广谱乳酸菌素的研究

※生物工程　目晶科学　２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１１　４６９　广谱乳酸菌素的研究　牟光庆１，：，李霞ｚ，李慧ｚ，霍贵成　，　（１．东ｊ匕农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨　２．大连工业大学生物与食品工程学院，辽宁大连　摘１５００３０；　１　１６０３４）　要：研究的主要目的是筛选产广谱乳酸菌素的乳酸菌菌株，并将其产生的乳酸菌素进行提取和纯化研究。实　验从多种材料中筛选出２２株乳酸菌，采用牛津杯法选出抑菌活性最高的乳酸菌Ｂ　，该菌株经菌种鉴定为植物乳杆　菌。乳酸菌Ｂ　发酵液的抑菌圈直径为２２．１９ｍｍ，经硫酸铵盐析、透析脱盐、ＤＥＡＥ．５２离子柱层析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ．　２５凝胶柱层析后的抑茵圈直径分别为ｌ９．５４、２３．４６、２５．３２、２５．７６ｍｍ。采用高效液相色谱进行纯度检测，得到　个峰，说明该菌株发酵所产细菌素经一系列提取纯化操作后，纯度得到很大提高。此菌株产生的乳酸菌素不仅　对革兰氏阴性菌如大肠杆菌有较强抑制作用，而且对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌也有较强的抑制作用，是～种　广谱乳酸菌素。　关键词：乳酸菌素；筛选；鉴定；纯化　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｒｏａｄ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｃｔｏｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｂｒｏｔｈ　ＭＵ　Ｇｕａｎｇ—ｑｉｎｇ　１，２　ＬＩ　Ｘｉａ　２　ＬＩ　Ｈｕｉ　２　ＨＵＯ　Ｇｕｉ—ｃｈｅｎｇ　，　（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＭｉｌｋ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄａｌｉｎ　ａＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ，Ｄａｌｔｉａｎ　１　１６０３４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔＷａＳｔｏ　ｓｃｒｅｅｎｂｒｏａｄ　ｓｐｅｃｔｍｍｌａｃｔｏｌｉｎ－ｐｒｄｕｃｉｏｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｅｘｔｒａｃｔａｎｄ　黟ｔｈｅｌａｃｔｏｌｎｆｉｉ＇ｏｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｉｔｏｎ　ｂｒｏｔｈ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｔｗｏ　ｌａｃｏｌｔｉｎ－ｐｒｄｕｃｉｏｎｇ　ｌａｃｉｔｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ　ｆｒｏｍ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ａｎｄ　ｈｅｔ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ９，　ｔｈｅ　ｌａｃｔｏｌｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ，ＷａＳ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｏｘｆｏｒｄ　ｃｕｐ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ　ｆａｓ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ　ｂｙ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ　ｚｏｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｅ　ｔｂｒｏｔｈ　ｏｆ　ｈｅｔ　ｓｔｒａｎ　ｉ１３９　ｉｓ　２２．１９　ｎｌｌＴ１．