的半抑制浓度（IC50）值。用移液枪吸取步骤（3.5）中一系列浓度梯度的显色菌液100 μL，相应转移至另一干净的96孔板中，利用多孔板分光光度计在510nm下测定光吸收值，按下式计算供化合物对供试菌的抑制率（%）：
抑制率=
无药对照孔OD510nm − 药液孔OD510nm
×100%
无药对照孔OD510nm
试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数（X），抑制率换算成生物统计机率值（Y），求得抑制活性回归方程（Y = aX + b），从而可以求得抑制中浓度IC50。
3.7 单体化合物对供试菌的MBC值测定
为进一步验证MIC值的准确性，在已确定MIC值的浓度梯度下，将化合物的浓度梯度再调节成如下三个浓度梯度：10MIC+0.5mg/mL，10MIC+1mg/mL，10MIC+1.5mg/mL。然后参照步骤（3.5）在多孔板中培养供试菌，每个浓度梯度设5个重复，其中两个重复加入MTT溶液验证其是否显色，剩下的三个重复菌液转接到LB固体培养基上，并用灭菌棉签涂抹均匀（白色念珠菌转接到PDA培养基上），培养24h后观察是否有菌落生成，没有菌落生成的浓度梯度即为MBC（minimum inhibitory concentration value）值。
4 稻瘟菌孢子萌发抑制法
4.1培养基的配制
制备燕麦西红柿培养基。 4.2 稻瘟菌产孢 4.2.1 稻瘟菌活化
将长期保存在-20°C下的稻瘟菌菌株，用灭菌的接种针挑取少量菌丝，接种到OTA培养基平板上，用封口膜封好，25°C下黑暗培养7天。 4.2.2 稻瘟菌继代培养
将西红柿燕麦培养基倒入培养皿（Ф=60 mm）中，每皿约20mL，制备成较厚的OTA培养基平板。在已活化好的稻瘟菌菌落中央用移液枪滴加无菌水1mL，再用灭菌棉签轻轻擦洗菌落表面。待无菌水变浑浊后，用移液枪吸取100 µL滴加到倒好的OTA培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂摸均匀。待培养基表面干燥后，盖上皿盖，用封口膜封好，倒置25 °C下培养48h。 4.2.3 机械刺激诱导产孢
将继代培养后的稻瘟菌菌落表面滴加无菌水约3mL，用灭菌棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，待灰色菌落变为黑色后，将表面无菌水吸去，晾干水分，用灭菌的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养24 h，再转移室外培养24~48h至即可得到稻瘟菌孢子。 4.3 配制孢子悬浮液
在已产孢的稻瘟菌平板上滴加无菌水3mL，用灭菌棉签擦洗菌落表面，洗下孢子并用纱布过滤，将孢子洗液装到1.5 mL的离心管中，离心3次（离心力8000 g，每次离心15 min）。然后将孢子液稀释，在血球记数板上滴加孢子液，调节孢子悬浮液浓度至2×106个/mL。 4.4 配制抗菌活性物质溶液
称取分离得到的单体化合物各4 mg到Eppendorf管中，根据样品溶解性分别用乙醇或DMSO溶解，配成4000 µg/mL母液，然后稀释成含10%乙醇或10%丙酮的不同浓度梯度的母液，浓度范围在250~4000 µg/mL。初始浓度：800，400，300，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125µg/mL。终浓度：400，200，150，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625µg/mL。
稻瘟菌孢子萌发实验阳性对照为多菌灵，称取多菌灵1.0 mg 到Eppendorf管中，向其中加入无水乙醇溶液1.0 mL，振荡溶解，得到1000 µg/mL的多菌灵母液。然后用10%乙醇溶液将多菌灵母液稀释为初始浓度：200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625µg/mL用作活性测定。终浓度：100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125 µg/mL。 4.5 活性测定
准备洁净培养皿，在每个培养皿中放两层吸水纸和凹玻片，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水3 mL进行保湿。然后在每个凹孔加入25µL配制好的稻瘟菌孢子悬浮液（2×106 个/mL）和系列浓度梯度的化合物溶液25µL，用移液枪吸吐几遍，混合均匀。同时设空白对照和溶剂对照（5% 乙醇或丙酮），每个处理3个重复。将凹玻片放在保湿的培养皿中，室温下光照培养8 h后观察孢子萌发情况。在显微镜10×10（目镜×物镜）倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中约100个孢子，用计数器记下萌发和未萌发的孢子数，然后计算孢子萌发率（%）。
孢子萌发抑制率=
4.6 数据处理和半抑制浓度的计算
试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数（X），抑制率换算成生物统计机率值（Y），求得抑制活性回归方程（Y = aX + b），从而可以求得半抑制浓度IC50。实验设空白对照和溶剂对照（5% 乙醇，v/v），每个处理3个重复。
溶剂对照萌发率-处理萌发率
溶剂对照萌发率
×100%
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