肺纤维化差异表达基因及其功能的研究进展_尹丹丹

工业卫生与职业病󰀁2011年第37卷第2期IndHlth&OccupDis󰀁2011,Vol󰀁37,No󰀁2

󰀁综述󰀁肺纤维化差异表达基因及其功能的研究进展

尹丹丹,景友玲,王献华,马小兵

(河北联合大学,河北唐山063000)

[中图分类号]R563󰀁󰀁󰀁󰀁

[文献标识码]A󰀁󰀁󰀁󰀁

[文章编号]1000󰀁7164(2011)02󰀁0114󰀁05

󰀁󰀁肺纤维化是由多种原因引起以成纤维细胞(fibroblast,FB)增殖和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)沉积为特征的疾病。长期吸入大量

的二氧化硅(silicondioxide,SiO2)粉尘引起的以肺间质弥漫性纤维化为主的矽肺病,是我国目前发病率最高,死亡危险性较大,对劳动者危害最为严重的一类职业病,其预防和治疗亦成为我国职业病防治工作的重点。肺纤维化的发生发展过程受细胞因子网络系统,如白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)和转化生长因子(TGF)等从多方面、多阶段参与调控。过程中的基因表达错综复杂。研究表明,单个特异基因表达分析方法并不能完全阐述其复杂的机制。随着人类基因组计划的研究,众多学者已将肺纤维化发生发展过程中的相关基因作为一个󰀁基因群󰀁进行研究,筛选出具有调控作用的关键基因,进而获取基因功能信息,并对差异基因的功能进行探讨,以便揭示肺纤维化发生发展在基因水平上的调控机制,探索有效的防护措施,寻求早期诊断及新的治疗手段。我们就近年来国内外对肺纤维化差异表达基因功能的研究进行如下综述。1󰀁肺纤维化差异表达基因相关的研究方法

高等真核生物约含有数百万个基因,基因的表达是按时间和空间顺序有序进行的,这种表达方式即为基因的差异表达,其中那些异常表达的基因与疾病的发生和易感性有关。通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析细胞生命活动过程提供重要信息,从而可以筛选和鉴定出与疾病发生发展相关的基因。目前筛选肺纤维化差异表达基因的方法主要有以下几方面。

1󰀁1󰀁基因芯片技术

基因芯片亦称为DNA微阵列。其原理是将众多的靶基因序列或寡聚核苷酸片段有序而高密度地

[基金项目]河北省自然科学基金资助项目(C2008001007)[作者简介]尹丹丹(1986-),女,在读硕士。[通讯作者]王献华,教授。[1]

排列在玻璃、硅等固相载体上,用待检测的样本分子与之杂交,利用激光共聚焦显微扫描等技术对芯片上的杂交信号进行检测和比较,辅以计算机统计分析,得到样本的基因表达信息,这为研究各种疾病发展过程中基因表达谱和关键性基因提供了有力的技术。目前,大量研究表明,此技术可用于筛选肺纤维化的差异表达基因1󰀁2󰀁差异显示PCR法

该方法是研究与癌症发生有关基因为目的而创立的基因表达差异的方法。方法以一对或多对组织(或细胞)总RNA反转录的cDNA为模板,利用PCR的高效扩增,通过5󰀁和3󰀁端引物的合理设计和匹配,将真核细胞中表达的约1500种基因片段直接显示在DNA测序胶上,即能找出表达有差异的基因。姚武等[2]已将荧光标记的mRNA差异显示技术应用在筛选、鉴定与尘肺病相关的基因。1󰀁3󰀁抑制消减杂交法

抑制消减杂交法的原理是利用消减杂交和两次抑制PCR,使差异表达基因的cDNA片段得到高度富集,实现对差异表达基因的分离和克隆。运用消减杂交使丰度高的单链cDNA杂交形成双链,在杂交完成后,原来在丰度上有差异的单链cDNA达到均一化。抑制PCR,选择性地抑制了非目标序列片段的扩增。Jin等

[3][2,4󰀁8]

