2019年12月
ACTALABORATORIUMANIMALISSCIENTIASINICA
中国实验动物学报
Vol.27 No.6
December2019
黄小荣,黄衍恒,叶霖,等.巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的构建及鉴定[J].中国实验动物学报,2019,27(6):770-775.AnimSciSin,2019,27(6):770-775.
HuangXR,HuangYH,YeL,etal.Constructionandidentificationofmacrophage-conditionalAtg5-knockoutmice[J].ActaLab
Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2019.06.013
巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的构建及鉴定
黄小荣#,黄衍恒#,叶霖#,杨陈,汤济鑫,安宁,刘建兴,刘华锋∗
【摘要】 目的 构建并鉴定巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠,为研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制
因敲除小鼠(Atg5
型为Atg5flox/+Cre+/-和Atg5flox/floxCre-/-的子代小鼠;将上述两种基因型的子代小鼠杂交,得到巨噬细胞条件性Atg5基
flox/flox
(广东医科大学附属医院肾病研究所,湛江市慢性肾脏病防控重点实验室,湛江 524001)
中的作用提供动物模型。方法 将引进LysM-Cre小鼠与Atg5flox/+小鼠进行杂交、Atg5flox/+小鼠自交,分别获得基因
Cre+/-,Atg5-/-)和对照小鼠(Atg5
flox/flox
经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后,在DNA水平判断小鼠基因型;提取小鼠骨髓来源巨噬细胞RNA和蛋白,利用基该小鼠存活并且可育。在基因及蛋白水平上,巨噬细胞Atg5基因敲除成功;且与Atg5+/+小鼠相比,Atg5-/-小鼠自噬基础水平低下(p62明显增多,LC3II明显减少),对于自噬激活剂雷帕霉素刺激不能恢复到正常基础水平。结论
Cre-/-,Atg5+/+)。提取小鼠鼠尾组织基因组DNA,
因测序和Westernblot技术检验Atg5基因的敲除效果。结果 成功建立巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠模型,
利用Cre/loxp系统,本研究成功构建并鉴定出条件性巨噬细胞Atg5基因敲除小鼠,为在动物水平研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制中的作用提供研究平台。
【关键词】 巨噬细胞;Atg5基因;基因敲除;自噬;基因型鉴定
【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2019)06-0770-06
Constructionandidentificationofmacrophage-conditional
Atg5-knockoutmice
HUANGXiaorong#,HUANGYanheng#,YELin#,YANGChen,TANGJixin,ANNing,LIUJianxing,LIUHuafeng∗
(InstituteofNephrology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,andKeyLaboratoryofPrevention
andManagementofChronicKidneyDiseaseofZhanjiangCity,Zhanjiang524001,China)
Correspondingauthor:LIUHuafeng.E-mail:hf-liu@263.net
hybridizedwithAtg5flox/+mice,andAtg5flox/+micewereself-crossbredtoobtainprogenymicewithAtg5flox/+Cre+/-andgene-knockoutmice(Atg5flox/floxCre+/-,Atg5-/-)andcontrolmice(Atg5flox/floxCre-/-,Atg5+/+).ThephenotypesofthemiceAtg5flox/floxCre-/-.Theprogenymiceoftheabovetwogenotypeswerethenhybridizedtoobtainmacrophage-conditionalAtg5
modelforstudyingtheroleofmacrophageautophagyinthepathogenesisofrenaldiseases.Methods LysM-Cremicewere
【Abstract】 Objective Toconstructandidentifymacrophage-conditionalAtg5-knockoutmicetoprovideananimal
bonemarrow-derivedmacrophageRNAandproteinwereextracted,andAtg5geneexpressionwastestedviasequencingand
[基金项目]国家自然科学基金(81470959,81670654,81700627);广东省科技创新战略专项资金(2018A030313231);湛江市科技发展专FundedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(81470959,81670654,81700627),ScienceandTechnologyInnovationStrategySpecialCity(2018A01034,2018A01040).