Ｔｈｅ　ｂｒｏｔｈ　ＷａＳ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｗｉｈ　ｔｈｅ　ｔｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ　ｏｆ（ＮＨ４）ｚＳＯ４，ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ，ＤＥＡＥ一５２　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５　ｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｚｏｎｅｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎａｌｌｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ａｒｅ　１　９．５４，２３．４６，２５．３２　ａｎｄ　２５．７６　１Ｔｌｌｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｉｆｎａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｏｎｅ　ｐｅａｋ　ｗｉｈ　ｔｈｉｈ　ｇｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）．Ｔｈｅｐｕｒｉｙｏｆｔｔｈｅｌａｃｔｏｌｎｐｒｉｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｉｓ　Ｓｔｓｉｒｎｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒｅａｔｌｙｔｈｒｏｇｈｔｈｅ　ｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．　ｈｅｌＴａｃｔｏｌｉｎｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎｈａＳ　ｓｔｒｏｎｇａｃｔｉｖｉｙａｇａ￣ｔｎｏｔｏｎｌｔｙｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｋｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ｂｕｔａｌｓｏｇｒａｉｎ－　ｐｏｓｉｉｔｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｋｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｌｌｒｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｉｔｈａｓ　ａｗｉｄｅ　ｓｐｅｃｔｒｕｍａｇａｉｎｓｔｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｌｉｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　中图分类号：ＴＳ２０１．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２．６６３０（２００８）１　１－０４６９．０４　随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们　及柱层析结合牛津杯扩散法，对经过筛选的具有广谱抑　对健康的重视程度也日益增强。因而乳酸菌素作为一种　无毒、无任何副作用的天然防腐剂正迎合了人们的需　菌活性的乳酸菌所产乳酸菌素进行纯化及抑菌研究，以　期为广谱乳酸菌的研究提供试验科学依据。　１　材料与方法　１．１　材料与试剂　要。目前在国内外已研究的乳酸菌素中，对革兰氏阴　性细菌有抑制作用的乳酸菌素报道很少…。因此，研究　既对革兰氏阴性菌又对革兰氏阳性菌都有抑制作用的广　谱乳酸菌素具有重要意义。本实验拟通过盐析、透析　收稿日期：２００７．１１．３０　酸奶、酸菜汁、腊肠、泡菜、西红柿和干酪市售。　基金项目：辽宁省教育厅项目（２００６０１７５）；大连市科技项目（２ｏ０７Ｂ１ＯＮＣ１３９）　作者简介：牟光庆（１９６７－），男，教授，博士研究生，研究方向为功能性乳制品及食品发酵技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｑ６５５２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｎ　ｅ｝通讯作者：霍贵成（１９５８．），男，教授，博士，研究方向为动物营养及乳制品加工。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｃｈｕ０８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ　４７０　２００８，Ｖｏ，．２９，Ｎｏ．ＩＩ　艮品科学　※生物工程　ＭＲＳ培养基、分离培养基、检测培养基、肉汤　先用ｐＨ２．０盐酸缓冲液在０．５ｍｌ／ｍｉｎ条件下平衡柱　培养基和保藏培养基『２＿。　大肠杆菌和金黄色葡萄球菌　保藏中心。　