拟南芥花粉表面蛋白基因T—DNA插入突变体的鉴定

第３９卷第２期　２　０　１　０年４月　上海师范大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　Ｖｏ１．３９．Ｎｏ．２　Ａｐｒ．，２　０１　０　拟南芥花粉表面蛋白基因Ｔ—ＤＮＡ　插入突变体的鉴定　易素华，张　丞，史志浩，杨仲南，张　森　（上海师范大学生命与环境科学学院，上海２００２３４）　摘要：花粉表面蛋白质（Ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＣＰｓ）是一类在被子植物进行繁殖生长过程中　起着重要作用的蛋白质．它们参与了花粉与柱头的－／￣３，１、黏附、水合等过程，直接影响花粉的萌　发能力．根据已经建立的拟南芥花粉表面蛋白数据库中的信息，从关国拟南芥生物资源中心购　买了有Ｔ—ＤＮＡ插入的ＳＡＬＫ株系种子，并对这些株系进行了Ｔ—ＤＮＡ插入位点的鉴定，实验　结果为进一步研究花粉表面蛋白质奠定了基础．　关键词：花粉表面蛋白；拟南芥；ＳＡＬＫ株系；Ｔ—ＤＮＡ　中图分类号：Ｑ９４３．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—５１３７（２０１０）０２－０２１３－０６　０　引　言　显花植物授粉是一个复杂的过程，雄配子体与柱头的识别以及与雌配子体的受精过程都受到严　格的调控¨］．作为雄配子体胞外的主要结构．花粉壁的组成成分在植物雄配子体与柱头的接触、识别　的过程中相互作用，是决定授粉成功与否的一个重要因素．成熟花粉壁由外壁和内壁构成，外壁主要　由孢粉素构成，能够抵抗不利的外界环境，对保护花粉起重要作用．内壁主要由果胶质和纤维素组　成　］．刚从花药中释放的花粉表面覆盖含油层的物质叫花粉外被（ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ），是花粉壁的重要组成　部分．目前普遍认为花粉外被来自于绒毡层的分泌物和绒毡层自身降解的残余物，相对于富含孢粉　素的花粉外壁，花粉外被则含有多种脂类、多糖、类胡萝卜素、类黄酮以及花粉表面蛋白　－４］．花粉外　被具有保护作用，防止花粉迅速失水而失活，吸引并辅助昆虫传粉，参与花粉的水合作用，介导花粉　与柱头的识别过程　．　花粉外被中的蛋白质对于花粉柱头的细胞识别过程至关重要，因此了解花粉表面蛋白质的组成是　研究授粉过程中细胞识别分子机理的基础．在拟南芥中，花粉外被中的蛋白质主要包括酯酶，富含甘氨　酸的含油体蛋白，钙离子结合蛋白以及受体激酶的胞外肽段等　Ｊ，通常这些蛋白都和信号传导有关，　因此这些蛋白可能在雌雄配子体的识别中起重要作用．目前，遗传分析表明脂质的合成和沉积与花粉粘　附柱头的过程相关，也找到了一些相关突变体　，但对花粉表面蛋白功能研究并不深入．　为给研究花粉表面蛋白质功能奠定基础，本研究根据已经建立的拟南芥花粉表面蛋白质数据库中　的信息（本实验室未发表结果），从美国拟南芥生物资源中心（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ：　收稿日期：２００９－０９－２９　基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１１２７）；上海市教委科研创新项目（０９ＹＺ１６８）；上海师范大学科研项目　（ＳＫ２００８２７）．　作者简介：易素华（１９８５一），女，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；张森（１９６３一），男，上海师范大　学生命与环境科学学院副教授．　通讯作者．　２１４　上海师范大学学报（自然科学版）　２０１０焦　ＡＢＲＣ）购买了１４２个Ｔ—ＤＮＡ插入株系，对其基因型和表型进行了鉴定，获得并证实了９４个Ｔ—ＤＮＡ　纯合插入的株系．　１材料与方法　１．１材料　１．１．１植物材料　拟南芥Ｔ—ＤＮＡ插入株系（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型）种子购自美国拟南芥生物资源中心（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏ—　ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ：ＡＢＲＣ），野生型拟南芥（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型）种子由本实验室保存．　