玉米全基因组中NAC基因家族的鉴定与分析
作者：葛姗姗等
来源：《山东农业科学》2015年第02期
摘要：
本试验利用生物信息学方法预测了玉米NAC基因家族成员、基因结构、染色体定位和系统进化关系。结果表明，玉米NAC基因家族包含128个成员，依据其在染色体上的位置系统命名为ZmNAC001～ZmNAC128；ZmNAC分布在10条染色体上，且分布不均；ZmNAC基因与拟南芥NAC基因具有一定相似性，可分为13个亚家族；基因结构分析发现绝大多数ZmNAC基因含有1～3个内含子；miRNA靶基因预测发现7个ZmNAC基因为miRNA164的靶基因。
关键词：玉米；NAC基因家族；生物信息学
中图分类号：S513.01文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0001-06 AbstractThe NAC gene family in maize （Zea mays L.） was comprehensively identified by bioinformatics in this research， including gene members， gene structure， chromosome location and phylogenetic relationship. As a result， 128 NAC genes were predicted and named as
ZmNAC001～ZmNAC128 according to their chromosome location. The 128 ZmNAC unevenly distributed on 10 chromosomes of maize. Phylogenetic analysis suggested that ZmNAC genes had certain similarities with NAC genes from Arabidopsis and could be divided into 13 subfamilies. Gene structure analysis showed that most ZmNAC genes contained 1～3 introns. Seven ZmNAC genes were predicted as the target genes of miRNA164.
Key words Maize； NAC gene family； Bioinformatics
NAC是一类植物特有的重要转录因子，其N端含有高度保守的NAM结构域
（PF02365），大约由130个氨基酸组成，负责与DNA或其它蛋白结合；而C端序列高度变异，具有转录激活功能1， 2。NAC基因的功能涉及植物的生长发育调控、激素信号转导、响应生物和非生物胁迫等2。Xie等3发现拟南芥NAC1基因受生长素诱导表达，并通过激活下游生长素响应基因DBP和AIR3来促进侧根发育。Hu等4发现水稻SNAC1基因在气孔的保卫细胞中特异表达，过量表达SNAC1基因的水稻抗旱耐盐能力大幅提高。Liu等5将水稻SNAC1基因在棉花中过量表达，发现转基因棉花在干旱和高盐胁迫下蒸腾速率下降，根系发育增强，进而抗旱耐盐性提高。Yokotani等6发现水稻OsNAC111基因受稻瘟病菌诱导表达，过量表达OsNAC111的水稻对稻瘟病菌的抵抗力增强。进一步的研究发现，过量表达
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OsNAC111的水稻中的病原相关基因（PR）表达量提高，表明OsNAC111通过调控防御相关基因的表达来抵御病原菌的入侵。
玉米是重要的粮食和能源作物。2009年11月，玉米基因组测序完成7，为在全基因组水平分析重要基因家族提供了平台。目前，玉米NAC转录因子研究只有少数几篇报道，且NAC转录因子的命名较为混乱。柳展基等8从玉米中克隆了ZmNAC1（EU224278），发现其受低温、干旱、高盐和ABA诱导表达；Lu等9克隆了一个胁迫相关NAC转录因子基因ZmSNAC1，过量表达ZmSNAC1的拟南芥抗旱能力显著提高；Li等10将玉米ZmNAC1（TC258020）转入拟南芥中，转基因拟南芥侧根增多；Voitsik等11发现ZmNAC41和ZmNAC100在防御炭疽病菌入侵中起作用。本研究利用生物信息学方法对玉米全基因组中的NAC基因家族的成员、基因结构、染色体定位、系统发生等进行分析，为进一步研究玉米NAC转录因子奠定基础。 1材料与方法 1.1 NAC基因的鉴定
本研究以玉米自交系B73的基因组序列（5b. 60）为研究对象，基因组序列下载于phytozome v9.1网站（http：//www.phytozome.net/maize.php）。利用下载的玉米蛋白质序列构建本地BLAST数据库，以Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）中NAM结构域（PF02365）为探针进行BLASTP搜索（E≤10-5）。利用ClustalW软件对得到的NAC候选序列进行多序列比对，去除冗余序列。利用Pfam数据库分析这些蛋白有无NAM结构域，存在NAM结构域的蛋白序列属于NAC蛋白家族。基因结构利用在线软件Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析获得12，13。 1.2NAC蛋白系统进化树的构建
为了解玉米NAC蛋白的系统发生关系，利用Clustal X程序对玉米和拟南芥的NAC进行氨基酸序列多重比对，拟南芥NAC家族蛋白序列下载于Tair网站（http：
//www.arabidopsis.org/）。利用MEGA 4.0软件构建系统进化树，系统进化树采用邻接法（neighbor joining， NJ），对构建的进化树进行自检，重复设为1 000。 1.3miR164靶序列的预测