１＿２　方法　子，上样，然后用Ｏ～Ｏ．８ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１溶液进行梯度洗　大连工业大学菌种　脱，分别洗脱２个柱体积，以平衡缓冲液为参比，在　２８０ｎｍ下检测每管的紫外吸光值。　１．２．８　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ．２５凝胶柱分离　用ｐＨ２．０盐酸缓冲液在０．５ｍｌ／ｍｉｎ条件下平衡柱子，　上样，然后用相同的缓冲液进行洗脱，检测２８０ｎｍ下　的紫外吸光值［８】。　１．２．９　纯度测定　１．２．１　乳酸菌的分离　将不同的实验样品进行预处理，然后按一定的稀释　倍数进行稀释，分别吸取稀释液各０．２ｍｌ，涂布于含溴　甲酚绿酒精溶液的ＭＲＳ培养基平板上，３７℃静置培养　４８ｈ。挑取使溴甲酚绿变色的菌落，划线分离纯化２～　３次，最后选择单菌落。经个体形态观察、革兰氏染　色镜检后４℃保存【３Ｊ。　１．２＿２　乳酸菌素的抑菌测定　用高效液相色谱检测分离到的样品的纯度。先用乙　腈．水（内含０．１％磷酸，ｐＨ２．０）溶液平衡柱子，然后上　样，用乙腈．水溶液进行线性洗脱。色谱柱：（２５０ｒａｍ　×４．６ｍｍ，５ｐｍ）Ｃ１　８柱；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；进样量：　２０ｐｌ；检测波长２８０ｎｍｔ’】。　２　结果与分析　将分离得到的乳酸菌接种到ＭＲＳ液体培养基中３７℃　培养４８ｈ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ除去菌体，得上清液，　按照牛津杯扩散法［４］进行操作，然后３７℃培养Ｉ　８　ｈ，测　定抑菌圈直径。　１．２＿３　乳酸菌发酵液中乳酸的定量测定　用吸管吸取离心除去菌体的发酵液５ｍＩ于１５０ｍｌ三角　瓶中，加水１０ｍｌ，加入酚酞指示剂２滴，用０．１ｍｏｌ／Ｌ　２．１　乳酸菌的分离　共分离出２２株乳酸菌，其中从酸奶中分离出４　株、酸菜汁中ｌｌ株、腊肠中３株、泡菜中１株、西　红柿中２株、干酪中１株。　２＿２　乳酸菌素产生菌的筛选　的ＮａＯＨ滴定至微红，计算产酸量。　乳酸（ｇ／１００ｍ１）＝（ＣＶ×９０．０８）×１００／样品毫升数　２．２．１　乳酸茵发酵液抑菌活性的测定　以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，按照１．２．２　方法对分离出来的２２株乳酸菌进行抑菌活性测定，结果　见表１。　式中，ｃ为ＮａＣＩ浓度（ｍｏｌ／Ｌ１；Ｖ为消耗ＮａＯＨ体　积（ｍＩ）；９０．０８为乳酸的摩尔质量（ｇ／ｏｏ１ｔ）。　１．２．４　乳酸菌菌种的鉴定　按照《伯杰氏细菌鉴定手册》【６］第八版和《乳酸菌分　类鉴定及实验方法》【２］对筛选得到的乳酸菌进行菌种鉴定。　１．２．５　硫酸铵盐析　由表１可见，对以上２株指示菌而言，乳酸菌Ｂ　、　Ｂ　２、Ｂ　３、Ｂ　Ｂ　ｏ、Ｂ－　这６株菌发酵液的抑菌活性最　强，不仅对革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌均具　有较强的抑制作用。　２．２．２　多株菌抑菌活性的比较　在离心发酵液中加入不同饱和度硫酸铵（３　０％、　４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％１，用　由于乳酸本身有抑菌作用，所以乳酸菌素抑菌活性　应是发酵液的抑菌活性减去相应乳酸的作用。按试验方　法１．２．３测定Ｂ　、Ｂ　２、Ｂ，、Ｂ　、Ｂ　ｏ、Ｂ。。这６株菌发　酵液中的乳酸含量，其结果见表２。　磁力搅拌机搅拌，使硫酸铵粉末完全溶解，静置过夜，　分别离心收集沉淀并称重【７Ｊ，按牛津杯定量扩散法测定　上清液的抑菌活性。　表２　乳酸菌发酵液的乳酸浓度　１．２．６　透析脱盐和浓缩　Ｔａｂｌｅ　２　Ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｊａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｒｏｔｈｓ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　取８０％硫酸铵盐析上清液，装入处理好的透析袋　内，放在ｐＨ５．５的乳酸溶液中进行透析，过夜。将透　析好的液体进行真空冷冻浓缩。　１．２．７　ＤＥＡＥ．５２阴离子交换柱层析　菌株号　Ｂ１　２０．６　Ｂ２　ｌ８．３　Ｂ３　ｌ６．７　Ｂ９　８．３３　ｌ５　Ｂｌｏ　１ｌ２７　２０．３　Ｂｎ　９３８　１６．９　４３　消耗ＮａＯＨ体积（ｍ１）　１１．１０．１６　９．２７　乳酸浓度（ｇ　表１　乳酸菌发酵液抑菌活性测定结果　Ｔａｂｌｅ　１　Ａｎｔ．ｂａｃｔｅ　ｒｉａＩ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｂｒｏｔｈ　ｏｆ　２２　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　※生物工程　食品科学　２００８，ＶｏＬ　２９，Ｎｏ．