１．１．２生物学试剂　ＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰｓ，琼脂糖等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；引物由Ｉｎ－　ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成．　１．２方法　１．２．１材料种植　拟南芥种子在０．１％的琼脂糖中４℃春化２—４　ｄ后培养在黑土：蛭石：珍珠岩（１：６：０．２５）的混合土　中．培养时先用营养液ＰＮＳ把土浇湿，并在其上层罩一层塑料膜以保持湿度，当拟南芥种子萌发出子叶　后去掉塑料膜．１６　ｈ光照，８　ｈ黑暗，湿度６０％～７０％，温度２２～２５℃，光照强度为５０　ｔｘＥｍ～・ｓ～．　１．２．２植株总ＤＮＡ的提取　研磨法提取拟南芥基因组ＤＮＡ，具体方法参照Ｚｈａｎｇ等方法　．　１．２．３　ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增　ＰＣＲ反应体系：Ｔａｑ酶０．３　Ｌ，　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　３　，ｄＮＴＰｓ　３　Ｌ，模板ＤＮＡ　１　Ｌ，正向引物Ｆ　ｌ　Ｌ，　反向引物Ｒ　１　ｔｘＬ，无菌水２１　，总体积３０　Ｌ，混匀后放人ＰＣＲ仪中进行反应．　ＰＣＲ反应条件：（１）预变性，９４℃，５　ｍｉｎ；（２）变性，９４℃，３０　Ｓ；（３）退火，６２℃，３０　ｓ，７２℃延伸　７０　Ｓ（从变性到延伸３５个循环）；（４）最后的延伸，７２℃，１０　ｍｉｎ．反应结束４℃保存．　１．２．４　ＰＣＲ产物的检测　检测ＰＣＲ产物一般利用１．５％的琼脂糖凝胶进行电泳，所用的电泳缓冲溶液为１×ＴＡＥ，所用的电　压为５　Ｖ／ｃｍ，用ＥＢ进行染色，ＰＣＲ产物点样量为１０　．电泳结果用Ｔａｎｎｏｎ　ＧＩＳ凝胶图像处理系统拍　照记录．　１．２．５　ＰＣＲ引物的设计　每个Ｔ—ＤＮＡ插入株系基因型的鉴定需要三条引物，分别是：ＩＪＰ，位于基因组上距离Ｔ—ＤＮＡ插入　位点左臂端６００　ｂｐ处；ＲＰ，位于距离Ｔ—ＤＮＡ插入位点右臂端３００　ｂｐ处；Ｔ—ＤＮＡ左臂端上引物ＬＢ１．３　（５　一Ａ，ＩｆＩＷＧｃｃＧＡＴＩＴＩ１ｃＧＧＡＡｃ一３　）．ＰＣＲ引物设计参照ＳＩＧＮＡＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａ１．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔｄｎａｐｒｉｍｅｒｓ．　２．ｈｔｍ１）相关资料．　２结果分析　２．１　ＰＣＲ引物设计　如图１所示，当用ＬＰ和ＲＰ这对引物进行ＰＣＲ扩增并进行电泳时，在野生型植株（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，　ｗＴ）和杂合子（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｌｉｎｅｓ，ＨＺ）植株中产生一条ＰＣＲ产物带，分子量大约是９００　ｂｐ，而纯合子　（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｌｉｎｅｓ，ＨＭ）植株中没有ＰＣＲ产物形成；当用ＲＰ和ＬＢ１．３这对引物ＰＣＲ扩增时，在野生　型植株中没有ＰＣＲ产物，而在杂合子植株和纯合子植株中均有一条ＰＣＲ产物带，分子量大小为４１０　＋Ｎｂｐ．　第２期　易素华，张丞，史志浩，等：拟南芥花粉表面蛋白基因Ｔ—ＤＮＡ插入突变体的鉴定　２１５　ＢＰｏｓ　（ａ）ＰＣＲ￣［物设计示意图　ｆｂ）电泳结果示意图　来源于ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａ１．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔｄｎａｐｆｉｍｅｒｓ．２．ｈｔｍｌ　图１　ＰＣＲ引物设计原理　２．２　Ｔ—ＤＮＡ插入位点鉴定结果　Ｔ—ＤＮＡ株系种子种下３—４周后，每个株系取１０　株，提取基因组ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增，每个株　系用一个野生型植株基因组ＤＮＡ作为对照模板．