项资金竞争性分配项目(2018A01034,2018A01040)。
weredeterminedviaelectrophoresisofDNAthathadbeenextractedfrommousetailtissueandamplifiedviaPCR.Mouse
FundofGuangdongProvince(2018A030313231),ScienceandTechnologyDevelopmentSpecialFundCompetitiveDistributionProjectofZhanjiang[作者简介]黄小荣(1993—),女,硕士研究生,研究方向:肾小管间质纤维化。Email:1028781793@qq.com;
黄衍恒(1993—),男,硕士研究生,研究方向:肾小管间质纤维化。Email:396852647@qq.com;叶霖(1990—),女,博士研究生,研究方向:肾小管间质纤维化。Email:471775761@qq.com。#共同第一作者
[通信作者]刘华锋,博士,教授,从事肾小管-间质损伤及防治研究。Email:hf-liu@263.net
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stimulationwiththeautophagyactivatorrapamycin.Conclusions
increased,andLC3IIwassignificantlyreduced)andcouldnotberestoredtothebasiclevelwithoutdeletingAtg5aftermacrophageautophagyinrenaldiseasepathogenesisattheanimallevel.
macrophageautophagylevelintheAtg5-/-micewasmuchlowerthanthatintheAtg5+/+mice(p62wassignificantlysuccessfullyconstructedandidentifiedviatheCre/loxpsystem,providingaresearchplatformforstudyingtheroleof
【Keywords】 macrophage;Atg5gene;geneknockout;autophagy;genotypeidentification
andwerefertile.ThemacrophageAtg5genewassuccessfullyknockedoutatboththegeneandproteinlevels.Thebasic
Westernblotting.Results Amacrophage-conditionalAtg5-knockoutmousemodelwasestablished;thesemicesurvived
Macrophage-conditionalAtg5-knockoutmiceare
ConflictsofInterest:Theauthorsdeclarenoconflictofinterest.
巨噬细胞属于单核吞噬细胞家族成员,既在固过与自噬体膜上的TECRP结合,促进自噬体与溶酶-有免疫中起重要作用,也可通过招募其他免疫细胞如淋巴细胞产生适应性免疫反应,进而在机体免疫反应、组织损伤和修复中起关键作用[1]和功能不同,巨噬细胞可分为不同的亚类。根据表型,一般可分为经典活化型M1促炎巨噬细胞(M1)和替代活化型α、IL-1β、IL-6、IL-23、M2抗炎巨噬细胞子;而M2则可分泌IL-4、IL-13、IL-10、TGF活性氧簇(M2)。(ROS)M1可大量分泌等促炎细胞因TNF--β1等炎症抑制因子,及成纤维细胞生长因子及血小板衍生因子等促纤维化因子[2-3]
损伤和进行性慢性肾脏病都可在肾小球及肾间质。几乎所有类型的急性肾中检测到巨噬细胞浸润[4]化,巨噬细胞可在促炎表型和抗炎促纤维化表型之,且根据肾脏微环境变间进行转化[5]维化各阶段中发挥着不同作用,从而在肾小管-[4,间质损伤6-8]
、修复和纤
管-间质损伤的最终转归。
,显著影响肾小近年来,自噬通路在肾小管-间质损伤进程中的作用越来越受关注;而目前对自噬的研究主要集中在TECs上[9-10]用研究尚涉及甚少,。免疫细胞自噬在肾脏疾病的作
现研究认为,自噬可影响免疫细胞的增殖、凋亡、迁徙、分化、活化以及炎症因子分泌[11]诱导肥胖小鼠。有研究表明在眼色素层炎[12][13]损伤[14]等诸多炎症模型中、半乳糖胺联合,特异性阻断巨噬细胞自LPS诱导的急性肝
、高脂饮食
噬通路,可引起巨噬细胞炎症体降解受阻而分泌大量炎症因子IL-1阻和IL-18,加剧疾病相关器官的炎症反应及损伤严重程度[12]很可能参与调节机体炎症免疫反应。因此巨噬细胞自噬,影响疾病进展。然而在肾脏疾病发生发展过程中,自噬如何调节巨噬细胞功能,进而影响肾脏疾病进展尚未知晓。