ＩＩ　４７１　以大肠杆菌为指示菌，测定Ｂ－、Ｂ　ｚ、Ｂ，、Ｂ　、　Ｂ－ｏ、Ｂ。。这６株菌相应乳酸对应的抑菌圈，与发酵液抑　菌圈做差值，其结果如表３所示。　表３　乳酸菌发酵液抑菌活性的比较　Ｔａｂｌｅ　３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｒｏｔｈｓ　Ｂ１　ｔｏ　Ｂ１１　由表３可以看出，Ｂ　的抑菌圈差值最大，所以选　Ｂ　菌株为研究对象。　２－３　乳酸菌菌种的鉴定　个体和菌落形态观察及革兰氏染色：镜检可知菌体　呈杆状，单个、成对或成链状排列；茵落边缘整齐、　突起、光滑，乳白色不透明；革兰氏阳性、无芽胞。　生理生化实验结果：该菌株能够发酵葡萄糖、蔗　糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖和棉子糖；不能　发酵阿拉伯糖和木糖；吲哚试验、甲基红试验、Ｖ．Ｐ试　验、硫化氢产生试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用　试验、硝酸盐还原试验、接触酶试验和运动性试验都　呈阴性；三糖铁培养基反应试验和石蕊牛乳试验呈阳　性。　根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《乳酸菌　分类鉴定及实验方法》初步确定该株菌为植物乳杆菌。　２．４　乳酸菌素的提取与纯化　２．４．１　硫酸铵盐析　在乳酸菌Ｂ　的离心发酵液中加入不同饱和度的硫酸　铵进行盐析，其结果见图１。　§　韪　匾　瓶　转　图１　硫酸铵饱和屋的确定　Ｆｉｇ．１　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ（ＮＨ４）２ＳＯ４　ｆｏｒ　ｒｅｍｏｖｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂｒｏｔｈ　由图１可以看出，随着硫酸铵饱和度的增加，沉　淀量逐渐增加，但发酵液的抑菌活性变化不大，抑菌　圈直径略有减小，说明抑菌物质仍保留在发酵液中。发　酵液抑菌活性的少量减少可能是由于蛋白质在沉淀过程　中包裹或吸附了少量的乳酸菌素。当硫酸铵的饱和度达　８０％时，离心发酵液中的大部分杂蛋白质被沉淀下来，　加　而且乳酸菌素在此时损失也较少，综合考虑各因素，选　择８０％的硫酸铵饱和度进行盐析。　２．４－２　透析及浓缩　经过盐析后的发酵液中含有大量的硫酸铵，在浓缩　过程中会有晶体析出，所以在浓缩前应先除去，本实验　选用透析的方法。如果在水中进行透析，透析的过程中　发酵液中的乳酸可被除去，发酵液的ｐＨ值发生变化，　将导致乳酸菌素的活性改变，所以实验选择在ｐＨ５．５的　乳酸溶液中进行透析。　透析后的发酵液，经真空冷冻浓缩后，发酵液体　８　６　４　２积浓缩至ｌ　００ｍｌ，继续进行后期实验。　２．４ｌ３　ＤＥＡＥ．５２离子柱层析纯化乳酸菌素　用Ｏ．２～０．８　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１进行梯度洗脱，洗脱结果　见图２。　日兽嚣凸０　０　Ｏ　０　０　Ｏ　０　Ｏ　７　６　５　４　３　２　１　Ｏ　ｌ　８　１５　２２　２９　３６　４３　５Ｏ　５７　６４　７１　７８　８５　９２　９９　管号　图２　ＤＥＡＥ－５２离子柱层析紫外吸收峰　Ｆｉｇ．２　ＤＥＡＥ－５２　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｂｒｏｔｈ　ａｆｔｅｒ　ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ　ａｎｄ　ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　由图２可以看出，有３个吸收峰，经检测只有第　２个吸收峰有抑菌活性，而第１个蛋白峰和第３个蛋白　峰均无抑菌活性，可以确定为杂蛋白峰。在洗脱第３０　管时有抑菌现象出现，第３２管时活性达最大，在其他　处未出现抑菌峰，说明发酵液中的杂质已大大减少，活　性成分也相对比较集中。所以收集第３２管的液体，做　进一步实验。　２．４．４　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ．２５凝胶柱层析纯化乳酸菌素　１　９　１　７　２５　３３　４１　４９　５７　６５　７３　８ｌ　８９　９７　管号　图３　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５凝胶层析紫外吸收峰　Ｆｉｇ．３　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　３２　Ｈ　　４７２　２００８，　｜『．２９，Ｎｏ．