当分　别用ＬＰ、ＲＰ和ＲＰ、ＬＢ１．３这两对引物进行ＰＣＲ扩增　时，根据电泳结果（图２）可判断，除了作为对照的１泳　道，其他相邻的两个泳道中，当有两条分子量分别为　泳道１：ＬＰ＋ＲＰ￣Ｉ物，以野生型ＤＮＡ为模板扩增作为对照；　泳道２、４、６、８：ＬＰ＋ＲＰＺＪ］物，以突变体ＤＮＡ为模板扩增；　９００　ｂｐ和４１０＋Ｎ　ｂｐ的ＰＣＲ产物时，说明该植株在该　泳道３、５、７、９：ＬＰ＋ＬＢｌ＿３引物，以突变体ＤＮＡ为模板扩增；　位点有Ｔ—ＤＮＡ插入，而且是杂合子植株（如２和３、６　泳道２和３、４￣１３５、６和７、８：ｒ（Ｉ１９分别以同一个突变体ＤＮＡ为模板　和７泳道）；当只有一条分子量为４１０＋Ｎ　ｂｐ的ＰＣＲ　图２电泳结果图　产物时，说明该植株在该位点有Ｔ—ＤＮＡ插入，而且是纯合子植株（如４和５、８和９泳道）．通过一系列的　ＰＣＲ扩增和电泳结果分析，最后，得到了９４个纯合体株系（表１），并保存种子．　表１　１４２个Ｔ—ＤＮＡ株系经过ＰＣＲ鉴定后获得的９４个纯系　基因号　株系的ＳＡＬＫ号Ｔ—ＤＮＡ插入位点　基因号　株系的ＳＡＬＫ号Ｔ—ＤＮＡ插入位点　ＡＴ１　Ｇ０４４１０　ＳＡＬＫ－０５４１４６　＋２２６３，ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ５１０４０　ＳＡＬＫ＿０６４８２４　＋１６６７，ｅｘｏｎ　ＡＴ１ＧＯ７７５０　ＣＳ８４７４１３　＋６９６．ｅｘｏｎ　Ａ１３Ｇ６１１７７　ＳＡＬＫ　０４６５５６　＋２２７．ｅｘｏｎ　ＡＴＩ　Ｇ０８７００　ＳＡＬＫ－０３８４８７Ｃ　＋４８．ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ６１１８２　ＳＡＬＫ　１１８２８７　＋１１２．ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ１Ｇ１５４１５　ＳＡＬＫ＿ｏ１００２６　＋２９，ｅＸＯｌｌ　ＡＴ３　Ｇ６２２９０　ＳＡＬＫ－】３０６７０　＋２２０４，ｅｘｏｎ　ＡＴ１Ｇ２３２４０　ＳＡＬＫ１３９６５５Ｃ　＋５７３，ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ６２７１Ｏ　ＳＡＬＫ　０６９１００Ｃ　＋１２６７．ｅｘｏｎ　ＡＴ１　Ｇ２９２５０　ＳＡＬＫ００５３４８　—１０５．ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ４Ｇ０９７９５　ＳＡＬＫ一１３５３３４　＋１１６，ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ１Ｇ４９４９０　ＳＡＬＫ００４１１３　＋７４４，ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ１０５９５　ＳＡＬＫ＿０７１４７４　—１７１，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ１　Ｇ６０９８３　ＳＡＬＫ＿０６１３４４　—１５２，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ４Ｇ１　１７６０　ＳＡＬＫ＿００３３４２　＋７２３，ｅｘｏｎ　ＡＴ１　Ｇ６０９８７　ＳＡＬＫ＿０２０３０３　＋４２１，ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ１３０９５　ＳＡＬＫ＿０２４７３１　—４０７，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ１Ｇ６１０７０　ＳＡＬＫ一１３８４３１Ｃ　＋４５，ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ１５７３３　ＳＡＬＫ＿０５４２２９　—２６６，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ１　Ｇ６２８２０　ＣＳ８００３９５　＋１４６．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ１９０３５　ＳＡＬＫＯ６００５　１　＋５０９，ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴｌ　Ｇ６５９３０　ＣＳ８３３６０１　＋３８．