形ATG16成ATG5及降是自噬通路中的关键蛋白解是必,对于自噬泡膜结合两种方式形成自噬体膜复合物通过参与不可LC3-PE少的[15]。ATG12-ATG/[16]偶联途径或直接与;并且ATG5可通
体融合[1718]的内容物。敲低或敲除,形成自噬溶酶体ATG5可导致自噬下调或完
,最终降解其所包裹全抑制,表明ATG5在自噬通路中起关键作用[19]因此,巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠模型的构。建,为在动物水平上研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发生发展中的作用是可行且非常必要的。在本实验中我们将探讨最佳繁殖方案、繁育小鼠基因型鉴定及Atg5敲除效果分析,为研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制中的作用提供实验材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物6只,4雌雄各月龄SPF3只级;LysM-CreC57BL/6J-Atg5em2(flox)/SMOCJAXstockNo.004781小鼠共
鼠共4只,雌雄各2只,体重20~25g,购于上海南小0010】,方模式生物科技股份有限公司【SCXK(泸)2017-
(照粤/黑暗条件下)2015饲养于广东医科大学实验动物中心-0147】。,自由采食和饮水所有小鼠饲养于,所有操作均符合12h/12【SYXKh光1.实验动物伦理学要求1.2 试剂与仪器
(GDY1801016)。
AGAROSE,GelPremixTag2.0plus(TaKaRa,日本);BIOWEST
司,中国);TAEred缓冲液核酸凝胶染料(广州锐科生物有限公司(联硕科技有限公,中国anti-LC3);雷帕霉素(Sigma,美国),氯喹(Sigma,美国antibody(IIantibody(Sigma,美国);anti-SQSTM1/p62),antibody(记山羊抗MBL,上海碧云天生物技术有限公司兔日本IgG);anti-Atg5(Abcam,英antibody,国);anti-GAPDH
辣根酶标,中国)。c500凝胶电泳仪(Bio-Rad,美国);Azurebiosystems
美国);双激光近红外成像分析仪ProFlexTM3x32-wellPCR(AzureSystembiosystems,(Applied
7721.2 方法鉴定
Biosystems,美国)。
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1.2.1 小鼠尾部组织基因组DNA的提取、扩增及
(1)DNA提取:采用碱裂解法提取鼠尾组织基
Azurebiosystemsc500双激光近红外成像分析仪曝光成像。通过检测自噬相关蛋白(如LC3II、p62(Chloroquine,10μmol/L)刺激24h后,是否能够激Atg5-/-小鼠巨噬细胞自噬功能缺陷。
活/抑制Atg5-/-小鼠巨噬细胞自噬,进一步确定等),观察雷帕霉素(Rapamycin,10μmol/L)及氯喹
记山羊抗兔IgG(1∶1000),置摇床室温孵育1h;20mL1×PBST缓冲液中洗膜3次,每次5min;在
因组DNA。待新生小鼠达3~4周龄打耳标后,剪取小鼠鼠尾约3mm,置于1.5mLEP管中;加入50mmol/LNaOH溶液90μL,置恒温水浴锅中95℃加
(pH8.0)10μL充分震荡混匀,以12000r/min离热30min。待EP管冷却后,加入1mol/LTris溶液
2 结果
心2min。取上清置于新1.5mLEP管中,-20℃保存。
TTCAGTGTACCCTGTGTATTGG-3′,(2)PCR扩增:Flox基因的GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′下上游游引引物:5′-
游引物:5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′,和Cre基因物:5′-下游引的上物TCGGCCAGGCTGAC-3′;:5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′,为94℃预变性2min,94℃反应体系变性3025s,62℃μL;5′-TTACAG退火扩增程序72℃延伸30s,
浓度(3))琼脂糖凝胶电泳PCR1min,35产物鉴定个循环,:PCR,72℃延伸5min。
采用凝胶成像分析系统观产物使用1.5%(质量
