产量相关QTLs及其在水稻遗传改良中的应用

Yield-relatedQTLsandTheirApplicationsinRiceGeneticImprovement

Abstract

产量是水稻育种最重要的指标之一，它由数量性状位点（QTLs）决定。有很多不同的群体被用来发掘产量性状相关的QTLs。初级定位群体如F2和重组自交系在全基因组QTLs检测中被广泛使用，已经检测到了上百个产量相关的QTLs。近等基因系（NILs）等高级作图群体则被用于进一步的精细定位和目标QTLs的克隆。NILs被认为是对初步定位的QTLs进行图位克隆的最佳群体。迄今为止，已经有20多个产量及相关性状的QTLs通过NIL-F2群体克隆，并且有14个产量QTLs在NIL中得到了证实。这一系列基因的分子机制的阐明，有利于理解产量的形成。通过关联分析，常规稻和野生稻目标性状中的功能基因的有利等位基因得到了挖掘。通过分子标记使优良等位基因得到合理的聚合，极有可能使水稻产量增加。Introduction

水稻是世界上大多数人的主食之一。60年代第一次绿色革命对半矮秆sd1基因的利用使得水稻产量提升到一个新的水平。然而，由于人口的持续增长，全球食物供应总量与消费需求之间的矛盾日益尖锐。增加单产是解决这一现状的主要途径。水稻有很高的遗传多样性组成，包括各种优良的和次级的等位基因。聚合这些产量性状QTLs的有利等位基因，对培育高产品种十分有效。QTL定位是剖析每穗粒数、粒重、有效穗数等产量性状遗传基础的一种流行且有效的策略。已经有数十个QTLs通过近等基因系（NILs）被克隆。从两个亲本的分离群体克隆得到的QTLs可以通过关联分析鉴别出自然群体中的有利等位基因。本文综述了各种作图群体的特征，以及一些产量性状QTLs的基因组位置、遗传效应等信息。我们主要关注主效QTLs的遗传功能，还讨论了这些产量性状QTLs的发掘、聚合在水稻遗传改良种的应用。

QTLPrimaryMappingforYieldTraits

一个QTL的置信区间取决于定位群体和群体大小。F2群体通过两个亲本的杂交以及一次自交就很容易获得，它还包含了两个亲本最完整的遗传信息。理论上F2群体可以在全基因组水平上分析QTLs的加性效应和上位性。因此，在QTL定位兴起的早期，F2被广泛的应用于水稻产量及其组成的遗传机理。在F2群体中，每个个体的基因型都不一样，非遗传因素会导致表型估算的不可靠。双单倍体（DHs）是通过培养F1花药产生的。由于花培对基因型的选择，DH群体在QTL定位中的作用有限。重组自交系（RILs）在QTL定位中应用很广泛，它是通过双亲杂交后单粒传得到的。与F2不同，DH和RIL群体可以在不同的季节和环境条件下重复种植，以剔除环境效应和实验误差。过去的二十年间，有不同的亲本组合被用于构建作图群体。籼粳杂交群体也被广泛的用于QTL作图。除了较高的遗传多样性，亚种间群体的表型差异要比种内群体的大，这是进行QTLs检测的一个强大的工具。为了挖掘野生稻中的资源，很多栽培稻与野生稻之间的杂交组合群体被用于QTL作图。许多性状已经被研究，且定位出了一批QTLs。例如，Xiaoetal.(1998)等通过野生稻和栽培稻的一个回交群体检测到了12个性状的68个QTLs。亚种内杂交群体也可以用于QTL作图因为它比种间杂交群体的分离失真小。例如，两个籼型栽培稻明恢63和珍汕97的F2和RIL被广泛的应用于QTL作图。从这些群体中成功分离出了控制粒形的GS3以及控制穗粒数、抽穗期、株高的多效性QTLGhd7。