。

用此法对矽肺肺组织和

正常肺组织中的基因表达进行比较分析,发现有7条不同的cDNA序列表达。2󰀁肺纤维化差异表达基因的筛选

基因表达差异分析技术的广泛应用,使肺纤维化发生机制中基因水平研究得到深入。Zuo等

[4]

用

核苷酸微阵列分析肺纤维化,证明正常肺组织与纤维化肺组织基因表达不同,肺纤维化过程中有基因的改变。Liu等针对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型,用微阵列技术对基因表达谱分析显示,肺纤维化差异基因表达共628个,经验证,发现于炎症区域(foundininflammatotyzonel,FIZZl)尚无统[5]

尹丹丹,等.肺纤维化差异表达基因及其功能的研究进展󰀁115󰀁

一的中文译名,是纤维化的潜在调节基因。Satomi等用基因芯片技术对由百草枯导致的大鼠肺纤维化模型中的1090个基因中筛选出明显的差异基因共36个。姚武等[2]用基因芯片技术从5705个基因中共筛选出早期矽肺与正常肺组织样品相比差异表达明显的基因共323个。陈蕾等用Illumina激光共聚焦光纤微珠基因芯片技术研究染矽尘大鼠早期肺组织与正常肺组织的差异基因表达谱,检测出的有效基因共22107个,筛选出染矽尘组与对照组的差异基因共1567个,其中上调基因765个,下调基因802个。吕长俊等[8]按不同时间点筛选出矽肺差异表达基因,其中高表达的炎性基因43条,与ECM代谢有关的基因46条,其他112条基因表达下调。

3󰀁肺纤维化差异表达基因的相关功能3󰀁1󰀁与氧化应激相关的基因

氧化应激是指机体遭受刺激时体内产生的高活性分子,如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(reactivenitrogenspecies,RNS)产生过多。氧化程度超出氧化物的清除,使氧化系统和抗氧化系统失衡,活性氧在体内堆积产生毒性,引起脂质过氧化反应,从而导致组织损伤[9]。以往的研究表明,当肺巨噬细胞(alveolarmacrophages,AM)吞噬SiO2粉尘后可导致大量氧氮自由基产生和过氧化反应增加从而引起生物膜损伤,粉尘导致AM内钙离子大量增多使细胞破裂,进而释放出多种细胞因子,诱导成纤维细胞增生和胶原合成,最终引起肺纤维化[10]。

在对差异基因的研究中发现,矽肺组织中与ROS代谢相关的基因,如乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶2、血红素加氧酶1、还原型辅酶󰀁(NADPH)氧化酶组成体等的mRNA表达上调,证实了矽肺发生的自由基假说。编码超氧化物歧化酶3、血浆谷胱甘肽过氧化物酶前体、微粒体的谷胱甘肽S-转移酶1等具有抗氧化作用的基因均出现下调,进一步证实了氧化损伤在矽肺发病中的作用。编码Na-K-ATP酶󰀁1多肽、电压依赖性钙通道󰀁-3亚基的基因均出现下调,为󰀁钙超载󰀁学说提供了基因水平的证据[2]。与差异表达基因相对应,陈娟娟等在矽肺早期差异表达蛋白的研究结果中指出存在热休克蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶-1等,这些蛋白与SiO2引起的氧化应激反应密切相关。另外,氧化应激可触发细胞外信号调节激酶(ERKs)和p38磷酸化,激活核转录[11]

+

+

[7]

[7]

[6]

因子-󰀁B(NF-󰀁B)和激活蛋白-1(AP-1),参与矽肺纤维化的发生,而抗氧化剂可抑制NF-󰀁B的激活[12]。超氧化物歧化酶等抗氧化酶的应用,能减轻体内自由基对机体的损害,改善粉尘引起的肺部炎症和纤维化

[13󰀁14]

