摘要
在临床医学领域，肿瘤靶向的成像与治疗一直（已经成为）挑战性问题。在此，我们报告了肿瘤靶向中以透明质酸纳米颗粒（hanps）作为疏水性光敏剂，二氢卟吩E6（CE6）的载体用于光学成像及治疗。首先，通过胺化5β-胆烷酸化学偶联合成了自组装hanps，聚乙二醇（PEG），和黑洞quencher3（bhq3）的HA聚合物。第二，CE6很容易通过一个简单的透析方法导致CE6加载透明质酸纳米粒为hanps（CE6 hanps），其中在CE6加载效率高于80%.由此产生的新hanps表现出稳定的纳米结构在水下和快速吸收到肿瘤细胞。特别是新hanps迅速由透明质酸酶在肿瘤细胞胞浆丰富的退化，这可能使在肿瘤组织的细胞内释放CE6。静脉注射到荷瘤小鼠后，能有效地达到CE6 hanps肿瘤组织通过被动靶向机制和具体的输入通过受体介导的内吞作用基于HA和CD44的纳米颗粒之间的相互作用，肿瘤细胞，在肿瘤细胞表面的HA受体。
在激光照射，CE6被释放的纳米颗粒能产生荧光和单线态氧在肿瘤细胞，导致肿瘤生长的有效抑制。总体而言，它表明，CE6 hanps可以成功地应用于体内光动力肿瘤显像和治疗的同时。
关键词
光动力疗法；成像；肿瘤靶向；纳米粒子；透明质酸；二氢卟吩E6
1.景区简介
在肿瘤的诊断和治疗，最重要的一个挑战是提高成像和治疗剂[ 1 ]和[ 2 ]的目标特异性。
为了达到这个目的，肿瘤靶向给药系统已由生物医学研究者[ 3 ]备受关注。肿瘤的靶向成像系统将与最小的背景噪音[ 4 ]肿瘤组织提供增强的信号。 同时，肿瘤靶向药物输送系统可能会导致肿瘤的生长的一种有效抑制和减少在其他器官[ 5 ]的副作用。然而，它是难以发展的理想系统，因为有肿瘤在体内的肝、脾等[ 6 ]的reticuloendothelrial系统针对许多障碍。
在过去的十年中，大量的纳米粒子已被开发用于在体内肿瘤靶向显像剂或药物[ 7 ]和[ 8 ]。在我们的研究组，透明质酸纳米粒子（hanps）已被研究用于肿瘤治疗和成像由于其肿瘤靶向体内[ 9 ]和[ 10 ]能力。
它已被证明，全身给药后，他们能够有效地实现基于增强渗透和保留肿瘤部位（EPR）效应以及主动靶向机制通过HA HA受体CD44结合，在肿瘤细胞[ 11 ]和[ 12 ]表示。
此外，CD44已收到作为肿瘤治疗的靶受体由于化疗或放疗的[ 13 ]和[ 14 ]在癌症中起着举足轻重的作用的干细胞样细胞和阻力。hanps的另一个独特的特点是，它们可以通过透明质酸酶在肿瘤细胞胞浆丰富迅速降解，这可能使内货物[ 15 ]和[ 16 ]快速释放。
我们还表明，肿瘤靶向性的hanps可以通过聚乙二醇（PEG）化学偶联的优化，这可能有助于逃避肝[ 17 ]意想不到的积累。hanps的这些特点使其可以在显像剂或药物的体内肿瘤靶向递送。
在这里，我们假设hanps可以作为肿瘤靶向递送系统光敏剂的光动力成像（PDI）和光动力疗法（PDT）。由于光敏剂能产生荧光成像和单重态氧治疗同时照射时，它可能是有用的作为联合诊断和治疗[ 18 ]和[ 19 ] theragnostic系统。
为了这个目的，hanps被进一步改性聚乙二醇（PEG）和黑洞quencher3（bhq3），和疏水性光敏剂，二氢卟吩E6（CE6）被加载到这些纳米粒子在CE6加载透明质酸纳米粒子（CE6 hanps）。
此后，我们评估CE6的释放，其dequenching行为，并从CE6 hanps透明质酸酶的在肿瘤细胞胞浆丰富，产生单线态氧的存在。肿瘤细胞的特异性荧光，CE6 hanps生成单线态氧也被证明在细胞成像和细胞活性测定。此外，在体内的肿瘤靶向显像和CE6 hanps疗效均使用荷瘤小鼠模型的评价。
2.材料和方法
2.1 材料
透明质酸钠（MW = 2.34ⅹ105 DA）是从Lifecore Biomedical公司购买（查斯卡，美国）。5β-胆烷酸，盐酸1-乙基（3-二甲氨基）碳二亚胺（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），N，n-dimethyl-4-nitrosoaniline（RNO），组氨酸，二甲基亚砜（DMSO），四氢呋喃（THF），和噻唑蓝（MTT）是从西格玛奥德里奇公司购买（St.路易斯，钼，美国）。