最近，从RIL中开发的高密度单核苷酸多态性（SNP）图谱被用于产量相关QTL作图。

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通过限制性片段长度多态性/简单序列重复（RFLP/SSR）标记连锁图谱，一些主效QTLs和加性QTLs被定位到很小的区间内。高密度图谱的全基因组分别率平均余额230kb。置信区间为1LOD的一个新QTL可以被缩小到100kb的区间内，预测到的很多不同QTLs可以被缩小成单个候选基因。可能会有两个因素会影响到QTL作图的精度：一是群体太小导致没有重组事件发生和标记的共分离，另一个是表型的精确性容易受到环境因素和实验设计的影响。使用一个有效的大群体和高密度的SNP图谱，可以检测到额外的QTLs（尤其是微效QTLs），QTL作图精度也会大大提升。因此，在第二代测序技术时代，QTL作图的瓶颈是表型估算和群体大小。ValidatedQTLs

90年代通过各种初级群体，许多产量及其相关组分QTLs得到了初步定位了（www.gramene.org）。对于QTL鉴定中遗传背景噪音的消除来说NILs是理想的材料。目标QTLs控制的性状在NILs中以单个孟德尔遗传因子的方式分离。通过NILs鉴定出来但尚未克隆的QTLs见Table1和Figure1。这些目标QTLs最大的候选区域为5.8cM，最小的为4.6kb。共有6个QTLs与每穗粒数有关。5个被定位于不同染色体上的QTLs对粒重和每穗粒数有多效性，其中3个在对应的NILs中对粒重和每穗粒数的贡献相反所以对增产并不明显。有趣的是，qGY2–1（一个产量QTL）是从Guichao2和东乡野生稻的杂交群体中定位出来的，野生稻携带的等位基因会使产量增加。此外，gw8.1和gw9.1两个能增产的野生稻等位基因也是从野生稻和韩国粳稻Hwaseongbyeo的杂交群体中检测到的。gpa7和spd6两个QTLs也是在栽培稻和野生稻的杂交群体中鉴定出来的。不同的是，野生稻的这两个等位基因对粒重、每穗粒数、产量是负效应。这些研究表明，野生稻既有有利等位基因也有不利等位基因。鉴定出野生稻和地方品种中的有利基因能拓宽遗传资源、培育高产品种。

QTLFine-Mapping

Approachesbasedonadvancedpopulations

只要拥有大量多态性分子标记，F2、DH以及RIL群体都是适合并且强大的精细定位工具。目前为止，已经有SRS3、DEP2/EP2、DEP3、EP3、APO1和GIF1等一批基因是通过F2群体鉴定和分离的。这些基因的功能获得或者缺失性突变导致了显著的表型变异，因此目标群体的格尔提很容易被分组（Table2）。然而，F2这种初级定位群体由于遗传背景噪音很难精确估算单个QTL的遗传效应。并且，用F2群体很难对一个主效QTL进行精细定位更别说

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微效QTL。基于此，1996年Tanksley和Nelson提出了使用NILs进行候选QTL/基因的分离和克隆。目标QTL区域在NILs中是有分离的，其遗传背景也得到了稳定。与初级定位群体相比较，NILs消除了遗传背景噪音的干扰。因此，目标QTL相关性状在NIL-F2群体中表现出单个孟德尔遗传因子的3:1的分离比例。此外，在NIL中单个QTL比在初级群体中能解释更多的表型变异。因此，NILs被广泛的应用于QTL精细定位和分离鉴定。