。由此推断,与氧化应激有关

的基因在矽肺纤维化中起着重要作用。3󰀁2󰀁与免疫反应相关的基因

研究表明,免疫机制参与肺纤维化的发生发展。󰀁型(Th1)和󰀁型辅助性T细胞(Th2)细胞因子间失衡是肺纤维化的发病机制之一。Th1因子,如IFN-󰀁,IL-12、IL-18等可抑制成纤维细胞的增殖和胶原纤维的形成。Th2因子,如IL-4、IL-10、IL-13等可促进成纤维细胞增殖和胶原合成,并抑制胶原的降解。筛选出的与免疫有关的差异表达基因包括编码细胞活素类、趋化因子受体、补体成分等。如IL-1󰀁、IL-18、TNF受体超家族-4和趋化因子配体4等相关mRNA表达均上调。IL-1在免疫反应中起重要调节作用,在肺纤维化形成过程中,IL-1能刺激培养的成纤维细胞增殖,还能引起成纤维细胞󰀁、󰀁型前胶原蛋白mRNA表达,并通过促进或抑制胶原酶的活力来影响ECM成分堆积。Srivastava等[16]研究发现,IL-1󰀁基因敲除的小鼠对SiO2诱导的肺部炎症有抵抗作用,而IL-1Ra(IL-1的一种天然特异性拮抗剂)可明显减少SiO2诱导的肺纤维化的发生。IL-18最初称为干扰素诱导因子,日本学者Nakatani等利用将小鼠IL-18基因敲除使之成为IL-18基因缺陷型,发现IL-18基因缺陷型小鼠的肺纤维化程度要比野生型小鼠严重。TNF-󰀁是中性粒细胞强有力的趋化因子,Fujita等

[18]

[17]

[15]

发现

TNF-󰀁在肺纤维化的发展过程中起双重作用,内源性TNF-󰀁过量表达促进肺纤维化的形成;而外源性则可抑制肺纤维化形成。TNF-󰀁受体基因敲除的小鼠在长期接触高浓度的粉尘后肺纤维化程度减轻。趋化因子受体CXCR4促进肺纤维化发生发展的可能机制是通过CXCR4与其配体CXCL12结合诱导循环中纤维细胞向肺内募集而加重肺纤维化,通过阻断CXCR4与CXCL12的结合可以减轻肺纤维化反应。

3󰀁3󰀁与细胞周期调控相关的基因

当AM吞噬粉尘被激活后,可合成并释放多种细胞因子,如TGF-󰀁、TNF-󰀁和IL-1等,这些细胞因子可能通过信号转导激活与细胞增殖有关的基因,促进FB增殖。参与细胞周期调控的因子主要有细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依[19]

󰀁116󰀁工业卫生与职业病󰀁2011年第37卷第2期赖性激酶(CDK)和CDK抑制因子(CKI)。矽尘刺激后,具有部分转化特征的人胚肺成纤维细胞(S-HELF)中,cyclinD1和CDK4蛋白均有过表达的现象[20]。cyclinD1是参与细胞周期调控的周期蛋白家族成员,它在G/S期转换中发挥重要作用,其高表达可使细胞较易跨越限制细胞生长的G/S检控点,促进细胞增殖和肿瘤发生。S-HELF中cyclinD1的高表达,说明cyclinD1在调控FB激活和增殖中发挥了重要的作用。3󰀁4󰀁与细胞凋亡相关的基因

在矽肺差异表达的基因中有凋亡基因(如Fas/FasL、P53和bcl-2等)的异常表达,可导致正常肺组织结构破坏而促进纤维化发生发展。其中Fas/FasL介导的细胞凋亡在尘肺的发生发展中起关键的作用,Fas与配体FasL结合后可激活caspases-8,进一步激活caspases-3,启动细胞凋亡。Borges等[21]研究显示,FasL缺陷型鼠气管内灌注矽尘很少发展为肺纤维化,而重新导入FasL则又发生肺纤维化,其可能的机制是AM凋亡减少,导致中性粒细胞浸润以及TNF的产生相应减少,进而抑制了炎症反应[22]。可溶性的Fas抗原、抗FasL的抗体都能降低动物模型中肺纤维化的程度,而加入抗Fas抗体后反可促使Fas/FasL绞连,导致肺纤维化的发生。用caspase抑制剂能降低caspase-1和caspase-3的活性,能减少凋亡细胞数,减轻肺炎症/肺纤维化病变程度[23]。3󰀁5󰀁与细胞外基质重塑的相关基因