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ１９９０５　ＳＡＬＫ－０４６８５６　＋１５７，ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ１Ｇ７０４９０　ＳＡＬＫ　１３１７９４　＋１１５７．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ２２１０５　ＳＡＬＫ＿０３５４９５　—３８４，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ１Ｇ７０７３０　Ｃ￥８０６３９２　＋１６７０．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ２２１　１５　ＳＡＬＫ＿０１４９９２　—４２５，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ１　Ｇ７３６１０　ＣＳ８３９６９４　＋３３５，ｉｎｔｍｎ　ＡＴ４Ｇ２７０２０　ＳＡＬＫ　００４８１６Ｃ　＋１２４．ｅｘｏｎ　ＡＴ１　Ｇ７５８８０　ＳＡＬＫ－Ｄ２４３２３Ｃ　＋３３０．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ２９２９０　ＳＡＬＫ＿０４４５５３　＋５６，ｅｘｏｎ　ＡＴ１　Ｇ７５８９０　ＳＡＬＫ１２１７２４　０，ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ３００７４　ＳＡＬＫ　１０５１３２　＋２６６．ｉｎｔｒｏｎ　２１６　上海师范大学学报（自然科学版）　续表１　ＡＴ１Ｇ７５９２０　ＳＡＬＫ－０５７１１４　＋４０２，ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ３００７６　ＣＳ８０５４９６　—１７９，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴｌ　Ｇ７５９３０　ＳＡＬＫ０２０２４１　Ｃ　一８４．ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ４Ｇ３３４６５　ＣＳ８１２７３８　—１９７，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ａ，Ｉ２Ｇｏ２１５０　ＣＳ８１６７０８　＋７９０．ｅｘｏｎ　ＡＴ４Ｇ３９９１７　ＣＳ８４３３４１　—３６４，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ２Ｇ２０２０８　ＳＡＫＫ＿０５２９５７　—３６５，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５ＧＯ３６９０　ＳＡＬＫ　１２４０５０　＋１４．ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ２２１２１　ＳＡＬＫ－０４３３７６　—２４５，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ａ＿ｒ５ＧＯ４８８５　ＳＡＬＫ　０６５０８１　＋１２０．ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ２２３４５　ＳＡＬＫ－０９２２０５　—５７，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５ＧＯ７４６０　ＳＡＬＫ　１０６１１８Ｃ　＋１０１５．ｅｘｏｎ　ＡＩ２Ｇ２５３４４　ＣＳ８４０３６３　＋４５．ｅｘｏｎ　ＡＴ５ＧＯ７４７０　ＳＡＬＫ　０３２８２３Ｃ　＋１３０２．ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ２８３５５　ＳＡＬＫ＿０４５９１６Ｃ　＋５００．ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ５Ｇ０７４７５　ＣＳ８２４８０８　＋３７７．ｉｎｔｒｏｎ　Ａ１２Ｇ２９Ｏ４５　ＳＡＬＫ一１４２１９５　＋１０５，ｉｎｔｒｏｎ　Ａ２＂５ＧＯ７４８０　ＳＡＬＫ　０５２６２１　＋１９５７．ｅｘｏｎ　Ａ他Ｇ３３６４０　ＳＡＬＫ－０３４８３３　＋１９３７．