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实验内容
目的和要求及原理
通过质粒的一些特性对质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA， 了解用分光光度计测定DNA含量的方法。
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、 2
酰胺试SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一种是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。
紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。
溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。
材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。
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WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega)
Cell Resuspension Solution Cell Lysis Solution Neutralization Solution Column Wash Solution TE buffer (1X) 4
80mM potassium acetate 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 8.3mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl (pH 10mM EDT 0.2M NaOH 1.32M potassium acetate (pH 7.5) 7.5) 100μg/ml RNase A 1% SDS (pH 4.8) 40μM EDTA 1mM EDTA 55% ethanol 步骤
1.质粒DNA的提取
质粒DNA的提取：
1. 取3ml细菌培养液（分2次，每次1.5ml）细菌培养液于离心管中，10，000 × g离心1分钟，
弃上清液（尽可能完全）。
2.加入200ul细胞悬浮液，振荡使细胞完全重悬。
3.加入200ul细胞裂解液，颠倒4次轻轻混合，此时溶液应变澄清。 4.加入200ul中和液，颠倒4次混合。 5.10，000 × g 离心10分钟。
6.取出2.5ml注射器的活塞，将注射器套在柱子上，取1ml树脂（用前先混匀）加入到注射器中。 7.取第5步离心后的上清液，加入到已含有树脂的注射器中，混匀。
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8.插上活塞，缓慢推入底部，将溶液挤出，弃去。
9.将注射器与柱子分开，从注射器中拔出活塞后，重新将注射器套在柱子上，加入2ml洗柱液（已加入乙醇），插入活塞缓慢推至底部。
10.将柱子从注射器上取下插入1.5ml离心管中，10，000 × g 离心2分钟，以去掉残留液体。11.加入50ul灭菌水，室温放置1分钟。
12.10，000 ×g离心20秒，收集洗下的DNA溶液。 13.弃去柱子，DNA溶液-20℃保存备用。 2.浓度测定（分光光度计法）
用分光光度计法定量DNA：
1.取2μl提取的质粒DNA，加入98ul蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释); 2.蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。 3.加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。 4.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 以上浓度单位为μg /ml
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加样器 吸头
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分光光度计
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水浴锅
微波炉
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电泳仪 电泳槽
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紫外分析仪
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凝胶成相仪
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PCR仪
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漩涡混合仪
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UV-Cross Linker
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shaker
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一.常用贮液与溶液
1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。
10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，
须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇 至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。
8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。
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3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。
1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。
25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。 1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。
100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹 或贮存于-20℃。
20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套） 5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。
10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。 10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。 2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。
100％三氯乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制）
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2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。 100×Denhardt试剂（Denhardt's regent）
成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 2%聚蔗糖（Ficoll，400型） 2g 2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40） 2g 2%BSA（组分V） 2g 水 加水至总体积为100ml 依照上表称取各组分，溶于水中定容。过滤除菌及杂质，分装成小份于-20℃贮存。 10×标准DNA连接酶缓冲液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端连接）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 0.5mol/L Tris-HCl 5ml 1mol/L 贮液 100mmol/L MgCl2 1ml 1mol/L 贮液 100mmol/L DTT 1ml 1mol/L 贮液 2mmol/L ATP 200ul 100 mmol/L 贮液 5mmol/L 盐酸亚精胺（可选） 50ul 1 mmol/L 贮液 0.5mg/ml BSA（组分V）（可选） 0.5ml 10 mg/mL 贮液 水 2.25ml
将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃ 。
100 mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions）
可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。
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10mmol/L dNTP混合液
成分及终浓度 配制20ul溶液各成分的用量 10mmol/L dATP 2ul 100 mmol/L dATP 贮液 10mmol/L dCTP 2ul 100 mmol/L dCTP 贮液 10mmol/L dGTP 2ul 100 mmol/L dGTP 贮液 10mmol/L dTTP 2ul 100 mmol/L dTTP 贮液 水 12ul 20％PEG 8000/2.5M NaCl
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 质量浓度为20％聚乙二醇 20g 2.5mol/L 氯化钠 50ml 5 mol/L 氯化钠 或 14.6g 固体氯化钠 水 补足100ml
加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中，加水至终体积100ml，用磁力搅拌器搅拌溶解。 20×SSC
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 300mmol/L 柠檬酸三钠（二水） 88.2g 3mol/L 氯化钠 175.3g 水 补足1L 20
溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10N NaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。
DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水
加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的体积分数为0.1％。在37℃温浴至少12h，然后在15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。
甲酰胺（deionized formamide）
直接购买或加Dowex XG8 混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中，用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，可去除甲酰胺中的离子。经Whatman 1号滤纸过滤除去树脂后分成小份，充氮气于-80℃贮存（防止氧化）。
磷酸缓冲液（phosphate buffer） 按照下表所给定的体积，混合1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L 磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。配制1 mol/L 的磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）贮液：溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:溶解142g于足量水中使终体积为1L。
1mol/L 磷酸二氢钠（ml） 877 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 1mol/L 磷酸氢二钠（ml） 123 150 185 225 265 315 375 435 490 550 610 670 720 最终pH值 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 21
TE（用于悬浮和贮存DNA）
成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 10mmol/L Tris－HCl 1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃） 1mmol/L EDTA 200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 水 98.8ml Tris缓冲液（Tris-HCl buffer）
将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。
浓盐酸的体积（ml） pH 8.6 9.0 14 8.8 21 8.6 28.5 8.4 38 8.2 46 8.0 56 7.8 66 7.6 71.3 7.4 76 7.2 二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
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电泳缓冲液
50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 242g 1mol/L 乙酸 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 100 mmol/L EDTA 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 水 补足1L 5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 54g 445 mmol/L 硼酸盐 27.5g 硼酸 10 mmol/L EDTA 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 水 补足1L 染料
1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
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10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。 凝胶上样液（gel loading solutions） 6×碱性凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠 300ul 10N 氢氧化钠 6 mmol/L EDTA 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 18％聚蔗糖（400型） 1.8g 0.15％溴甲酚绿 15mg 0.25％二甲苯青FF 25mg 水 补足到10ml 6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 15％聚蔗糖（400型） 1.5g 水 补足到10ml 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
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0.25％溴酚蓝 2.5ml 1％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 2.5ml 1％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型） 1.5g 水 补足到10ml 6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 50％甘油 3ml 水 3.9ml 6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 40％聚蔗糖 4g 水 补足到10ml 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
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0.2％溴酚蓝 20mg 0.2％二甲苯青FF 20mg 200 mmol/L EDTA 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 0.1％SDS 100ul 10％ SDS 50％甘油 5ml 水 补足到10ml 三.常用培养基
LB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化钠 0.5g
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1 mol/L 氯化钾 2.5ml
用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。 SOC培养基
成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。 TB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨 酵母提取物 甘油 12g 24g 4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。 2×YT培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨 酵母提取物 氯化钠
16g 10g 4ml 27
如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 YPD培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 20g 10g 20g 用水补足体积为1L后，高压灭菌。建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。
四.常用抗生素
氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
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氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml）
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml）
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌
以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
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质粒类型：
1. 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 2. 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
质粒结构：
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(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。
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载体
质粒小量提取的方法：
1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37℃培养12～16小时;
2. 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100 l溶液1 ，充分混匀; 3. 加入200 l新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min; 4. 加入150 l乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5－15min; 5. 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 6. 沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;
7. 加入30-50 l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 8. 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。
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