IBV病毒培养

1、细胞复苏

（1）从罐中取出冻存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。

（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

（4）低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。

（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。

2、细胞培养

（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

（2）向瓶内加入胰酶少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

（3）置37℃孵箱下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

（4）吸出消化液，然后再加培养液，终止消化。

（5）吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。

3、病毒培养

（1）选长满单层的细胞，倒掉培养液。

（2）加入适量的病毒悬液

（3）置温箱中感作（吸附）45min-1h。

（4）取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。

（5）收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。

4、毒价测定

（1）在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

（2）将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。

（3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

（4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）

（5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

（6）结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法