ｅｘｏｎ　ＡＴ５　Ｇ０７４９０　ＳＡＬＫ＿（）６７２０２　—６，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ２Ｇ３６４６０　ＳＡＬＫ＿１　１８０６７　～１４３，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５ＧＯ７５００　ＳＡＬＫ　０４２３６５　＋８７．ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ３７６２０　ＳＡＬＫ０９３０２３Ｃ　＋９９８．ｅｘｏｎ　Ａ　ｒ５ＧＯ７５６０　ＳＡＬＫ　０２６０７７　＋６１９．ｅｘｏｎ　Ａ１２Ｇ４１ｏｏ０　ＳＡＬＫ－０４９４０９Ｃ　＋２６０．ｅｘｏｎ　ＡＴＳＧＯ７５９０　ＳＡＬＫ＿０３３７７１　＋１９８，ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ４２１００　ＳＡＬＫ１４４９３１　＋４５０，ｅｘｏｎ　ＡＴ５ＧＯ７６２０　ＳＡＬＫ－０３９４３９　—３８０，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ａ　Ｔ２Ｇ４２１７０　ＳＡＬＫ一１４３４６７　＋１２２７，ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ１９８８０　ＳＡＬＫ　００８４５５　＋８６，ｅｘｏｎ　ＡＴ２Ｇ４７４７０　ＳＡＬＫ＿０９７０９４　～３００，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５Ｇ２０９４０　ＣＳ８０４５５１　＋６９４．ｅｘｏｎ　Ａ　Ｉ２Ｇ４７５ｌ０　ＳＡＬＫ＿０８０８０９　＋４５．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ３８７６０　ＳＡＬＫ　０２３５８２　＋４８９．ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ３Ｇ０２４８０　ＳＡＬＫ一１４５３４１　＋６８２，ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４２２２３　ＳＡＬＫ　０８８９６８　＋３１３．ｅｘｏｎ　ＡＴ３ＧＯ３６７０　ＳＡＬＫ０７６１９４　＋４６２．ｉｎｔｒｏ　ＡＴ５Ｇ４２２４２　ＳＡＬＫ　１２８３１６　＋３２４．ｉｎｔｒ０ｎ　Ａ　Ｉ　Ｇ０７８５０　ＳＡＬＫ＿０５７３８０　＋１１　Ｉ　Ｉ．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４２７９７　ＳＡＬＫ　０３５６９１　＋２６．ｅｘｏｎ　ＡＴ３ＧＯ８５３０　ＳＡＬＫ１５１６３８　＋２０３．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４５８７５　ＳＡＬＫ　０８９０６３　＋３４４．ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ１　ｌ　１３０　ＳＡＬＫ１０４４３３　—６０，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５Ｇ４７０３０　ＣＳ８０９５９５　—３１４，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ３Ｇ１７９４０　ＳＡＬＫ＿０５０９３５　＋７７．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４７０７５　ＣＳ８０２５９４　—２５，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ａ３３Ｇ１８７８０　ＳＡＬＫ－０４８９８７Ｃ　＋１４３５．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４７０７７　ＳＡＬＫ１３０２８２　—２５６，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ３Ｇ２０９９７　ＳＡＬＫ＿０３４３１０　～１３４，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５Ｇ４７１７５　ＳＡＬＫ　０６９８１６　＋２３５．ｅｘｏｎ　Ａ　Ｉ．３Ｇ２２９５０　ＳＡＬＫ－０２７９７５　＋３９９．