基质金属蛋白酶(matrixmatalloproteinases,MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs)与ECM的合成和降解关系密切,MMPs/TIMP比值的变化决定着ECM的变化趋势,在肺纤维化的发生发展中起关键作用。MMPs在肺纤维化形成的早期,参与ECM和基膜的降解,启动肺纤维化;而后期则对ECM重塑起重要作用[24󰀁25]。TIMPs抑制MMPs对ECM的降解,促进基质重塑,导致纤维化发生。资料表明,编码MMPs的基因在肺纤维化中明显上调,其中MMP-7明显增加,MMP-7基因敲除的小鼠在博莱霉素诱导下则不发生肺纤维化[26],MMP-7可能为调节肺纤维化基质重塑的重要基因。3󰀁6󰀁与信号转导途径相关的基因

在肺纤维化差异表达的基因中,有许多基因涉及细胞信号转导,如G蛋白耦联受体激酶6、酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)等基因。在肺纤维化过程中,有许多转录因子被激活,如NF-󰀁B、AP-1、转录激活因子(STAT)等。这些因子

的激活经多种信号转导通路调控着纤维化相关基因的表达。NF-󰀁B和AP-1的激活可通过与靶基因上游启动子特定的结合位点,调节着与许多炎症相关基因的转录和翻译等。MAPK家族是与细胞生长、分化、凋亡等密切相关的信号转导途径中的关键信号分子,主要包括细胞外调控激酶(ERK)、Janus激酶(JNKs)、P38激酶,刺激因子激活MAPK分子,随后可反式激活NF-󰀁B、AP-1等,从而引起下游因子表达改变。有研究证实,晶体硅能诱导大鼠肺上皮细胞内ERK1、ERK2、P38激酶磷酸化,进而导致AP-1的激活[27]。TGF-󰀁可通过TGF-󰀁/Smad2途径促进胶原合成,也可由p38MAPK途径直接激活Smad3,使其磷酸化,最终导致ECM的沉积。而IFN-󰀁可迅速激活STAT1,从而抑制AP-1活性,也可通过JAK1/STAT1途径诱导并激活Smad7,抑制Smad3/Smad4的磷酸化,从而抑制TGF-󰀁的信息传递途径而发挥抗纤维化效应[29]。总之,肺纤维化发生发展过程中各种转录因子间、各信号转导途径的信号分子间存在交互作用,形成复杂的信号网络系统调控肺纤维化相关基因的表达。4󰀁结语

综上所述,肺纤维化是一种慢性进行性疾病,发病机制错综复杂,许多发病环节仍未完全认识。其发病机制涉及到许多基因的异常表达,随着对筛查出的差异表达基因的功能及相关的信号转导途径的相互作用的深入研究,许多致纤维化的关键环节和相应的调节基因将被逐步发现,通过对肺纤维化差异表达基因功能的研究,可在一定程度上揭示肺纤维化发生发展在基因水平上的调控机制,从而为肺纤维化的防治提供了新的靶点。参考文献

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at

the

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of

p300/CBP

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(收稿日期:2010-08-06)

󰀁基层工作󰀁某汽车制造厂职业卫生学调查

王金玉,李盛,李志强

[中图分类号]R135󰀁󰀁󰀁󰀁

[文献标识码]D󰀁󰀁󰀁󰀁

2~4mg/m3;面漆线入口、调漆间、小修区苯及二甲苯浓

度分别为7~9mg/m3、17~19mg/m3,6~8mg/m3、21~24mg/m3,6~8mg/m3、20~22mg/m3;以上测定结果均不超过国家标准。2󰀁2󰀁职业健康检查

55名作业人员中,血常规检验正常者(均为男性)35人(63󰀁6%),异常者20人(36󰀁4%);血常规检验异常项目包括血红蛋白、血小板及白细胞,有13人(23󰀁6%)出现血红蛋白降低,有1人(1󰀁8%)出现血小板降低,9人(16󰀁4%)出现白细胞降低:7名女工均为擦净工,血常规检验均异常,6人(85󰀁7%)出现血红蛋白降低,1人(14󰀁3%)出现血小板降低,2人(28󰀁6%)出现白细胞降低;48名男工中,包括擦净工1名(2󰀁1%)、焊工13名(27󰀁1%)、打磨工8名(16󰀁7%)、喷漆工15名(31󰀁3%)、调漆工2名(4󰀁2%)、刮灰工1名(2󰀁1%)、司炉工5名(10󰀁4%)及污水处理工3名(6󰀁3%);48名男工中,有13人(27󰀁1%)出现血常规检验异常,其中,血红蛋白降低者及白细胞降低者均为7人(14󰀁6%),无出现血小板降低者。55名作业人员均未出现异常胸片及听力损伤。3󰀁讨论