玉米miR164的碱基序列下载于miRbase数据库（http：//www.mirbase.org/），与玉米NAC基因家族核酸序列进行比对分析。ZmNAC基因为miR164靶序列的标准为：（1）miRNA与靶序列间的差异碱基个数不超过4个；（2）在miRNA的第2～12位碱基处，不能出现连续碱基错配；（3）在miRNA的第10和11处不能有碱基错配14。同时利用在线程序psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）预测miR164的靶序列。 2结果与分析
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2.1玉米NAC基因的鉴定
利用保守NAM结构域的氨基酸序列对玉米蛋白质序列进行检索，去除冗余和可变剪切序列，最终得到128个玉米NAC家族基因。根据其在染色体上的先后顺序进行了系统编号，命名为ZmNAC001～ZmNAC128（表1）。ZmNAC基因分布于玉米10条染色体上，其中第6号染色体最多，有16个，而第10号染色体上最少，仅有7个，其余染色体上各有11～15个ZmNAC基因分布。ZmNAC蛋白的氨基酸长度差异较大，ZmNAC041最长，为1 467 aa，而 ZmNAC092最短，为202 aa。经过Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）分析，128个ZmNAC蛋白都含有典型的NAM保守结构域。 2.2玉米NAC基因结构分析
如图1所示，ZmNAC基因的内含子和外显子数量差异较大，其中7个ZmNAC基因没有内含子，占总数的5.47%；21个ZmNAC基因含有1个内含子，占16.41%；67个ZmNAC基因含有2个内含子，占52.34%；14个ZmNAC基因含有3个内含子，占10.94%；其余19个ZmNAC基因含有4～8个内含子，占总数的14.84%。 2.3玉米NAC蛋白系统进化树的构建
为了研究玉米NAC基因之间的进化关系，我们利用MEGA 4.0软件的邻接法构建了玉米和拟南芥NAC转录因子的进化树。根据氨基酸序列相似性的高低和进化关系的远近，将玉米NAC蛋白分为13个亚家族（图2）。13个玉米NAC亚家族中的ZmNAC蛋白数量差异很大，其中，第Ⅸ亚家族全部由玉米NAC蛋白组成，含有8个NAC转录因子；第Ⅷ亚家族含有的玉米NAC转录因子最多，为22个；第Ⅳ亚家族含有的玉米NAC转录因子最少，仅有3个。第Ⅹ亚家族含有ATAF1、ATAF2、ANAC019、ANAC055和ANAC072等拟南芥NAC转录因子，它们在调控生物和/或非生物胁迫响应中起重要作用，该亚家族中含有18个玉米NAC转录因子，预示它们可能在响应和抵御逆境胁迫中起作用。 2.4miR164靶基因的分析
研究表明miR164的部分靶基因为NAC转录因子基因。目前，miRbase数据库中有8条玉米miR164序列（zma-miR164a-h）。利用这8条miRNA序列与128个ZmNAC基因进行序列比对，发现7个ZmNAC基因（ZmNAC023、ZmNAC034、ZmNAC035、ZmNAC051、ZmNAC062、ZmNAC065和ZmNAC073）具有miR164的识别位点（图3）。这7个ZmNAC基因分布在第Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ亚家族，占预测到的ZmNAC家族成员数的5.5%，与拟南芥（4.7%）中结果相似，是葡萄（2.1%）的2.6倍15。 3讨论与结论
随着测序技术的不断发展和测序成本的逐渐降低，越来越多物种的全基因组测序得以完成。目前已公布的植物基因组有70余个16。大量的基因组数据为研究物种进化、基因结构与
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功能、基因变异与调控以及基因家族预测等提供了契机。本研究利用生物信息学方法，对玉米基因组中的NAC基因家族进行了鉴定与分析，并根据ZmNAC基因在相应染色体上的先后顺序进行了系统命名，期望为进一步研究ZmNAC基因的功能奠定理论基础。
NAC转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一。目前，已在模式植物拟南芥、水稻和大豆中分别鉴定了105、140和152个NAC基因17～19。本研究鉴定了128个玉米NAC基因，与拟南芥、水稻等模式植物相似。进化分析发现，18个ZmNAC基因与拟南芥中胁迫响应NAC转录因子基因ATAF1、ATAF2等聚集在第X亚家族，预示其可能在逆境胁迫响应与抵御中起作用。次生壁是木材的主要组成部分，也是重要的再生生物能源。拟南芥SND1和NST1具有调控次生壁合成的功能20，17个ZmNAC基因与SND1、NST1等聚集在第Ⅰ亚家族，预示其在次生细胞壁生物合成中起作用。
在拟南芥中，miR164有5个靶基因为NAC基因，分别为NAC1（ANAC022）、CUC1（ANAC054）、CUC2（ANAC098）、At5g07680（ANAC080）和At5g61430（ANAC100）。NAC1能够介导生长素信号，促进侧根发育，CUC1和CUC2参与调控顶端分生组织的形成和器官的分离21。在本研究中，我们鉴定了7个ZmNAC基因为miR164的靶基因，其中ZmNAC035、ZmNAC073与CUC1和CUC2同源，序列一致性均在55%以上，聚集在Ⅴ亚家族；ZmNAC034、ZmNAC062与NAC1序列一致性在44%以上，聚集在Ⅲ亚家族。Li等10在拟南芥中过量表达ZmNAC1（本研究中为ZmNAC062），转基因拟南芥侧根增多，同时证实miRNA164能够降解ZmNAC1基因，表明ZmNAC1与拟南芥NAC1功能相似，且都为miRNA164的靶基因。进而我们推测玉米中miR164的7个ZmNAC靶基因可能均与其拟南芥中的同源基因具有相似功能及调控机制。 参考文献： [1]
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