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ４８５４３　ＳＡＬＫ　０４６６４６　＋１０５．ｉｎｔｒｏｎ　ＡＴ３Ｇ２３１６５　ＳＡＬＫ＿０５ｌ１１９　—５０．ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＡＴ５Ｇ６１５７０　Ｃｓ８１４８９０　＋３６３．ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ２５２６５　ＳＡＬＫ＿０２５Ｏ４３　＋３１４．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ６１５９０　ＳＡＬＫ＿０１５１８２Ｃ　＋５１４，ｅｘｏｎ　ＡＴ３Ｇ４６５２０　ＳＡＬＫ＿０５２７０９Ｃ　＋６１５．ｅｘｏｎ　ＡＴ５Ｇ６１６４０　ＣＳ８０１５３２　＋１３３．ｅｘｏｎ　Ａ１１３Ｇ５１０３０　ＳＡＬＫ－ｏ４４５７８　＋９９８，ｅｘｏｎ　Ａ＿ｒ５Ｇ６２２４２　ＳＡＬＫ　１２３６５３　＋１１０３．ｅｘｏｎ　说明：以每个基因序列起始密码子ＡＴＧ的碱基Ａ作为序列１，位于ＡＴＧ上游的Ｔ—ＤＮＡ位点记为“一”值，位于ＡＴＧ下游的Ｔ—　ＤＮＡ位点记为“＋”值　２．３纯合体株系分析以及基因在拟南芥染色体上的分布　在获得的９４个纯合株系基因中有３１％（２９／９４）属于富含半胱氨酸的花粉包被蛋白（ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ），另有３个富含半胱氨酸的ｓ一位点蛋白．这些蛋白可能参与到花粉和柱头的识别交联过程．此　外，还有一些含油体蛋白及激酶，这些蛋白通常都具有信号传导的功能．然而，所有Ｔ—ＤＮＡ纯合株系的　生殖生长都没有出现可见表型．　利用ＴＡＩＲ（ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）网站的染色体绘图工具（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｍａｐ　Ｔｏｏ１），将９４个　纯合体株系基因定位在拟南芥５条染色体上（图３）．从图３中可以看出，９４个基因中有２０．２％的基因　分布在第一条染色体上，第二和第四条染色体上均有１６．０％的基因分布，且在这两条染色体的短臂上　基本上没有基因分布，第三条染色体上有１９．１％的基因分布，而第五条染色体上分布的基因最多，有　２８．７％．　第２期　易素华，张丞，史志浩，等：拟南芥花粉表面蛋白基因Ｔ—ＤＮＡ插入突变体的鉴定　２１７　２　４　５　ｒ２Ｇ０２ｌ５Ｏ　１Ｇ０４４ｌ０　ＡＴ５Ｇ０３６９０　ＡＴ５ＧＯ４８８５　１Ｇ０７７５０　ＡＴ５ＧＯ７４６Ｏ　１Ｇ０８７００　ＡＴ５Ｇ０７４７０　ＡＴ５Ｇ０７４７５　ＡＴ５Ｇ０７４８０　ＡＴ５Ｇ０７４９０　ＡＴ５Ｇ０７５００　１Ｇ１５４ｌ５　ＡＴ５Ｇ０７５６０　ＡＴ４Ｇ０９７９５　ＡＴ５Ｇ０７５９０　ＡＴ４Ｇ１　０５９５　ＡＴ５Ｇ０７５２０　ＡＴ４Ｇ１１７６０　ＡＴ５Ｇ１　９８８０　ＡＴ４Ｇ１３０９５　ＩＴ５Ｇ２ＯＯ４０　ｌＧ２３２４０　ＡＴ２Ｇ２０２０８　ＡＴ４Ｇ】５７３３　ＡＴ２Ｇ２２１２１　５Ｇ２０Ｏ４２　１Ｇ２９２５０　ＡＴ２Ｇ２２３４５　蛆＇４Ｇ１９０３５　ＡＴ２Ｇ２５３４４　ＡＴ４Ｇ１９９０５　ＡＴ２Ｇ２８３５５　Ａ：ｒ４Ｇ２２１０５　ＡＴ２Ｇ２９Ｏ４５　ＡＴ４Ｇ２２ｌｌ５　ＡＴ４Ｇ２７０２０　ＡＴ２Ｇ３３６４Ｏ　ＡＴ４Ｇ２９２９０　ＡＴ２Ｇ３６４６０　ＡＴ４Ｇ３００６７　４Ｇ３００７４　ＡＴ２Ｇ３７６２０　ＡＴ５Ｇ３８７６０　４Ｇ３３４６５　Ａ＝ｒ２Ｇ４１０００　ＡＴ５Ｇ４２２２３　ＡＴ２Ｇ４２１００　ＡＴ５Ｇ４２２４２　１Ｇ４９４９０　ＡＴ２Ｇ４２１７０　ＡＴ５Ｇ４２７９７　ＡＴ４Ｇ３９９１７　５Ｇ４２７９７　ＡＴ２Ｇ４７４７Ｏ　ＡＴ５Ｇ４７０３０　ＡＴ２Ｇ４７５１Ｏ　ＡＴ５Ｇ４７Ｏ７５　Ａｒ５（　７Ｏ７７　ＡＴ５Ｇ４７ｌ７５　ＡＴ５Ｇ４８５４３　１Ｇ６０９８３　１Ｇ６０９８７　ｌＧ６１０７０　１Ｇ６２８２０　１Ｇ６５９３０　ＡＴ５Ｇ６ｌ　５７０　ｓＧ６１　５９０　ＡＴ５Ｇ６ｌ６４０　粗的竖线１，２，３，４，５表示拟南芥５条染色体，其中白短线表示基因的位置，ＡＴ１Ｇ０４４１０等数字符号代表纯合体株系的基因号　图３　９４个纯合体株系基因在拟南芥５条染色体上的分布情况　３讨论　被子植物双受精的识别是多位点的¨　，可分为３个层次：花粉与柱头、花粉管与花柱及雌雄配子之　间的识别，任何一个环节出了问题都会导致生殖障碍．