察分析条带位置。琼脂糖凝胶上的PCR条带出现与Flox基因、Cre基因PCR产物大小一致的条带为1.阳性结果2.2 巨噬细胞,否则为阴性结果Atg5基因敲除效果验证。
将已进行基因型鉴定的小鼠,进行敲除效果鉴
定。待小鼠8周龄后,取Atg5+/+小鼠及Atg5-/-小鼠骨髓细胞,使用M-CSF刺激7d,诱导为成熟巨噬细胞,提取其RNA及蛋白质。将提取的RNA逆转录为TTCAGTGTACCCTGTGcDNA后,进行PCRTATTGG-3′,扩增,上游下游引物序列引物序列:5′-5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′,然:
产物送天一辉远生物科技有限公司进行测序后将。PCR用RIPA裂解液提取巨噬细胞蛋白,BCA法测PAGE定蛋白电含泳量,;电按泳每完孔成30后μg将蛋总白蛋转白移上至样,0.行22SDS-
PVDFμm×1000)、分别加入膜上抗1;20PBSTmL含稀释的抗5%BSAATG5封闭液室温封闭多克隆抗体1(1h;LC3多克隆抗体(1∶1000)、抗P62多克隆
∶
抗体4℃次5孵育过夜(1∶1000)和抗GAPDH单克隆抗体(1∶1000),min;加入;201×mLPBST1×缓冲液稀释的二抗辣根酶标
PBST缓冲液中洗膜3次,每2.1 小鼠的繁殖情况
为挑选出最佳繁殖方案,我们在得到F2代小鼠后,采用了2种配种方式进行繁殖(图1);结果为若按F2a得到实验小鼠(Atg5flox/floxCre+/-或Atg5flox/floxCre-/-小鼠()Atg共55flox只/flox,占Cre50%+/-或(5Atg/10),5flox/flox若按Cre-F2b/-)共得到实验25%(33只,占
基本孟德尔遗传定律/12);以上两种繁育方案的分离比例均符合,表明巨噬细胞条件性敲除Atg5基因后对小鼠繁殖能力无明显影响,且F2代采用F2a繁殖方式,获得巨噬细胞条件性敲除Atg5基因小鼠及对照小鼠的效率更高。2.2 小鼠基因型鉴定结果
将鼠尾组织基因组DNA进行扩增后电泳,结果见图2。其中小鼠Flox基因型鉴定结果见图2A,其中1为Flox/Flox纯合小鼠(469bp),2、3和5为Floxbp)。/-Cre杂合子基因型鉴定结果见图(469bp和411bp),42B,其中为野生型1、2、4、5(411Cre+/-(700bp和350bp),3和6为Cre-/-(350bp)。为
2.3 Atg5基因敲除效果鉴定
分别提取Atg5-/-小鼠和Atg5+/+小鼠骨髓细胞,诱导成巨噬细胞的巨噬细胞(1)基因水平敲除效果鉴定;
RNA,逆转录为cDNA:提取该骨髓来源
后,使用特异性引物进行PCR扩增,将PCR产物进行测序,结果显-3A-D)。
示Atg5-/小鼠编码区Exon3(约128bp)被敲除(图
髓来源巨噬细胞蛋白进行(2)蛋白水平敲除效果鉴定Western:提取两组小鼠骨
blotting检测,结果显示:与Atg5+/+小鼠相比,Atg5-/-小鼠ATG5蛋白表达水平明显减少(图3E);且Atg5-/-小鼠巨噬细胞内p62明显增多,而LC3II明显减少(图3F),提示Atg(3)5-/-功小鼠巨噬细胞内自噬水平低下能水平敲除效果鉴定:使用。
雷帕霉素
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注:“→”为F2a繁殖方式,“--→”为F2b繁殖方式。
图1 小鼠繁殖方案
Note.“→”isthepropagationmodeofF2aand“--→”isthepropagationmodeofF2b.
Figure1 Micebreedingprogram
3 讨论
基因敲除技术是利用一定的生物技术手段,使特定的目的基因缺失或者失活,从而排除其他因素对实验结果的干扰,使实验结果变得更可靠和直观。基因敲除包括全身性基因敲除及条件性基因敲除两种方法,其中全身性基因敲除是指在小鼠所有组织细胞中,将靶基因敲除掉,从而使靶基因的表达缺失。本文所提及的基因条件性敲除是利用Cre-Loxp重组系统,将Cre基因插入特定的启动子序列后面,即可人为地控制Cre基因在某些细胞谱系或者在机体发育的特定时间段亦或在外源性药物诱导下表达,表达的CRE蛋白识别特定的DNA序列(如Loxp位点),并进行Loxp位点之间的靶基因剪切,从而实现目的基因在特定细胞类型中功能
注:A为小鼠Flox基因型鉴定结果,其中1为Flox/Flox纯合小鼠,2、3和5为Flox/-杂合子,4为野生型。B为Cre基因型鉴定结果,其中1、2、4、5为Cre+/-,3和6为Cre-/-。
图2 部分小鼠基因型PCR鉴定
Cregenotypeinmice,inwhich1,2,4,5wereCre+/-,and3and6wereCre-/-.