单甲氧基聚乙二醇胺（MW = 5ⅹ103 DA）是从lysan生物公司获得（阿拉巴马州，美国）。黑洞quencher3胺（bhq3）购自biosearch技术公司（诺瓦托，美国），和二氢卟吩E6（CE6）是从前沿科学公司获得（洛根，美国）。透明质酸
酶（Hyal-1，240 n.f.u／mg）购自TCI（东京，日本）。
台盼蓝溶液为Gibco公司产品（大岛，NY，USA）。所有其他化学品分析级和使用无需进一步纯化。HT29人结肠癌细胞和NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞从美国典型培养物保藏中心购买（rochkville，MD，USA）
2.2 加载的透明质酸纳米粒的制备CE6（CE6 hanps）
两亲性聚乙二醇化的HA缀合物的合成使用HA，胺化5β-胆烷酸，和胺官能化的PEG先前所描述的[ 17 ]。经透析各合成步骤后都是产品，它是用1H NMR确认（unityplus300，瓦里安，CA，USA）。胺化bhq3是共轭这些缀合物如下。 聚乙二醇化的HA结合物（20毫克）溶解在5毫升的1:1（v／v）的DMSO /水溶液，然后混合与NHS（1.3毫克）和EDC（0.8毫克）。胺化bhq3（2.4毫克）在1毫升的DMSO溶液缓慢加入。剧烈搅拌后24小时，在室温下，溶液经透析对甲醇和蒸馏水使用透析管三天（MW截止= 12 kDa的14 kDa–，谱®，牧场多明尼贵兹，CA）和冻干得紫色粉末。
最终产品的化学结构改造，还用1H NMR分析。5β-胆烷酸，聚乙二醇的特征峰，与HA含量在0.6–1.8 ppm时，3.6 ppm的，和2 ppm，分别，和集成的峰值比进行了计算，如前所述，[ 17 ]。
CE6加载到hANP使用一个简单的透析方法。总之，预定量CE6（2–8毫克）为1∶1毫升（V／V）四氢呋喃/蒸馏水慢慢加入hANP（20毫克）溶解在相同的共溶剂4毫升。此后，溶液处理三次，每次1分钟使用一个探针式sonictor（vcx-750，超音速和材料，CT，USA）和透析6小时的透析膜对水的使用（MW = 12 kDa的–截止14 kDa的）。过滤0.8μM注射器过滤器除去卸载CE6后，溶液的冻干得到绿色粉末，CE6 hANP。
2.3 CE6 hanps表征
利用紫外可见光谱测定–共轭bhq3量和加载CE6在CE6 hanps（g1103a，安捷伦，USA）通过测量在405 nm处的吸光度（λ= MAX CE6）和630 nm（λ=最大，分别bhq3）。溶解在1:1的所有样品制备（V／V）的DMSO /蒸馏水和基于标准的自由bhq3和CE6曲线分析。通过动态光散射测量CE6 hanps粒度分布（DLS，90加，布鲁克海文仪器公司，美国），样品溶解在PBS（pH 7.4，1毫克/毫升）和超声处理5分钟用探头式超声波发生器（vcx-750，超音速和材料）在180 利用透射电子显微镜观察了CE6 hanps形貌（TEM，飞利浦cm30）在加速电压200拦截器。TEM图像，样品分散在蒸馏水和落在200目铜网。所有样品用1%醋酸铀
负染色。
2.4 体外Ce6释放试验
确定CE6纳米粒子释放行为，CE6 hanps分散在PBS（pH 7.4，1毫克/毫升）和无Hyal-1 120单位/毫升。分散CE6 hanps溶液转移到透析膜管（MW截止= 100 kDa的）。由此产生的管放置在20毫升0.1%的PBS（w／v）Tween80设置CE6沉状态并轻轻摇动150转37°C水浴中以在预先确定的时间点新鲜的培养基中的变化。测定释放量从1毫升静脉纳米颗粒，释放介质是在预定的时间点和二甲基亚砜（在介质基1重量/体积%）加入。CE6浓度采用UV–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
2.5。在荧光猝灭和dequenching体外测量
