一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107970442 A(43)申请公布日 2018.05.01

(21)申请号 201711276167.0(22)申请日 2017.12.06

(71)申请人 成都康华生物制品有限公司

地址 610000 四川省成都市经济技术开发

区北京路182号(72)发明人 冯晓　侯文礼　

(74)专利代理机构 北京天盾知识产权代理有限

公司 11421

代理人 葛宏(51)Int.Cl.

A61K 39/116(2006.01)A61K 39/102(2006.01)A61K 39/10(2006.01)A61K 39/08(2006.01)A61K 39/05(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页

A61K 39/39(2006.01)A61P 31/04(2006.01)

CN 107970442 A(54)发明名称

一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法(57)摘要

本发明公开了一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括步骤：S1，菌种库的建立：百日咳菌种库的建立、白喉棒状杆菌菌种库的建立、破伤风芽孢杆菌菌种库的建立和B型嗜血流感杆菌菌种库的建立；S2，百日咳原液的制备：硫酸铵盐析、密度梯度离心和戊二醛脱毒；S3，白喉类毒素制备；S4，破伤风类毒素制备；S4，B型嗜血流感毒素制备；S5，四价联合疫苗的配置。本发明为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP-Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

CN 107970442 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1，菌种库的建立

百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；

密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；

戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；

S3，白喉类毒素制备

将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；

S4，破伤风类毒素制备

将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；

S4，B型嗜血流感毒素制备

将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；

S5，四价联合疫苗的配置将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。

2

CN 107970442 A

说　明　书

1/4页

一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备

方法

技术领域

[0001]本发明具体涉及一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法。

背景技术

[0002]百日咳、白喉、破伤风混合疫苗简称百白破疫苗，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破伤风类毒素按适量比例配制而成，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。目前使用的有吸附百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒素混合疫苗(吸附百白破)和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒类混合疫苗(吸附无细胞百白破)。无细胞百白破联合疫苗由无细胞百日咳疫苗原液、白喉类毒素原液及破伤风类毒素原液加氢氧化铝佐剂制成。为乳白色悬液，放置后佐剂下沉，摇动后即成均匀悬液，含防腐剂。[0003]B型嗜血流感杆菌简称Hib，是一种引起婴幼儿严重疾病，甚至死亡的致病菌，在世界各地，Hib是引起儿童疾病的一个主要病因；Hib是导致5岁以下婴幼儿严重感染的主要病原体：在发展中国家，Hib侵袭性疾病是引起婴幼儿死亡的主要病因，主要引起肺炎，预后较差。在5岁以下化脓性脑膜炎病例中，Hib感染性脑膜炎约占60％，在发展中国家，Hib引起脑膜炎的死亡率可达到20％--50％。Hib诱发的其它常见感染有：小儿败血症、会厌炎、中耳炎、关节炎、心包炎等。

[0004]DTaP-Hib四联疫苗即百白破和B型嗜血流感杆菌四联疫苗，可预防百日咳、白喉、破伤风及由B型嗜血流感杆菌引起的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等传染性和感染性疾病。使用该疫苗，可减少接种次数、减少痛苦、降低接种脱落率。该疫苗需自费接种，如果经济条件许可，建议接种。现有研究发现，B型嗜血流感杆菌与单独吸附于氢氧化铝佐剂后，Hib的抗体降低5-11倍，造成DTaP-Hib的PRP多糖免疫出现反应降低的现象，降低了DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

发明内容

[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，以解决因氢氧化铝佐剂造成DTaP-Hib四联疫苗的PRP多糖免疫反应降低的技术问题。[0006]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

[0007]提供一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括以下步骤，S1，菌种库的建立

[0008]百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0009]白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃

3

CN 107970442 A

说　明　书

2/4页

培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0010]破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0011]B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0012]S2，百日咳原液的制备[0013]硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；[0014]密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；[0015]戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；[0016]S3，白喉类毒素制备

[0017]将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；[0018]S4，破伤风类毒素制备

[0019]将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；[0020]S4，B型嗜血流感毒素制备

[0021]将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；[0022]S5，四价联合疫苗的配置[0023]将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。[0024]本发明的有益效果为：

[0025]1.本发明为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP-Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

具体实施方式

[0026]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对

4

CN 107970442 A

说　明　书

3/4页

本发明技术方案进行清楚、完整地描述。[0027]实施例1：

[0028]一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括以下步骤，[0029]S1，菌种库的建立

[0030]百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0031]白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0032]破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0033]B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；[0034]S2，百日咳原液的制备[0035]硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；[0036]密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；[0037]戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；[0038]S3，白喉类毒素制备

[0039]将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；[0040]S4，破伤风类毒素制备

[0041]将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；[0042]S4，B型嗜血流感毒素制备

[0043]将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；[0044]S5，四价联合疫苗的配置[0045]将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。

5

CN 107970442 A[0046]

说　明　书

4/4页

本发明为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四

价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP-Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

[0047]上述实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

6