猪成纤维细胞的简易分离培养

刘西梅;华再东;任红艳;肖红卫;李莉;华文君;张立苹;毕延震

【摘 要】比较了不同来源、不同状态组织和不同分离方法对猪成纤维细胞的影响,结果表明,离体组织长时间乙醇预处理和长时间储运会降低细胞活力,使生长速度减慢;初始原代细胞种类比较多,生长不均匀,只有传代培养3代以上,才能得到比较纯的成纤维细胞.%In this study, the effects of different sources, status of organ and isolation method on porcine fibroblasts were compared. The results showed that the cells viability of organ in vitro reduced when pretreated by alcohol or long-time stor-age, and the growth rate was slow. The primary cell had many types and grew uneven. The cells need to be cultured after three generations to obtain pure fibroblasts. 【期刊名称】《湖北农业科学》 【年(卷),期】2017(056)004 【总页数】3页(P702-703,726) 【关键词】猪;成纤维细胞;分离;培养

【作 者】刘西梅;华再东;任红艳;肖红卫;李莉;华文君;张立苹;毕延震

【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物

胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064 【正文语种】中 文 【中图分类】R329-33

随着生物技术的发展，原代成纤维细胞已经成为非常特殊的资源［1］。由于试验材料来源广、分离培养条件不苛刻，细胞的分裂增殖能力强，适应性好，且性状稳定［2，3］，同时又能模拟体内生长状况、生长环境简化、生长条件明确、施加实验因素方便、容易获得直接活体观察结果以及方便控制培养产物等特点［3，4］，所以成纤维细胞得以广泛地研究和应用。医学上用于疾病诊断、人工皮肤、组织创伤修复、组织器官培养［1，5］；动物上用于体细胞克隆、转基因［6，7］，以实现濒危畜禽保种及扩繁、优良品种的快速繁育、转基因新品种培育；基础研究上为遗传学、细胞学、胚胎学、组织学、免疫学等提供基础材料和分离培养模式［8］。因此，建立一种快速、实用、简便的猪成纤维细胞分离培养方法成为急需。本研究比较了不同来源、不同状态组织和不同分离方法对成纤维细胞的影响，旨在为相关研究提供依据。 1.1 材料、仪器及试剂

35 d的胎猪、新生小猪、成年猪；超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、血球计数板；乙醇、PBS溶液、DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、中性蛋白酶、胰蛋白酶；青霉素、链霉素、台盼蓝、EDTA、DMSO。除了特别说明外，其他试剂均源于Sigma公司［1，7，9，10］。

1.2 试验方法

1.2.1 组织取样通过手术，从怀孕35 d的湖北白猪母猪体内无菌取出胎儿，浸泡在PBS（100 IU／mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，室温尽快带回实验室无菌间，在超净工作台上，用镊子去除胎儿头、尾、四肢、心脏及其他脏器，用PBS清洗后，用眼科剪将胚胎剪碎成约1 mm的3小块，用PBS冲洗2次，再用相应的培养基洗1次，备用［9］；耳组织来自湖北白猪耳边沿皮肤（大、小猪均可），经剪毛、清洗、消毒、生理盐水再清洗后，在耳边沿无菌剪取多个皮肤约0.5 cm2，放入PBS（100 IU／mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，室温2 h内运回实验室，在超净工作台上去除表皮及皮下组织，用PBS溶液洗涤2次，将组织剪成约1 mm的3小块，用相应的培养基洗1次，备用［6］。

1.2.2 细胞培养组织块培养是将组织块直接接种到培养皿上，或是将组织块用0.25%中性蛋白酶在4℃处理2～4 h，剩余组织块以1～2 mm间距接种于培养瓶内壁或培养皿上，加入少量DMEM培养液（含10%FBS），置于39℃的5%CO2培养箱中培养24 h，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，3 d后换液［1］；如果是细胞培养，则向剪碎的组织块中加入约2倍组织块体积的37℃预温的0.25%胰酶（含0.04%EDTA），在4℃中消化12～16 h（期间有规律地摇晃3～4次），加入DMEM培养液（含10%FBS）终止消化；取上清液，以800 r／min离心5 min，弃上清液，然后加入培养液，轻轻吹打重新悬浮细胞，以5×104个/mL的密度接种于培养瓶或培养皿中［9］。