对荧光猝灭和dequenching ce6-q-p-hanps，他们分散在PBS（pH 7.4，37°C）和无Hyal-1 120单位/毫升，每个样品加载到4-face透明石英比色皿。用荧光分光光度计得到CE6的荧光强度（F-7000，日立，东京，日本）。在不同浓度的Hyal-1的CE6的荧光图像，使用12位CCD相机观察（柯达影像工作站4000mm，纽黑文，CT，USA）。在感兴趣的区域总荧光强度（每1450像素的ROI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
2.6。单线态氧的生成体外测量
定量评价采用优化作为单线态氧传感器[ 20 ]是从CE6的单线态氧的生成。免费CE6（100μμg／ml）和CE6 hanps（100μ克/毫升CE6）在200μL 1%的DMSO溶液在蒸馏水被添加到3.8毫升蒸馏水含有5.58毫克的组氨酸和0.377μ克的优化和无Hyal-1 120单位/毫升。然后，每个解决方案是位于1毫升的石英比色皿，用671 nm的He-Ne激光照射（DPSS 671 nm的红色激光，i-nexus，Inc.）。使用在405 nm的紫外可见光谱–作为时间的函数的测量的吸光度的RNO。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
2.7。细胞成像
HT29和NIH3T3细胞在RPMI1640培养液中培养，DMEM培养液（Gibco，大岛，NY，USA）在37°C的CO2培养箱中含10%胎牛血清和1%青霉素，链霉素。确定Ce6s细
胞摄取，HT29细胞和NIH3T3细胞（1×105细胞/孔）接种到6孔板稳定24小时为竞争性抑制作用的研究中，8毫克/毫升HA聚合物共CE6 hanps对HT29细胞治疗。荧光图像，使用12位CCD相机观察，和总荧光强度的计算上述。利用紫外可见光谱–作为时间的函数。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
为了获得高分辨率的细胞图像，HT29细胞和NIH3T3细胞（1ⅹ105细胞/孔）接种到6孔培养板明胶涂层的滑盖，他们分别用无血清培养基中含有游离CE6或CE6 hANP（20μ克/毫升的自由CE6）在37°C在二氧化碳培养箱中培养5–30分钟。然后将细胞用Dulbecco PBS洗两次（DPBS）固定在4%多聚甲醛溶液。4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）后安装，HT29和NIH3T3细胞，激光共聚焦显微镜观察使用（fv10i，奥林巴斯，美国）。计算方法为上述类型。利用紫外可见光谱–作为时间的函数。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
2.8。细胞活力检测
确定在黑暗条件下的细胞存活率，HT29和NIH3T3细胞（1×104细胞/孔）接种到96孔板，培养24小时后细胞稳定，将培养基替换为200μL的无血清培养基中含有游离CE6或CE6 hanps（0–20μg/mL CE6）其次，温育30分钟，在37°C.然后将细胞用无血清培养基和细胞活力，MTT评估洗两次assay.ere使用激光共聚焦显微镜观察（fv10i，奥林巴斯，美国）。计算方法为上述类型。利用紫外可见光谱–作为时间的函数。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
检测细胞活性激光照射后，HT29细胞和NIH3T3细胞接种于96孔板（1ⅹ104细胞/孔），采用无血清培养基或自由CE6 CE6 hanps（0–20μg/mL CE6）。孵育30分钟后，将细胞洗涤两次无血清培养基，用671 nm的He-Ne激光照射（100 mW/cm2的）0–4分钟到96孔板中。孵育6小时后，用MTT法检测细胞增殖能力。T assay.ere观察使用激光共聚焦显微镜（fv10i，奥林巴斯，美国）。计算方法为上述类型。利用紫外可见光谱–作为时间的函数。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