花粉与柱头之间的识别是至关重要的一步，花粉　的识别物质主要是蛋白质分子，贮存于花粉的表面．在生物信息学的基础上，利用反向遗传学的方法获　得了９４个纯合插入的株系，为进一步了解花粉表面蛋白提供了基础．　虽然这９４个株系都是Ｔ—ＤＮＡ纯合插入，但是并没有发现与野生型的表型有差异，这可能有两个　原因：（１）这些株系中被插入的基因很多都是同一个基因家族的，只敲除其中一个基因，该家族中其他　同源基因的表达能够弥补该基因缺失后造成的功能丧失，即存在基因冗余；（２）有些插入植株在正常　的环境下并不表现出突变的表型，如果改变其生长条件，如温度，湿度，光照强度等，有可能发生表型的　改变．　在下一步工作中，通过同一基因家族基因的蛋白质序列的比对，可以找到同源性较高的基因，然后　从遗传分析角度通过构建双突变甚至多突变来研究这些基因的功能．其次，逐一改变培养条件，观察这　２１８　上海师范大学学报（自然科学版）　２０１０年　９４个纯合株系是否有表型的改变，以研究环境对花粉表面蛋白功能的影响．再次，上述纯合株系的细胞　学发育过程可能存在细微变化，如花粉的表面结构及萌发能力等，这些可以通过扫描电镜及荧光显微镜　进行细致的细胞学观察，以及花粉的体外萌发来进行表型分析．　参考文献：　［１］　ＥＤＬＵＮＤ　Ａ　Ｆ，ＳＷＡＮＳＯＮ　Ｒ，ＰＲＥＵＳＳ　Ｄ．Ｐｏｌｌｅｎ　ａｎｄ　ｓｔｉｇｍａ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２００４，１６（ｓｕｐｐ１）：￥８４一ｓ９７．　［２］　ＰＩＦＦＡＮＥＬＬＩ　Ｐ，ＲＯＳＳ　Ｊ　Ｈ　Ｅ，ＭＵＲＰＨＹ　Ｄ　Ｊ．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｉｐｉｄ　ｓｔｕｒｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｌｅｎ　ｇｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｓｅｘ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｐｒｏｄ，１９９８，ｌ１（２）：６５—８０．　［３］　ＲＯＳＳ　Ｊ　Ｈ．ＭＵＲＰＨＹ　Ｄ　Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｈｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｍａｊｏｒ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｏｌｅｏｓｉｎ—ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｏｆ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９６，９（５）：６２５—６３７．　［４］　ＭＡＹＦＩＥＬＤ　Ｊ　Ａ，ＦＩＥＢＩＧ　Ａ，ＪＯＨＮＳＴＯＮＥ　Ｓ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２（５５２６）：２４８２—２４８５．　［５］　ＰＲＥＵＳＳ　Ｄ，ＬＥＭＩＥＵＸ　Ｂ，ＹＥＮ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｏｌ—　ｌｅｎ　ａｎｄ　ｄｉｓｕｒｐｔｓ　ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，１９９３，７（６）：９７４—９８５．　［６］　ＭＡＹＦＩＥＬＤ　Ｊ　Ａ，ＰＲＥＵＳＳ　Ｄ．Ｒａｐｉｄ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｔｈｅ　ｏｌｅｏｓｉｎ—ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＧＲＰ１７［Ｊ］．　Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２０００，２（２）：１２８—１３０．　