(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105176823 A (43)申请公布日 2015.12.23
(21)申请号 201510313160.6(22)申请日 2015.06.10
(71)申请人舟山出入境检验检疫局综合技术服
务中心
地址316000 浙江省舟山市定海昌国路222
号(72)发明人胡兴娟 沈飚 邵宏宏 周秀锦
徐君辉 杨赛军(74)专利代理机构杭州杭诚专利事务所有限公
司 33109
代理人尉伟敏(51)Int.Cl.
C12N 1/04(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)
权利要求书2页 说明书9页 附图1页
(54)发明名称
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法(57)摘要
本发明涉及微生物能力验证技术领域，公开了一种微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括：(A)、菌株的复苏、增菌；(B)、菌株的分离；(C)、菌悬液的制备；(D)、冷冻干燥和包装。最后制备的样品包括：简单级阴性样品，简单级阳性样品；中级阴性样品，中级阳性样品；困难级阴性样品，困难级阳性样品。同一等级的样品配对使用。本发明方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，且具有合理的不同难度等级标准。 C N 1 0 5 1 7 6 8 2 3 A CN 105176823 A
权 利 要 求 书
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1.微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，其特征在于包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定；
(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥；
(C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液；
简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液；
中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液；
中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液；
困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液；
困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液；
上述份数均为重量份数；(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-22℃至-18℃温度下预先冻结7-9h，接着转移到温度为-50℃至-40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45-55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5-2.5h；结束后对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，将所述样品贮存于4℃的环境中。
2.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（A）中各菌株的培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为2-4g/mL。
3.如权利要求2所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所
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述步骤（B）中对培养有菌株的各个培养基进行分离前，将所述培养基放置于45-50℃的环境中1-2h。
4.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤（C）配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液中还添加有壳聚糖和聚乙烯醇中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖或聚乙烯醇在所述脱脂牛乳水溶液中的浓度均为0.2-0.5wt%。
6.如权利要求4或5所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。
7.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤（D）中对所述安瓶进行封口和压盖时在冷冻干燥机的干燥箱内操作，且封口后安瓶内为真空状态。
8.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤（A）中对各标准菌进行复苏培养时，用接种环挑取一环菌株，并将其接种到10mL的培养基中。
9.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤（B）中配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液的浓度为10wt%，菌悬液中目标菌的浓度为5×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104 cfu/mL。
10.如权利要求1所述的微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤(D)中，安瓶在的预先冻结温度为-20℃，预先冻结8h；接着转移到的冷冻干燥机的温度为-45℃；对安瓶的升华干燥时间为50h；对安瓶的解析干燥时间为2h。
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说 明 书
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法
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技术领域
本发明涉及微生物能力验证技术领域，尤其涉及微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法。
[0001]
背景技术
能力验证是实验室外部质量控制的有效措施之一，也是计量从证和实验室认可的
必备条件。实施微生物能力验证能够有效评估参与实验室进行相关微生物检验的技术能力。
[0003] 沙门氏菌作为近年我国食品中毒和食源性疾病常见的病原菌，是能力验证项目常选用的目标菌。但是目前，微生物学检验领域尚无高可信度、高通量的微生物能力验证制备技术，不确定因素较多，使得实验室间能力验证的可信度大打折扣。[0004] 曹文博等在《食品安全质量检测学报》的2015年第6卷第1期公开了一种沙门氏菌能力验证样品的制备方法：采用真空冷冻干燥的方式制备样品，该方法在一定程度上提高了样品的稳定性和均匀性，但是仍然不够理想，且缺乏难度等级对比标准。[0005] 现有的微生物能力验证沙门氏菌样品，样品的菌种稳定性较差，菌种的存活率也较低，且不同种类样品的验证难度不一，缺乏对比标准，因而使得微生物能力验证的意义也大打折扣。
[0002]
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微生物能力验证沙门氏菌样品的制备
方法，该方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，具有合理的不同难度等级标准。[0007] 本发明的具体技术方案为：微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。[0008] (B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。[0009] (C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。
[0006]
简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到
浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。
[0010]
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说 明 书
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中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。[0012] 中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。[0013] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。
[0014] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。[0015] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-22℃至-18℃温度下预先冻结7-9h，接着转移到温度为-50℃至-40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45-55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5-2.5h；结束后对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0016] 本发明选用沙门氏菌为目标菌，选用粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，并且根据干扰菌与沙门氏菌检测时的相似程度，制备成三个难度等级样品组，每个样品组包括阳性样品和阴性样品。按本发明方法制备的样品，通过控制制备过程中的各项参数，使得样品中菌种的稳定性和存活率较高。[0017] 作为优选，所述步骤(A)中各菌株的培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为2-4g/mL。在培养基中添加海藻糖的目的是，菌类在将海藻糖作为碳源进行吸收 后，海藻糖能够进行菌类的细胞膜内部，当进行后续的冷冻干燥过程时，海藻糖的存在能够提高菌类的抗冻能力，使得细胞内的细胞液不易形成冰晶，避免了由于细胞内部的细胞液变成冰晶，升高了细胞的渗透压而导致菌类死亡的情况。[0018] 作为优选，在所述步骤(B)中对培养有菌株的各个培养基进行分离前，将所述培养基放置于45-50℃的环境中1-2h。在进行分离前对培养基进行上述步骤，有利于菌株对培养基中海藻糖的吸收，有利于海藻糖进入菌株细胞内部。[0019] 作为优选，在所述步骤(C)配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液中还添加有壳聚糖和聚乙烯醇中的一种或多种。壳聚糖或聚乙烯醇的存在，在对菌悬液进行冷冻干燥时，作为对冷冻保护剂脱脂牛乳的补充，壳聚糖或聚乙烯醇在冷冻干燥过程中成为凝胶，具有众多的三维孔道结构，能够对菌株进行一定程度的包埋和吸附，形成了一个缓冲保护层，起到了一个隔离作用，在一定程度上削弱了极低温度对菌株的影响。此外壳聚糖和聚乙烯醇可被菌类自然分解，对菌类无害。
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作为优选，所述壳聚糖或聚乙烯醇在所述脱脂牛乳水溶液中的浓度均为0.2-0.5wt％。
[0021] 作为优选，所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。在此分子量范围的聚乙烯醇黏度较低，适合作为保护剂。[0022] 作为优选，在所述步骤(D)中对所述安瓶进行封口和压盖时在冷冻干燥机的干燥箱内操作，且封口后安瓶内为真空状态。[0023] 作为优选，在所述步骤(A)中对各标准菌进行复苏培养时，用接种环挑取一环菌株，并将其接种到10mL的培养基中。[0024] 作为优选，在所述步骤(B)中配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液的浓度为10wt％，菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL。[0025] 作为优选，在所述步骤(D)中，安瓶在的预先冻结温度为-20℃，预先冻结8h；接着转移到的冷冻干燥机的温度为-45℃；对安瓶的升华干燥时间为50h；对安瓶的解析干燥时间为2h。
[0026] 与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，且具有合理的不同难度等级标准。附图说明
图1是保存温度以及保存时间对实施例2中简单级阳性样品稳定性的影响。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。[0028] 实施例1
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠 檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株，将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到10mL的营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。[0029] (B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。[0030] (C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。[0031] 简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。
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中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。[0034] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。
[0035] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。
[0036] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-20℃温度下预先冻结8h，接着转移到温度为-45℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔 板上，升华干燥50h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥2h；结束后在冷冻干燥机的干燥箱内对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，封口后安瓶内为真空状态，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0037] 实施例2