观察死细胞，台盼蓝染色在6孔板的细胞进行（1ⅹ105细胞/孔）。激光照射2分钟后，这两种细胞洗两次DPBS和0.5毫升的台盼蓝溶液处理（0.4%磷酸盐缓冲液，pH值7.4）5分钟，溶液洗净，用不同的三倍，与细胞固定用4%多聚甲醛溶液。利用光学显微镜观察死细胞（显微镜，奥林巴斯，USA）。他MTT法检测T
assay.ere观察。用激光共聚焦显微镜（fv10i，奥林巴斯，美国）。计算方法为上述类型。利用紫外可见光谱–作为时间的函数。OI）是柯达MI软件计算（纽黑文，CT，USA）的浓度。静脉使用紫外–可见光谱仪通过测量在405 nm处的吸光度分析，
2.9。在体内和体外荧光成像
所有实验动物均符合相关的法律和制度的韩国科学技术研究所的指导方针（KIST），和机构的委员会已经批准的实验。
观察静脉分布在动物模型中，荷瘤裸鼠（4.5-weeks老，20–25克，雄性）接种在生理盐水1ⅹ107 HT29细胞悬浮液制备（60μL）在小鼠左侧面。
当肿瘤生长到约250–500立方毫米的体积，200μL PBS中含有的游离CE6或CE6 hanps（5毫克/公斤CE6）分别注入小鼠尾静脉（N =每组3）。
在体内的分布进行成像使用CE6 OptiX体系的探讨670 nm脉冲激光二极管（艺术高级研究技术有限公司，蒙特利尔，加拿大）[ 21 ]。
观察CE6器官分布，制备了一组小鼠用相同的程序处理（N = 3每组）。然后他们在注射后24小时处死，和主要器官和肿瘤切除和由柯达影像观测（柯达影像工作站4000mm，纽黑文，CT，USA）[ 22 ]。
所有的近红外荧光（NIRF）使用分析工作站软件计算了强度（艺术高级研究技术有限公司，蒙特利尔，加拿大）。
2.10。在体内光动力疗法和组织学
制备了以相同的方式作为上述荷瘤小鼠模型。当肿瘤生长到55±10立方毫米的体积，200μL PBS盐水，含游离CE6或CE6 hanps分别注入小鼠尾静脉（N =每组4）。在4小时和24小时后注射，肿瘤组织是由671 nm的He-Ne激光照射（100 mW/cm2的）30分钟
照射后，每一组的治疗结果的12天测量肿瘤体积评估。组织学分析，肿瘤组织切除从小鼠在注射后12天，他们用2%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋。肿瘤组织切片（6μM）苏木精和曙红染色（H&E）和光学显微镜观察。0分钟
2.11。统计
实验组和对照组，分别采用单因素方差分析和统计学意义分析之间的差异（标有星号（∗）在数字）如果P＜0.05。
3。结果与讨论
3.1。和hanps CE6的制备表征
图1显示了我们的四步策略在体内成像和使用CE6 hanps光动力肿瘤靶向给药系统治疗。首先，CE6 hanps可以有效地达到目标肿瘤组织由EPR效应的稳定的纳米结构的全身给药后[ 11 ]。
第二，他们可以很容易地被肿瘤细胞通过CD44受体介导的内吞作用。第三，加载CE6可以释放纳米粒子通过HA主链降解的透明质酸酶丰富的肿瘤细胞的细胞质中的[ 23 ]。
最后，释放CE6可以收回荧光肿瘤成像和激光照射后集中于肿瘤部位产生单线态氧的肿瘤治疗。这些措施是合理设计提高PDT的特异性。
图1。和肿瘤靶向含CE6透明质酸纳米表征发展（CE6 hANP）的光动力治疗学。（一）CE6 hANP示意图
作为肿瘤靶向递送系统同时光动力治疗学。（b）hANP的化学结构。（c）二氢卟吩E6的化学结构
（CE6）作为光敏剂。（D）的尺寸分布的CE6 hANP通过动态光散射（DLS）。（E）透射电子显微镜（TEM）CE6 hANP图像。
合成了疏水性5β-胆烷酸基团的共轭的亲水性的HA骨干hanps，和他们进行进一步的修改，随着PEG适量先前所描述的[ 17 ]。在这项研究中，bhq3是另外的共轭hanps因为它能有效淬灭荧光分子如CE6 [ 24 ]和[ 25 ]。由此产生的共轭，图1B所示，可以自组装成纳米粒子在水条件下由于其两亲性。确定为227.1±12.5 nm的平均粒径，采用DLS测定。hanps的特性如表1所示。