一般有3种构建NILs的方法（Figure2）。经典的方法是连续的回交策略，即CB-NILs。它包含3个步骤：（1）两个品种之间的杂交；（2）与轮回亲本进行连续4次回交，每代进行MAS；（3）高代回交F1自交即可得到NIL-F2。有很多QTLs就是通过CB-NIL群体进行精细定位和克隆的。然而，构建水稻CB-NILs很费时间，一般在得到QTL信息之后需要3年时间才能构建好。RIL群体（如F6和F7）是通过单粒传法得到的。理论上高代中的杂合子的比率是很少的，计算公式为P(Fn)=2−(n–1)×100%（其中n表示自交的代数）。例如，F6中杂合子的比例为：P(F6)=2−5×100%=3.1%，也就是说96.9%的植株遗传背景为纯合的。因此，F6和F7代植株表现出大致相同的表型。然而，如果某个性状的一个未知的基因/QTL被定位在杂合区域，它的子代的目标性状会有明显可见的分离。因此，杂合植株的子代形成了该未知基因/QTL的NILs。这种类型的NIL是基于性状表现获得的NILs（TP-NILs），事前无需任何QTL信息。Zhangetal.（2006）在一个RILs（F7）家系中发现每穗粒数有显著差异，最终，Yanetal.（2011）通过TP-NILs将控制抽穗期、株高、每穗粒数的主效QTLGhd8进行了克隆。TP-NILs策略完全依赖于性状的表型变异。因此，它对鉴定能引起巨大表型变异的主效QTLs很有效。另一种构建Nil的方法是杂合近交系（heterogeneousinbredfamily，HIF-NILs）。Shaoetal.（2010）也称之为剩余杂合体。HIF植株是在有了QTL初步定位信息的基础上用分子标记对近交重组子进行筛选得到的。杂合植株自交即可得到NIL-F2。这种NILs同时适合于主效

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QTL和微效QTL的定位与分离。主效QTLSPP1和两个控制粒长的微效QTLqGL7和qGL7-2就是用这种NILs进行精细定位的。从遗传上讲，TP-NILs和HIF-NILs其实都是从高代RIL群体中筛选携带杂合QTL区域的单株。不同之处在于，TP-NILs只是简单的基于RIL的表型差异获得的，HIF-NILs则是基于QTL区域的基因型构建的。这3种NIL构建策略都被成功的应用于QTL精细定位。TP-NILs和HIF-NILs的遗传组成结合了两个亲本的基因组，而CB-NILs除了目标QTL区域之外，其它区域均与轮回亲本相同。染色体单片段代换系（CSSLs）是一种高级作图群体，其构建方式与CB-NILs策略类似。以MAS为基础，供体亲本的片段覆盖CSSLs全基因组。CSSLs群体是检测主效和微效QTL的强大工具，近年在水稻等作物中应用广泛。

Approachesbasedonnaturalpopulation

关联分析也就是连锁不平衡（LD）作图，是一种利用与表型关联的基因型的连锁不平衡作图的新方法。基于自然群体（不相关个体）的关联分析被广泛的用于玉米这种LD衰退迅速的作物的QTL定位。在玉米混合自交系、优良自交系以及地方品种中，通过各种关联分析方法发现了超过50个候选基因/QTLs。全基因组关联分析（GWAS）由于测序费用低在玉米中得到了广泛使用。与玉米类似，水稻这种高度自花授粉的物种，也是一种理想的关联分析作物：水稻种质资源丰富、能快速分型、表型可重现。相比如连锁分析，关联分析将会更准确的检测出更多的基因/QTLs。一些通过连锁分析克隆的主效QTLs被精细定位到了100kb的区间范围内。例如：GS3和GW5这两个控制谷粒大小的主效QTLs分别被精细定位在120kb和70kb内。然而，连锁位点的峰值信号经常在已知基因附近（不包含在内）。这种状况与超过100-250kb的LD衰减一致。与连锁分析相比，GWAS鉴定出的QTLs还比较少。但令人惊奇的是，Ghd7和Ehd1等一些已经克隆了的控制水稻花期的主效QTLs无法通过GWAS鉴定。另外，一些导致性状发生巨大变异的新突变可以通过连锁分析检测到，但由于突变在自然群体中发生的几率太小而不能被关联分析检测。例如，粒宽等位基因GW2只能在WY3和Oochikara等少数品种中检测到。

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Approachesbasedonultra-highdensitylinkagemapswithpermanentsegregationpopulation