［７］　ＡＲＩＩＺＵＭＩ　Ｔ，ＨＡ　ｒＡＫＥＹＡＭＡ　Ｋ，ＨＩＮＡＴＡ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌ　ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮＥＦ１　ａｆｆｅｃｔｓ　ｌｉｐｉｄ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｔｉｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｐｅｔｕｍ　ａｎｄ　ｅｘｉｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｌｅｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，　２００４，３９（２）：１７０—１８１．　［８］　ＰＡＸＳＯＮ—ＳＯＷＤＥＲＳ　Ｄ　Ｍ，ＤＯＤＲＩＬＬ　Ｃ　Ｈ，ＯＷＥＮ　Ｈ　Ａ，ｅｔ　ａ１．ＤＥＸ１，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｅｘｉｎｅ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｏｌｌｅｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２７（４）：１７３９—１７４９．　［９］　ＺＨＡＮＧ　Ｓ，ＲＡ１ＮＡ　Ｓ，ＬＩ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００３，５３（１—２）：１３３—１５０．　［１０］　徐恒平，曹宗巽．被子植物雌雄配子及其表膜特异蛋白的研究进展［Ｊ］．大自然探索，１９９５，１４（３）：５０—５５．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ—ＤＮＡ　ｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＹＩ　Ｓｕ—ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｅｎ，ＳＨＩ　Ｚｈｉ—ｈａｏ，ＹＡＮＧ　Ｚｈｏｎｇ—ｎａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｓｅｎ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＣＰｓ）ａｒｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｄｈｅｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｏｌｌｅｎ　ａｎｄ　ｓｔｉｍｇａ，ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｌｅｎ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｎ　ｏｕｒ　ｗｏｒｋ，ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅ　ｈａｖｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｅ　ｏｒｄｅｒｅｄ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｔ—　ＤＮＡ　ｔａｇｇｅｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＳＡＬＫ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡ，ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｈｅ　Ｔ—ＤＮＡ　ｉｎ－　ｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅｓ　ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｉｌｌ　ｓｅｔ　ｂａｓｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｌｅｎ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＳＡＬＫ　ｌｉｎｅｓ；Ｔ—ＤＮＡ　（责任编辑：郁慧）