该汽车制造企业涂装厂存在噪声、粉尘、苯及二甲苯等多种职业性有害因素,噪声主要造成以听觉系统为主的损害,粉尘主要损害呼吸系统,长期低浓度接触苯及苯系物会引起接触者血液系统损害。本次调查结果显示,该汽车制造企业涂装厂噪声、粉尘、苯及二甲苯浓度在职业卫生接触限值以下,说明该汽车制造企业作业环境良好。调查结果还显示,55名作业人员中,有36󰀁4%出现血常规异常,表现为血红蛋白、血小板及白细胞降低,以血红蛋白降低者最多,有13人,占23󰀁6%,说明作业人员以血液损害为主,究其原因,可能因长期低浓度接触苯及苯系物所致。综上所述,在该汽车制造企业今后的职业病防治工作中,要继续保持良好的作业环境,定期进行职业性有害因素检测,对接害工人要定期进行职业性健康检查,对职业性健康检查异常者,应定期复查,必要时调离有害工作岗位,切实保护劳动者的健康权益。

(收稿日期:2010-06-03)

1

2

2

(1󰀁兰州大学,甘肃兰州730000;2󰀁兰州市疾病预防控制中心,甘肃兰州730030)

󰀁󰀁某汽车制造企业是某品牌系列轿车的生产基地,属机械化自动化生产,涂装厂的FVC线、面漆线入口、调漆间、打胶线、小修区主要为人工操作,存在噪声、粉尘、苯及苯系物等职业性有害因素。为更好地保护劳动者健康,2009年12月我们对该汽车制造厂企业职业性有害因素进行了现场检测,对作业人员进行了职业健康检查。1󰀁对象与方法1󰀁1󰀁对象

选择某汽车制造企业的涂装厂为调查对象,对FVC线、打胶线存在的噪声、粉尘进行现场检测,共设置检测点12个,噪声及粉尘各6个;对面漆线入口、调漆间、小修区存在的苯及二甲苯浓度进行现场检测,共设置检测点9个。对55名作业人员进行职业健康检查,其中男性48人,女性7人,年龄为18~52岁,工种包括擦净工、焊工、打磨工、喷漆工、调漆工、刮灰工、司炉工及污水处理工。作业人员职业健康检查项目主要为血常规、胸片及听力检查。1󰀁2󰀁方法

面漆线入口、调漆间、小修区的9个检测点采用定点采样的方法进行苯及二甲苯的采样,使用美国安捷伦公司生产的6890型气相色谱仪,按照苯、甲苯、二甲苯、乙苯和苯乙烯的溶剂解吸-气相色谱法进行分析,采样要求及评价标准分别见标准(GBZ159󰀁2007、GBZ2󰀁1󰀁2007)。FVC线、打胶线的6个粉尘检测点采用定点采样的方法使用LD-3C粉尘采样仪测定,采样要求及评价标准分别见标准(GBZ/T192󰀁1󰀁2007、GBZ2󰀁1󰀁2007)。FVC线、打胶线的6个噪声检测点采用定点采样的方法使用HS5660A声级计检测,采样要求及评价标准分别见标准(GBZ/T189󰀁8󰀁2007、GBZ2󰀁1󰀁2007)。血常规分析仪为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC-2200型血液细胞分析仪,根据GBZ68󰀁2008󰀁职业性苯中毒诊断标准󰀁进行职业病诊断。调查的数据全部输入Excel数据库。2󰀁结果

2󰀁1󰀁职业性有害因素检测

FVC线、打胶线噪声分别为81~82dB(A)、82~84dB(A);FVC线、打胶线粉尘浓度分别为3~5mg/m3、