表1。
hANP的特性。 一个
重量平均分子量，用凝胶渗透色谱（GPC）测定。 B
摩尔比对HA糖残基，从1H NMR谱估计。 C
HA糖残基的摩尔比，用紫外可见光谱估计。 D
利用动态光散射（DLS）测量。
作为光敏剂，CE6在本研究中选择由于其高的单线态氧的量子产率和吸收/发射波长在近红外区域的相对有效的组织渗透（图1C）[ 26 ]和[ 27 ]。CE6很容易通过简单的透析方法加载。在CE6 10%投料比，装载效率为84.1%，但下降到61.9%，在20%的投料比（表2）。此外，它是低于30%的饲料比在50%（数据未显示）。
因此，我们使用CE6 hanps 10% CE6进料比的进一步研究。CE6 hanps大小为250.7±13.6 nm，表明通过加入CE6的hanps略有增加的粒径（图1d）。它们的大小和球形形状也由TEM图像证实（图1E）。这粒径，小于300纳米，被证明是有利于通过EPR效应[ 28 ]与肿瘤组织血管结构有较高的积累。 表2。
在CE6加载CE6 hANP特性。 一个
重料比hANP。 B
CE6在CE6 hANP重量含量，采用紫外可见光谱估计。 C
利用动态光散射（DLS）测量。
3.2。释放行为和CE6 CE6 hanps从单线态氧的产生
CE6从CE6 hanps释放模式进行评价或无Hyal-1是肿瘤细胞的细胞质中有代表性的透明质酸酶起着举足轻重的作用，在HA翻转[ 29 ]。如图2a所示，CE6的释放速率在Hyal-1存在高很多，这表明CE6 hanps能迅速释放CE6在肿瘤细胞胞浆由
于CE6 hanps HA主干是Hyal-1 [ 30 ]和[ 31 ]高度敏感的。
图2。透明质酸酶（Hyal-1）体外释放和触发CE6 CE6 hANP的单线态氧的产生。（一）没有Hyal-1
CE6 hANP或释放（120单位/毫升）。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。（b）治疗Hyal-1后的自由CE6和CE6 hANP荧光图像。（C）荧光强度（b）。（d）产生单线态氧和自由CE6 CE6 hANP带或不带Hyal-1（120单位/毫升）。∗表明差异在P＜0.05的显著性水平。0 ]和[ 31 ]。
观察dequenching效应在不同浓度的Hyal-1自由CE6和CE6 hanps荧光信号（图
2B）。正如预期的那样，自由CE6表现出强的荧光信号，而在不同浓度Hyal-1发现在强度无显著变化。CE6 hanps荧光强度在Hyal-1没有比自由CE6要低得多，这是由于bhq3在CE6 hanps和自猝灭。它注意，CE6 hanps荧光强度随着浓度的增加提高了Hyal-1是利益（图2C）。在Hyal-1 120单位/毫升，CE6 hanps荧光强度相媲美的自由CE6。这是由于dequenching CE6的快速释放纳米粒子。 光敏剂产生单线态氧对肿瘤细胞的杀伤激光照射后，和单线态氧的量可以通过测量的吸光度的减少（RNO分析单线态氧传感器）[ 20 ]。图2显示的优化浓度作为时间的函数，在不同的条件。在Hyal-1缺席的情况下，从hanps CE6的单线态氧的生成率明显低于自由CE6。这表明，bhq3纳米粒子能有效的光敏剂产生单线态氧的抑制。另一方面，从CE6 hanps生成单线态氧存在Hyal-1快得多，这意味着治疗能快速恢复的酶在肿瘤cells.enching CE6丰富的快速释放纳米粒子。
3.3。细胞摄取和细胞内荧光产生hanps CE6
接下来，我们观察到的特定的吸收和dequenching CE6 hanps在肿瘤细胞通过荧光的细胞成像。NIH3T3细胞和HT29作为正常的组织细胞及肿瘤细胞株，分别。如图3a所示，观察到在HT29细胞比在NIH3T3细胞孵育后，较强的荧光hanps CE6。在30分钟的潜伏期，CE6在HT29细胞的荧光强度比在NIH3T3细胞高4.1倍（图3b）。Zer。另一方面，从CE6 hanps生成单线态氧存在Hyal-1快得多，这意味着治疗能快速恢复的酶在肿瘤cells.enching CE6丰富的快速释放纳米粒子。