１１　食品科学　（ｎ备一　恒鹫　※生物工程　４　将经过ＤＥＡＥ一５２柱层析得到的峰ＩＩ液体先于４℃透　Ｄ　×　析２４ｈ，冷冻干燥后用ｐＨ２．０的盐酸缓冲溶液溶解，然　后进行Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ．２５凝胶柱分离。用ｐＨ２．０的盐酸缓　冲液洗脱，洗脱结果见图３。　由图３可以看出。吸收峰只有１个，牛津杯检测　有活性，从第９管开始有活性，第１　ｌ管活性最大，所　以收集第１ｌ管。　２．４．５　高相液相色谱纯度检测　将收集的第ｌｌ管溶液用高效液相色谱进行纯度检　测，结果见图４。　２　４　６　时间（ｒｏＡｎ１　图４　禹效液相色谱图（图３中１１管）　Ｆｉｇ．４　Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　１　１　（ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎ　Ｆｉｇ．３）　由图４可知，样品有１个峰，说明样品已得到较　好的纯化。　２．４．６　乳酸菌素的纯化结果　Ｂ，所产乳酸菌素经硫酸铵盐析、透析及浓缩、离　子柱层析及浓缩、凝胶柱层析及浓缩处理后得到精制乳　酸菌素，其结果见表４。　从表４可以看出，经硫酸铵盐析后的发酵液抑菌圈　直径有所减小，可能是因为蛋白质在沉淀过程中包裹或　吸附了少量的乳酸菌素，影响了其抑菌活性。经过接　下来的不断纯化使得发酵液的抑菌圈直径不断地变大。　说明乳酸菌Ｂ　产生的乳酸菌素经上述几步纯化后，其纯　度明显提高。但在纯化过程中有一定的损失，回收率　不是很高，有待进一步优化实验方案。　从表４可以看出，经硫酸铵盐析后的发酵液抑菌圈　直径有所减小，可能是因为蛋白质在沉淀过程中包裹或　吸附了少量的乳酸菌素，影响了其抑菌活性。经过接　２　Ｄ　表４　乳酸菌素纯化结果　×　Ｔａｂｌｅ　４　Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｌｉｎ　Ｄ　下来的不断纯化使得发酵液的抑菌圈直径不断地变大。　说明乳酸菌Ｂ，产生的乳酸菌素经上述几步纯化后，其纯　度明显提高。但在纯化过程中有一定的损失，回收率　不是很高，有待进一步优化实验方案。　３　结　论　从多种分离材料中分离得到２２株乳酸菌，采用牛津　杯法对这些菌株进行抑菌实验，筛选出６株抑菌活性较　高的乳酸菌。排除发酵液中乳酸的影响，筛选得到ｌ株　活性最高的菌株。对所筛株菌进行菌种鉴定，确定为植　物乳杆菌。对该株菌产生的乳酸菌素进行提取和纯化，　经过硫酸铵盐析、透析、浓缩、ＤＥＡＥ．５２离子柱层析　和Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ．２５凝胶柱层析后，进行高相液相色谱纯度　检测，结果为单一峰，说明样品已得到很好的纯化。　参考文献：　［１】　ＪＡＣＫ　Ｒ　Ｗ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ　ｏｆｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｉａ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，５９（２）：１７１—２００．　［２】　凌代文，陈秀珠．乳酸菌分类鉴定和实验方法【Ｍ】．北京：中国轻　工业出版社．１９９９．　【３】　石金舟，陈丽园，张明，等．１株产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定［Ｊ】．中　国微生态学杂志，２００５，１７（６）：４１３—４１４．　【４］　ＣＡＳＬＡ　Ｄ，ＲＥＱＵＥＮＡ　Ｔ，ＧＯＭＥＺ　Ｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｏａｔ，ｍｉｌｋ　ａｎｄ　ａｒｔｉｓａｎａｌ　ｃｈｅｅｓｅｓ：ｃｈａｒａｅｔｅｒｉｓ．　ｔｉｃｓ　ｏｆａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓ　ＩＦＰＩ　１０５［Ｊ］．　Ａｐｐｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９６，８１：３５—４１．　［５】　祝嫦巍，王昌禄，顾晓波，等．新型乳杆菌素产生菌的筛选及菌株特　性的研究［Ｊ］．氨基酸和生物资源，２００２，２４（１）：２２．２５．　［６］　布坎南ＲＥ，吉本斯ＮＥ．伯杰氏细菌鉴定手册［Ｍ】．８版．北京：科学　出版社．１９８４．　【７】　曾志刚，陈英，余伯松，等．细菌素产生菌的筛选及其细菌素的分离　纯化【Ｊ】．中国抗生素杂志，２００３，２８（５）：２５７－２９８．　［８］　杨洁彬，郭兴华．乳酸菌．生物学基础及应用［Ｍ】．北京：中国轻工业　出版社．１９９６．　【９】　吴红艳，陈飞，桓明辉，等．乳酸菌肽分离纯化研究【Ｊ］．微生物学杂　志，２００６，２６（２）：１０４—１０６．