CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit—8（简称CCK—8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2—(2—甲氧基—4-硝基苯基）-3—（4—硝基苯基)-5-(2,4—二磺酸苯）—2H—四唑单钠盐】，它在电子载体1—甲氧基—5—甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1—Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye）.生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析.
用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
CCK8的优点：
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使用方便，省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂； CCK—8法能快速检测；
CCK—8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； CCK—8法的重复性优于MTT 法; CCK—8法对细胞毒性小；
CCK—8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：
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与MTT法相 比，CCK8和XTT的价格比较贵。
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CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：
检测方法 MTT法 XTT法 好
WST—1法
好
CCK8法
好
甲臢产物的水差（需加有
溶性
机溶剂溶解)
产品性状 使用方法
粉末 配成溶液后使用
检测灵敏度 检测时间 检测波长 细胞毒性
高 较长
2瓶溶液 现配现用
溶液 即开即用
1瓶溶液 即开即用
很高 较短
很高 较短
高 最短
560-600nm 420—480nm 420-480nm 430-490nm 高,细胞形很低，细胞形很低,细胞很低，细胞态完全消
失
态不变
形态不变
形态不变
试剂稳定性 批量样品检测 便捷程度
一般 可以 一般
较差 非常适合 便捷
一般 非常适合 便捷
很好 非常适合 非常便捷
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二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法 实验一：细胞增殖分析 1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2—4小时，如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10％CCK8的培养基，以换液的形式加入.
5、培养1—4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养，以确认最佳条件.特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间（5-6小时）.
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析 1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复.
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
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5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1—4小时：细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时).
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450—490nm，参比波长600-650nm.
注:
若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0。1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
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如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项
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当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1，000 个/孔 （100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基）.
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酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
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CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。
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CCK-8在0—5℃下能够保存至少6个月，在—20℃下避光可以保存1年. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用.
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在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
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金属对CCK—8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90％的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
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悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间.
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