新一代测序技术极大的方便了超高密度SNP图谱的构建。理论上，足够多的多态性标记可以讲一个主效QTL定位到一个很小的区间内，甚至是单个基因。Yuetal.（2011）通过超高密度的SNP图谱通过241个RIL将之前克隆了的控制粒长和粒宽的主效QTLGS3和qSW5/GW5分别定位到了197kb和123kb的区间内。一些SNP标记在小群体中会聚集或共分离，实验误差会导致表型数据质量低下，重组率低等会导致QTL精细定位瓶颈。这表明扩大RILs群体大小直1000，能极大地增加重组率，并足以将QTLs定位到50kb范围内。完善控制实验条件得到的精确的表型数据也在一定程度上有助于微效QTLs定位精度。ImportantQTLsforGrainYieldTraitsGrainnumberperpanicle

Gn1a，是第一个通过图位克隆的控制水稻实粒数的QTL。它编码一个能讲解细胞分裂素的细胞色素氧化/脱氢酶（OsCKX2）。Habataki的OsCKX2基因发生无义突变，导致花序分生组织中细胞分裂素的积累，这使得枝梗数（尤其是二次枝梗数）、粒数和产量增加。Ghd7

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是水稻花期调控的一个关键转录因子，它也对穗粒数有显著的效应，能使产量增加。Ghd7还能促进茎秆的生长和发育。携带Ghd7功能等位基因的NILs的维管束系统发育较好，这使得物质运输和植株抗倒伏机械强度增强。Ghd8/DTH8也对抽穗期、穗粒数、产量有多效性。DEP1控制穗的直立，对穗粒数有正效应，编码一种与GS3N-末端有同源性的未知的磷脂酰乙醇胺（PEBP）结构域蛋白。DEP1通过使一次枝梗和二次枝梗数增加使穗粒数增加。由于Gn1a的表达量在NIL-dep1中显著的降低，所以有研究表明，DEP1可能与Gn1a一起调控细胞分裂素来调控穗部发育。这与dep1等位基因增强分生组织活性、促进细胞分裂是一致的。此外，NIL-dep1植株比NIL-DEP1植株的维管束系统发育好，前者成熟期的薄壁细胞细胞壁也较厚。EP3和DEP3两个直立穗QTLs分别定位于第2和第6号染色体上。DEP3等位基因突变体的穗粒数和产量增加，但EP3相反，野生型的等位基因比突变体的穗粒数多。ep3和dep3两个突变体的维管束都显著增加，这导致了穗的直立。这些基因能增强碳水化合物的运输能力以及提升茎秆的机械强度，这对于培育高产、抗倒伏品种很有用。Grainweight/grainsize

粒重由籽粒大小决定：如粒长、粒宽以及籽粒厚度。Grainlength

3号染色体上控制粒长的主效QTL曾经被多次报道。主效QTLGS3编码一个PEBP-结构域蛋白，第二外显子上C-A的突变导致了蛋白功能缺失。根据功能突变位点设计的酶切扩增多态性序列标记SF28被确认是一个功能性分子标记。SR17、RGS1以及RGS2等3个SSR标记分别位于GS3的第二外显子、最后一个内含子和最后一个外显子上。此外，RGS1和RGS2还能将SF28检测出的C型品种分成粒长有明显差异的两个亚群。这个结果表明第2内含子和最后一个外显子对粒长也有较小的效应。因此，这些分子标记有助于培育满足不同粒长消费需求的品种。GS3N-端的一个植物特定器官大小调控（OSR）域对粒长的调控起负作用，C-端的TNFR/NGFR和VWFC结构域对OSR的功能其抑制作用。如果野生型等位基因对应于适中的籽粒大小的话，上面两个区域的功能缺失会分别导致长粒和极短籽粒。OSR结构域包含有C-A突变（SF28）的第二外显子，检测到RGS2的最后一个外显子则包含TNFR/NGFR和VWFC结构域。总之，GS3的这些结构域对籽粒大小有各自不同的调控功能。Grainwidth