在自由CE6的情况下，两个细胞系之间的差异是可以忽略不计的荧光。应该强调的是，CE6在HT29细胞的荧光强度显著降低，当CE6 hanps与游离HA过量孵化，表明特定的吸收CE6 hanps进入肿瘤细胞的基础上结合的纳米粒子，CD44。激光共聚焦显微镜和DAPI染色后，细胞摄取更精确地观察到细胞内分布的CE6。图3c，CE6 hanps快速吸收在HT29肿瘤细胞显示，其中加载CE6被释放，产生的荧光。E Hyal-1，暗示治疗能快速恢复的酶在肿瘤cells.enching CE6丰富的快速释放纳米粒子。
从CE6 hANP CE6红色斑点在细胞质中广泛传播。因为光动力疗法的主要目标是在细胞质中的主要细胞器，这意味著CE6 hanps治疗效果可能不会被意外的细胞内分布[ 32 ]。
图3. CE6 hANP细胞成像。（一）对NIH3T3细胞和游离CE6和CE6 hANP培养板处理的HT29细胞的荧
光图像。（b）荧光强度（一）。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。（C）共聚焦显微图像的NIH3T3细胞和HT29细胞治疗免费，CE6 hANP CE6。
3.4。近红外激光触发的细胞毒性
光敏剂在无光的情况下不能表现出细胞毒性，而产生单线态氧治疗与适当的照射波长[ 18 ]。正如预期的那样，自由CE6和CE6 hanps显示在HT29和黑暗条件下NIH3T3细胞毒性可以忽略不计，并用MTT法显示
图4. 近红外激光的光毒性CE6 hANP。（一）自由CE6在黑暗条件下细胞CE6 hANP治疗细胞活力。（b）
激光照射后自由CE6和CE6 hANP处理的细胞的细胞活力。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。（C）台盼蓝染色图像自由CE6和CE6 hANP治疗的细胞激光照射后。
（图4A）。因为使用HA在人体发现制备hanps，他们没有表现出对细胞活力的负面影响。然而，与671nm的He-Ne激光照射后，活细胞数显著降低（图4B）。在自由CE6的情况下，光毒性的程度是相似的在两个HT29和NIH3T3细胞。相反，CE6 hanps做具体损伤肿瘤细胞。对于CE6 hanps处理的HT29细胞的存活率低于10%，一个2分钟的照射后的近红外激光。然而，超过70%的NIH3T3细胞，治疗与CE6 hanps，生存在相同的条件下。这一结果表明CE6 hanps激光光毒性是肿瘤细胞的特异性，这是与在细胞成像结果一致。有趣的是，CE6 hanps对癌细胞的光毒性明显高于游离CE6，这可能是由于特定的细胞摄取和快速从纳米Ce6释放。这在临床上是很重要的，因为许多纳米载体具有较低的疗效在细胞的条件比游离药物补偿用于药物的缓释[ 33 ]。 CE6 hanps这种肿瘤细胞特异性毒性也被证明在台盼蓝染色[ 34 ]。台盼蓝是一种染料，不能传递到活细胞的细胞质中，而它是定位在受损或死亡的细胞膜透性。因此，它的蓝色的颜色是一个指标，细胞损伤和膜的破坏。根据MTT结果，强烈的蓝色斑点在CE6 hANP处理HT29肿瘤细胞的激光照射后显示，相比于NIH3T3细胞和游离CE6处理的HT29细胞。此外，竞争性的细胞摄取证明CE6 hanps吸收机制是基于受体过度HA共治疗后没有观察到这些景点（CD44）介导的内吞作用。
3.5. 在体内光动力成像
光敏剂可以产生治疗同时照射成像和细胞毒性的单重态氧荧光。因此，光敏剂固有荧光可以评估通过使用非侵入性的光学成像技术及其在体内的分布，和他们的肿瘤靶向递送可以标记的位置和整个身体[ 20 ]肿瘤组织的面积。图 图5显示荧光图像的荷瘤小鼠全身给药后自由CE6和CE6 hanps。结果表明，CE6 hanps有效地积累在肿瘤组织，比较自由CE6。CE6 hanps注射后四小时，肿瘤部位发出强烈的荧光和容易划定从周围组织证明PDI的可能性。此外，大多数CE6分泌的小鼠体内注射后48小时在自由和hanps CE6 CE6。 这意味着CE6 hanps几乎可以免费从意想不到的毒性的治疗后剩余的光敏剂，这是纳米颗粒制剂治疗的潜在缺点。CE6在CE6 hanps肿瘤组织的总光子数比静脉注射后4小时免费高约2.6倍（图5B）。