1.2.3 细胞传代细胞在组织块周围生长成片时，或当培养的细胞达到85%～90%汇合度时传代。加入2 mL 0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA混和溶液（Gibco）消化细胞3～4 min（细胞边沿开始有收缩即可），加入2 mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，转入离心管，1 000 r／min离心5 min，用培养液重新悬浮细胞，计数后以5×104个／mL的密度接种于新培养瓶继续培养，经过5～7 d

的生长后，细胞达到85%～90%汇合，再次按1∶3或1∶4比例进行传代培养。如此反复传代，可以进一步纯化成纤维细胞［6］。 2.1 组织块处理

组织细胞离开身体后非常脆弱，任何处理都会对细胞造成伤害，乙醇消毒、运输时间等会影响原代细胞的生长，其中乙醇长时间消毒对细胞的伤害最大，其次是运输时间。培养7 d后，细胞的生长状况见表1。

从表1中可以看出，乙醇短时间处理组织对细胞生长没有影响，而处理时间延长会使细胞生长减慢，但这种处理对活体组织没有影响，即在组织没有离开肌体前处理，不影响组织采集后细胞的生长。

由表2可见，运输时间1～2 h对细胞生长几乎没有影响，然而当运输时间达到4 h时细胞生长活力开始降低，6 h时已不适宜作为原代细胞分离培养。所以分离原代成纤维细胞时，取组织后应尽快运回实验室培养，这样可以提高成功率。 2.2 成纤维细胞的培养与分离

从组织中开始分离的原代细胞种类比较多，而且生长不均匀，无法判断成纤维细胞（图1，图2），只有传代培养3代以上，才能得到比较纯的成纤维细胞（图3，图4）。

培养7～8 d的组织块周围可见多边形细胞并向四周成片生长，培养13 d时传代培养，传代后细胞生长迅速，约6 d细胞即可长满培养板；消化法得到的细胞培养5 d，细胞开始向周围快速生长，大约培养11～12 d即可传代，传代后6 d细胞长满培养板［6］。

成纤维细胞是非常重要的供体细胞之一，无论是用组织块培养获得，还是用消化培养制备，均可获得比较纯的成纤维细胞。但前期处理会影响原代细胞的生长，特别是离体后，样品长时间储运会降低细胞的生长速度，乙醇长时间消毒处理直接抑制细胞的生长，样品离体前乙醇处理对细胞的生长影响较小。其原因可能是离体前处

理，乙醇被血液及组织液稀释或带走，进入组织细胞的乙醇浓度不容易快速升高，对细胞活力影响小，而离体后组织细胞中的乙醇浓度很快达到峰植，直接影响了细胞的活力；离体组织长时间储运由于没有营养，细胞代谢受到影响，细胞活力有所降低，但影响较小。

组织块和消化法分离的细胞均可用于体细胞克隆，两者的差别在于分离细胞所用的时间长短不一，对于纯度要求不高的细胞而言，消化法比组织块法更快收获大量的1～2代细胞。其原因是原代培养时，消化法原始生长点比组织块法多很多，消化后每个细胞都可能成为一个原始生长点，而每个组织块只是一个原始生长点，组织块的数量限制了原始生长点数量。但两种方法分离到的成纤维细胞传到3代以后，其生长无差别。

【相关文献】

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［2］王亮，刘婷婷，彭涛，等.荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2006（5）：9－12.

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［5］蒋俊，徐瑗，尚宇阳，等.介绍一种简易的成纤维细胞培养方法［J］.实用手外科杂志，2001，15（2）：97.

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［8］孟凡华，肖红梅，张东，等.蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析［J］.中国畜牧兽医，2012，39（3）：129－133.

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