最近，5好染色体短臂上的一个QTL簇经常在初级和次级定位群体中检测到。随后，GS5和qSW5/GW5两个基因/QTLs都通过图位克隆被分离（Table2和Figure1）。它们在第5号染色体上的排列顺序为SRS3（3.12Mb）、GS5（3.4Mb）、qSW5/GW5（5.3Mb）（www.gramene.org）。控制粒宽的主效QTLqSW5/GW5（5.3Mb）被两个研究小组独立克隆。它编码有144个氨基酸组成的新的核蛋白。GW5的功能缺失导致外颖细胞的增加进而导致粒宽和粒重的增加。报道称酵母双杂交中qSW5/GW5与聚遍在蛋白互作。GW2第2染色体上的另一个控制粒宽的主效QTL，它编码一种未知的环形E3泛素连接酶。它的功能缺失会促进细胞分裂导致谷壳变宽。因此，qSW5/GW5以及GW2可能共同参与一些促进细胞分裂和生长的组分的降解，进而促进粒宽、粒重和产量的增加。GS5是从H94和珍汕97的杂交群体中分离出的一个新的控制粒宽和粒重的QTL，其中H94携带的等位基因对粒宽和粒重有正效应。不同的表达水平会导致粒宽和粒重的不同。GS5通过调控细胞分裂影响细胞周期。Grainfilling/thickness

水稻粒宽主要是由灌浆决定的。迄今为止，只有GIF1和FLO（a）/FLO2两个基因被鉴定出来。GIF1编码在灌浆早期对碳水化合物进行切割的细胞壁转化酵素，其功能是在灌浆

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过程中转运胚珠和柱头微管组织中的蔗糖到胚乳中进行淀粉的合成。gif1突变体中葡萄糖、果糖以及蔗糖的积累比野生型的较少，这影响了灌浆。GIF1在其自身启动子的驱动下过量表达会使产量增加，但在35S或Waxy启动子的作用下的异常表达结果相反。这表明灌浆过程中这种严格的表达方式对于粒宽和产量的增加是必需的。FLO(a)/FLO2通过影响灌浆来调控淀粉品质。flo2突变体中产生胚乳储藏淀粉和储藏蛋白的一些相关基因的表达均被下调，这导致籽粒大小和淀粉品质降低。相反，FLO(a)/FLO2的过量表达会显著地增加籽粒大小。因此，FLO(a)/FLO2通过影响胚乳中储藏物质的积累调控着水稻淀粉品质和籽粒大小。报道称GW2也促进谷粒的灌浆率进而增加粒重和产量。因此，在灌浆过程中，GIF1和FLO(a)/FLO2是正向调控因子，而GW2是负向调控因子。Tillersperplant

产量性状QTLqGY2-1被定位于2号染色体上的一个102.9kb的区间内，在该区间内定位到一个亮氨酸重复受体激酶（LRK）基因簇。与东乡野生稻相比，Guichao2中缺少了8个LRK基因中的LRK1。鉴于NILs中产量的差异，LRK1很可能就是qGY2-1的候选基因。LRK1的过量表达导致分蘖数和每穗的小穗数增加进而使产量增加。

此外，改良理想株型是另一条增产途径。PROG1是从特青和野生稻的杂交群体中克隆的一个控制植株从匍匐生长向直立生长的调控因子，它对株型的调控包括分蘖数和分蘖角度。与野生稻相比，特青等栽培稻分蘖数减少但穗着粒密度增大。Ltn1是从IR64和Aikawa1的后代群体中精细定位的一个控制分蘖数的基因，其38.6kb的候选区域中预测到6个基因，其中一个编码假定番荔枝启动子结合蛋白域的基因被命名为OsSPL14。巧合的是，Jiaoetal.(2010)和Miuraetal.(2010)同时报道了OsSPL14。OsmiR156通过对OsSPL14表达水平的调控，控制分蘖数和穗粒数。增产基因OsSPL14被转入日本晴后，得到了分蘖减少、抗倒伏、产量增加的理想株型植株。MOC1和EP3连个控制分蘖数的基因也是从突变体中克隆的。EP3同时影响分蘖和穗粒数。MOC1是第一个被完全阐明的控制分蘖数的基因。由于分蘖芽形成过程中的突变，moc1突变体只有1个主茎，这导致了显著地减产。然而，由于其负效应，这些突变体等位基因不能直接应用于育种。MOC1和EP3所在区域并没有定位到其他控制分蘖数的QTL，这表明这两个位点的自然变异可能不会导致显著的差异。因此，这些基因似乎不适合用于水稻的遗传改良。