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株，将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到10mL的营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。所述培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为3g/mL。[0038] (B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时，将培养基放置于48℃的环境中1.5h，然后对培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，将培养基放置于48℃的环境中1.5h，对培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。
[0039] (C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。
[0040] 简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0041] 中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添
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加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0042] 中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％壳聚糖和聚乙烯醇。[0043] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0044] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为10wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.3wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。
[0045] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-20℃温度下预先冻结8h，接着转移到温度为-45℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥50h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥2h；结束后在冷冻干燥机的干燥箱内对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，封口后安瓶内为真空状态，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0046] 实施例3
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株，将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到10mL的营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。所述培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为4g/mL。[0047] (B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时，将培养基放置于45℃的环境中2h，然后对培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，将培养基放置于45℃的环境中2h，对培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。
[0048] (C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0049] 简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到
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浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为7×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0050] 中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为7×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0051] 中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为7×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0052] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为7×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0053] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为7×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为7×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.5wt％壳聚糖。[0054] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-22℃温度下预先冻结7h，接着转移到温度为-50℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5h；结束后在冷冻干燥机的干燥箱内对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，封口后安瓶内为真空状态，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0055] 实施例4
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株，将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到10mL的营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。所述培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为2g/mL。[0056] (B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时，将培养基放置于50℃的环境中1h，然后对培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，将培养基放置于50℃的环境中1h，对培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。
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(C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳
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水溶液中，控制菌悬液的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。
[0058] 简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为3×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。[0059] 中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为3-×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。[0060] 中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为3×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。[0061] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为3×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。[0062] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬 液中目标菌的浓度为3×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为3×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度为0.2wt％的聚乙烯醇。[0063] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-18℃温度下预先冻结9h，接着转移到温度为-40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥2.5h；结束后在冷冻干燥机的干燥箱内对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，封口后安瓶内为真空状态，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0064] 实施例5
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：
(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株，将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到10mL的营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。所述培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为3g/mL。
(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时，将培养基放置于46℃
的环境中1.5h，然后对培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至
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对数生长期后，将培养基放置于46℃的环境中1.5h，对培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。
[0066] (C)、菌悬液的制备：
简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。
[0067] 简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为4×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0068] 中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为4×102cfu/mL，各干扰菌 的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0069] 中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为4×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0070] 困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为4×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。[0071] 困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为9wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为4×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为4×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。所述脱脂牛乳水溶液中还添加有浓度均为0.4wt％的壳聚糖和聚乙烯醇。
[0072] 上述份数均为重量份数；
(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-20℃温度下预先冻结8h，接着转移到温度为-45℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥50h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥2h；结束后在冷冻干燥机的干燥箱内对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，封口后安瓶内为真空状态，将所述样品贮存于4℃的环境中。[0073] 样品的稳定性评价
1保存温度对样品稳定性影响
冻干后的微生物样品需置于冷藏条件下以保证其稳定性。鉴于能力验证发样时地理跨度大，发放样品的过程预计1-3d时间，期间36℃或以上高温天气和封装环境可能会造成样
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品的失效，因此本试验进行了样品在不同温度条件下的稳定性试验，选取实施例2中简单级阳性样品作为测试对象，结果如图1所示。[0074] 2保存时间对样品稳定性影响
选取实施例2中简单级阳性样品作为测试对象，在4℃的保存条件下保存样品180d，并在180d内选取7个时段，每次随机抽取2-4份样品进行复苏、计数和鉴定，结果如图1所示。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
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