体外荧光图像的离体器官和肿瘤也证实了CE6 hanps肿瘤靶向给药（图5C）。对于CE6 hanps，最强的荧光信号在肿瘤组织器官，包括肝，脾和肾脏中发现的。然而，在自由CE6治疗的小鼠，最强的信号被发现在肝脏。随着CE6 hanps切除肿瘤的荧光强度比自由CE6高1.8倍后24 h（图5D）。
。在肾脏中的高强度也被观察到在CE6 hanps小鼠。我们认为这不是一个严重的问题，因为肾脏是主要的排泄器官和过滤的分子是由尿[ 35 ]迅速从体内清除。
图5. 在体内成像和光动力CE6 hANP。（一）人荷瘤小鼠全身荧光图像处理与自由CE6和CE6 hANP。白色的圆圈显示肿瘤部位。（b）在肿瘤中的总光子数（个）。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。（C）的体外荧光图像的器官和肿瘤HT29后荷瘤小鼠注射后24小时免费CE6和CE6 hANP。（d）荧光强度（C）。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。
3.6 在体内的光动力疗法
在尝试评估的治疗潜力，我们注射生理盐水，自由CE6，和CE6 hanps（5毫克/公斤CE6）到HT29荷瘤小鼠经尾静脉。此后，所有小鼠肿瘤部位进行照射，利用近红外激光照射30分钟后，在肿瘤部位的小鼠CE6 hanps治疗有明显的出血性损
伤，这意味着肿瘤治疗有效（图6a）。从处理的小鼠自由CE6，发现肿瘤照射后部分损坏，再生后12天。该组织的图像，通过H&E染色得到的，也证明了新hanps高疗效（图6B）。
在CE6 hanps治疗小鼠中观察到大量的肿瘤组织的细胞死亡。然而，细胞死亡的生理盐水或自由CE6的小鼠是比较罕见的。治疗的效果也被三组：生理盐水，自由CE6治疗的小鼠肿瘤生长率的比较，与CE6 hanps（图6C）。
经过12天的免费CE6治疗的小鼠肿瘤大小为250毫米，这个值是59%的生理盐水处理的小鼠。另一方面，肿瘤生长受到抑制的成功hanps CE6。在CE6 hanps治疗的小鼠肿瘤的最终平均大小为120毫米，这是只有27%的生理盐水处理的对照组。此增强治疗效果来源于高积累和dequenching CE6 hanps在肿瘤组织，其次是单线态氧的照射旺盛的生产。总的来说，这些结果表明，CE6 hanps肿瘤光动力治疗是非常有用的。
图6. 在体内光动力疗法CE6 hANP。（一）图像的HT29治疗荷瘤小鼠自由CE6和CE6 hANP（5毫克/公
斤CE6）和激光照射。（b）组织学肿瘤组织图像的（一）染色后。（C）的时间依赖性肿瘤的生长率（一）。箭头表明辐照时间点。∗表明差异在P＜0.05的显著水平。
4. 结论
肿瘤靶向性含CE6透明质酸纳米粒子（CE6 hanps）在本研究中制备，并探索同时光动力治疗学。结果发现，CE6可以迅速释放CE6 hanps通过在肿瘤细胞胞浆丰富的透明质酸酶存在的HA主链降解。释放CE6是dequenched产生荧光和单线态氧在近红外激光照射。
CE6 hanps基于被动和主动靶向体内成像的非侵入性的肿瘤靶向递送证明。在荷瘤小鼠模型，CE6 hanps可以有效地抑制肿瘤的生长相比，自由CE6。总之，CE6 hanps可以成功地应用在体内成像和光动力癌症治疗，同时。
致谢
这项工作是由财政支持的全球研究实验室（GRL）项目，融合技术项目（2009-0081876），和基础科学研究项目（20100027955和20100015804）的网格，和校内研究计划（theragnosis）的盒子。
工具书类
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