FavorableAllelesandFunctionalMarkersforMolecularBreeding

生物的进化和驯化分别自然选择和人工选择的驱动。几千年来，产量就一直是育种家和农民最关心的性状。因此，在水稻进化和驯化过程中，能适应环境和增加产量的基因都被人工选择保留下来并被广泛传播。因此，从不同的品种和群体中，Gn1a、GS3、qSW5/GW5、Ghd7、DEP1等一批可用于改良产量的主要QTLs/基因被重复鉴定出来。以这种观点来看，不同的等位基因分布于不同的生态型中。此外，基因的克隆一般都是基因双亲或野生型和突变体之间等位基因的差异。该种情况下，即使克隆了一个基因，也不清楚哪些自然变异的等位基因可用于育种。关联分析是一种从自然群体中发掘优良等位基因的有效方法。功能性分子标记是基于导致表型变异的功能基因中的多态性位点开发出来的。因此，功能性分子标记可以在育种中鉴定优良等位基因。

从GS3中开发了3个功能性分子标记SF28、RGS1和RGS2。SF28可以鉴别出中等粒型和小粒之外的长粒，RGS1和RGS2则可以鉴别出小粒。因此，育种家可以利用这3个功能性分子标记鉴定出优良等位基因用于粒型的育种。Gn1a是被驯化了的对每穗粒数起负效应的基因。高产品种携带的Gn1a等位基因在第1外显子和第3外显子上分别有6和11bp的缺失，可以根据Gn1a等位基因的这两个缺失设计功能性分子标记用于MAS。在100个地方品

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种（包括籼稻和粳稻）中发现日本晴qSW/GW5等位基因有一个1212-bp的缺失与粒宽的增加高度相关。这种插入/缺失突变也可以用于开发功能性分子标记。dep1中第5外显子上的一个637-bp到12-bp的置换导致编码提前终止，C-末端丢失了230个氨基酸残基。对69个粳稻和83个籼稻共152个品种进行关联分析发现，DEP1的这种突变只在37个直立穗或半直立穗粳稻品种中有发现，这些品种具有较高的产量。因此，DEP1等位基因变异似乎发生在粳稻的育种进程中。携带粳稻dep1等位基因的ZF802比籼型ZF802产量明显增加。因此，籼稻的产量有望通过将DEP1等位基因置换为粳稻的dep1而得到改良。

上面提及的QTLs大多来源于自然变异。这些突变一般导致功能缺失或功能获得，还导致明显的表型差异。对于数量性状改良来说，发掘微效或主效功能性等位基因将会给培育广适性品种提供便利。在水稻漫长的驯化和人工选择过程中，一系列不同的等位基因分布于偏好各种不同环境条件的不同品种中。例如，Ghd7有5种单体型或功能等位基因，携带Ghd7-1和Ghd7-3的品种生长于有很长温暖生长期的热带和亚热带地区。这两种主效功能等位基因能使水稻延长抽穗期以充分的利用光温资源育出大穗和更多谷粒。然而，携带Ghd7-0和Ghd7-0a两个无效等位基因的品种在中国中部和南方以及高纬度的北方的两季稻区被当做早稻种植。在日本和中国北方种植的是携带弱效等位基因Ghd7-2的品种。Ghd7自然变异等位基因的地域分布方式表明合适的等位基因是有生态型和种植季节决定的。因此，针对特定生态型区域鉴定出控制水稻生产力和适应性的优良等位基因是很有意义的。

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