heterozygotes,and4iswildtype.Bshowstheidentificationresultof
which1isFlox/Floxhomozygousmouse,2,3and5areFlox/-
Note:AshowstheidentificationresultsofFloxgenotypeinmice,in
性缺失[20]。本研究中,我们选用了条件性Atg5基
因敲除方案,一方面是出于实验目的的考虑,另一方面也是为了避免全身性敲除Atg5基因导致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡的劣势[21],我们引入的LysM-Cre小鼠是将CrecDNA靶向插入其内源性M溶菌酶基因座,从而使CRE重组酶特异性表达在包括巨噬细胞在内的髓样细胞中。
由于巨噬细胞具有高度异质性,而且其基因表达谱和单核细胞、粒细胞及树突状细胞之间有很大
Figure2 ResultsofgenotypeidentificationofsomemicebyPCR
(Rap)诱导自噬后,Atg5
-/-
小鼠巨噬细胞自噬不能
恢复到正常基础水平,提示Atg5-/-小鼠巨噬细胞自噬缺陷;综上,巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠构建成功。
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Cre小鼠可用于研究巨噬细胞发育的命运图谱分析,虽然该转基因小鼠巨噬细胞基因敲除效率较高,但特异性很低,因Csf1r-Cre可表达于所有白细胞[23]。CD11b-Cre小鼠对巨噬细胞基因敲除效率较低,而且CD11b-Cre不仅表达在单核细胞和巨噬细胞,在中性粒细胞和树突状细胞也具有一定的活性。Cx3cr1-Cre小鼠主要针对单核/巨噬细胞和树突细胞,对中性粒细胞的影响较小,但其在脾巨噬细胞以及外周血单核细胞基因的敲除效率相对较注:A、B分别为Atg5-/-5(mRNA实验组小鼠逆转录为)和cDNAAtg5+/+骨髓来源巨噬细胞Atg的测序结果(对照组小鼠。C、
)
D巨噬细胞为两组小鼠ATG5Atg蛋白表达情况5mRNA改变示意图。F为使用雷帕霉素。E为两组小鼠骨髓来源(Rap)和氯喹(CQ)调控自噬后,两组小鼠骨髓来源巨噬细胞对该调控的反
应情况。
图3 Atg5基因敲除效果鉴定
group)Note.AandandAtgB5are+/+(controlthesequencinggroup),resultsrespectively.ofAtg5-/-Cand(experimental
changesofAtg5DshowthemacrophagesexpressionofintheATG5mRNAtwoofgroups.proteininmicemiceinFinoftheshowsmousethetwotwothegroupsresponsebonegroups.marrowEshowstotheofboneregulationmarrowderived
the
autophagyderivedmacrophagesbyrapamycin(Rap)andchloroquine(CQ).
of
Figure3 IdentificationoftheefficiencyofgeneAtg5knockout
的重叠[22]Cre小鼠在本质上是不存在的;因此,一个完全针对巨噬细胞的转基因
。目前靶向巨噬细胞的Cre小鼠主要是基于单核细胞/巨噬细胞标志物,如LysM、CSF1R、CD11b和CX3CR1等。其中Csf1r-
低+[24]。虽然LysM也在大多数粒细胞和少数CD11c细胞基因的敲除效率非常高树突状细胞中表达,但LysM-Cre[20]小鼠对成熟巨噬Cre高[24]小鼠对组织常驻巨噬细胞基因的敲除效率不。因此,即使LysM-为了研究自噬生物学功能,但其仍是研究巨噬细胞最常用的工具鼠,目前几种自噬相关。
基因缺失小鼠已被报道构建成功,包括Atg5-/-Atg7-/-和Beclin1-/-小鼠[21,25-26]、过与ATG5VPS34结合,调控吞噬泡;的其中形成BECLIN及成熟1;通而与LC3ATG12是自噬通路的上游蛋白和ATG16结合,促进,启动自噬体形成LC3与,并结合所必需的一种类似沉积在自噬体膜上;ATG7E1的是PE结合,使酶[19]ATG12与ATG5Atg5、Atg7或者Beclin1都可以达到自噬抑制的作。因此,敲除用。然而Beclin1在细胞凋亡途径起到重要的作用,而且Beclin1+/-突变小鼠发生自发性肿瘤的几率较高[26]虽然有研究表明,所以BeclinAtg15并不是研究自噬的特异基因或Atg7缺失小鼠的细胞仍然。可以形成自噬体/自噬溶酶体,并在受到一定应激时可进行自噬介导的蛋白降解[27]仅参与自噬泡形成,而且通过与TECRP,但由于5-结合ATG5,促进不自噬体与溶酶体的融合[19],所以Atg/-小鼠仍是目前用于研究自噬相关功能最常用的小鼠。
基因敲除小鼠的靶基因敲除后可能影响小鼠生殖功能[28]除Atg5后并不影响小鼠的生殖能力,我们实验结果表明巨噬细胞条件性敲;在本实验中,我们探讨总结了最佳繁育方案,该繁殖方案可在较短时间、较高概率获得实验所需基因型小鼠,为后续研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制中的作用提供小鼠数量保障。
基因型鉴定是进行基因敲除小鼠繁育保种的重要环节[29]基因组DNA,。参照上海南方模式生物科技股份有限本研究采用碱裂解法提取鼠尾组织公司提供的引物序列,通过普通的PCR扩增凝胶电泳成功鉴定巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的基因型;与用DNA提取试剂盒提取基因组DNA相
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比,两种方法的检测结果一致,但碱裂解法耗时更短、费用更低(结果未展示),说明该方法可以作为检测巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的基因型的一种快速可靠方法。
综上,本研究成功建立了巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠模型且能正常繁殖。该小鼠模型为研究巨噬细胞自噬(Atg5)在肾脏疾病发病机制中的作用机制提供了可靠的体内实验模型。
参 考 文 献(References)
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[收稿日期] 2019-06-11
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