细菌DNA的提取

这里提供的是由Marmur于1961年建立，经Dale等人简化和发展，此方法略加修改后可用于其他细菌种类。主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化，所提取的DNA无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子克隆。 ⑴材料

①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后，4摄氏度保存可长期使用)

②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。

③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。 ④蛋白酶K

⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA ⑵方法

①取单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用试管）

②将上述菌液接种于200mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用500ml或1000ml三角瓶） ③离心，收集沉淀（5000r/m,10分钟）

④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中，混匀。

⑤加入200mg SDS，室温下振荡过夜，使细菌细胞充分裂解，裂解液呈粘稠状

⑥加入等体积的酚/氯仿溶液，温和地混匀，细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面），重复萃取三次 ⑦加入2倍体积无水乙醇，此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集

⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（最终浓度50ug/ml），37℃保温1小时 ⑨加入蛋白酶K（50ug/ml）,继续保温1小时

⑩加入等体积苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇，－20℃静止过夜

25000g，4℃，离心15分钟，收集沉淀，用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES缓冲液中，4℃保存备用。 ⑶说明

①本方法可用于其他种类细菌，但是溶菌条件需略加修改，对革兰氏阳性菌（如葡萄球菌），在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁，对于另外一些细菌（如分枝杆菌），在加入SDS后，将溶液加温至65℃是可取的。

②一些种类的细菌含大量核酸酶，去垢剂不能完全抑制其活性，用TES缓冲液代替SSC缓冲液可通过EDTA的作用抑制核酸酶活性，必须注意的是，TES缓冲液离子强度较低，在加入乙醇之前需用醋酸钠调节DNA溶液的离子强度（醋酸钠的最终浓度为0.3mol/L） ③DNA溶液中残留少量酚和氯仿，可在乙醇沉淀之前用水饱和乙醚萃取去除 ④比较纯净的DNA溶液的Ａ260/A280及A260/A235大于1.7

DNA的提取-细菌DNA的提取方法

2008/11/03 08:47 P.M.

针对一些不易于提取的细菌的方法:& R* Q( a6 q$ H% f, G, H( W 试验试剂：

抽提缓冲液：2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) （去色素） 100mM Tris-HCl (pH8.0) 25mM EDTA (pH8.0)2.0M NaCl 10M LiCl 2M LiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）% s e4 z/ I8 [0 M+ | 3M NaAc (pH5.2) 96% 乙醇

70% 乙醇0 i# {: B- F% F0 H) H- a 试验步骤：

1、 抽提缓冲液65℃预热。$ |9 G5 M+ N; a4 n4 L/ D! g8 ]

2、 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。& x5 l\" P: _4 K2 N& Y8 y 3、 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。 4、 取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。 5、 重复再作一次步骤4。

6、 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。; N5 u m( q6 V0 J' d 7、 以2,000rpm，离心10min。

8、 弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。- C9 C% p4 v6 o7 r1 p & U% V) p* q2 e* ]$ q% [

较为常用的细菌DNA提取方法：\" X2 V& e& f/ j7 @. d. n5 p 实验步骤：

1、 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。# C+ l3 f0 w6 M% g# X0 o 2、 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。& x, a6 L0 x2 T, |- L( A\" Y* N

3、 沉淀中加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.0 r\" G8 B4 G! c# x$ f# l% u

4、 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。# X; G) j/ Y3 T6 J; X( W, Y0 w4 \\7 _ 5、 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。. `7 Y. r% e8 p. \\

6、 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 真菌DNA提取总结的两种方法： 第一种方法： l1 R6 p/ k$ j: `+ a 试验步骤：

1、 取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉。 2、 加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、 加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。 4、 以4℃，1000rpm，离心5min。

5、 上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000 rpm，离心5 min。 Q% g+ p/ _# E# a* A5 `6 ^1 V 6、 取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min。. u2 {! w0 {6 R& o 7、 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500ulTE中。 8、 加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃下处理1 h。

9、 用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000 rpm，离心5 min。( j6 `% e$ P6 | 10、 取上清，加入1/10倍体积的 3M NaAc,2.5倍体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上。 11、 沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用。

DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS， 3M NaAc 。 第二种方法：

试验步骤：3 f' N; ]8 s$ s' t- E3 f7 w! o

1、 真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉。

2、 加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次。 3、 加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min。

4、 等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）。 5、 取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min。

6、 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500ulTE中。) |9 S- R* |& A 7、 加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 h。7 ]\" u4 g# n/ p* k

8、 用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000 rpm，离心5 min 。\" `, r\" g) S9 \\% s4 o 9、 取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上。3 c- j4 G) u\" K9 z2 s8 g9 M 10、 沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。 细菌基因组DNA提取方法综述

点击次数：1713 发布日期：2008-12-2

细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。

1 快速微量提取法

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备

先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3

1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。

3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）

4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）

5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。 6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。 4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL 1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.

2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C

4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.

5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.

6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.

7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).

Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube. 9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA. 11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 5 1) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。

2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。

4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。

5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。

注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2)氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一 二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500μl TE缓冲液中混匀 30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时 100μl NaCL(5M) 混匀 80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃ 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min 取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。注意 １，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,•可以获得较为完整的DNA分子。 基因组DNA的提取 第一节 概 述

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 第二节 从植物组织提取基因组DNA

一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。

二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、 RnaseA母液：配方见第一章。

5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取

1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。

2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4. 室温下5000rpm离心5分钟。

5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。

9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。

13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA 1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。

2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。 4. 同本节（一）中步骤3-13操作。 第三节 从动物组织提取基因组DNA 一、材料

哺乳动物新鲜组织。 二、设备

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂

1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤:

1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。

4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。 7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。

9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。 第四节 细菌基因组DNA的制备 一、材料 细菌培养物。

二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

四、操作步骤：

1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。

2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。

4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。

5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组DNA的检测

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。

3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。

（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。

PCR扩增技术

录入时间:2009-6-29 9:27:48 来源：青岛海博

PCR的全称是聚合酶链式反应(polymeras e chain reaction),它是由Kary Mullis于1987年发明的。1976年人们发现 了一种特殊的DNA聚合酶,它可以耐受94℃高温而不失活。1985年Saiki等人发现用聚合酶Kle now大片段催化25次DNA聚合反应(由于此酶不耐高温,所以每次反应需加入新的Klenow片段) 可以将原有的DNA量特异地增大数百万倍。将上述两个实验合并在一起,用抗高温的DNA聚合 酶( Taq 或 Vent )代替Klenow片段就形成了 目前广泛应用的具有高度敏感性的DNA PCR扩增技术。根据被扩增DNA片段的序列,人工合成 两端各约15～30碱基的单链DNA引物。取极微量的模板DNA,加入 Taq 或 Vent DNA聚合酶,A、C、G、T四种脱氧单核苷酸以及两端的DNA引 物,置于PCR扩增仪上即可以进行DNA扩增。一次PCR循环,包括变性→退火→延伸三个过程,通 常使用三个可调温度及时间:①DNA变性温度(一般为94℃)及时间,在此温度下模板DNA的双 链分开;②退火温度及时间,这个温度可以根据DNA引物的长度和G+C含量计算出来,一般在4 2℃～62℃之间。退火处理后,DNA引物互补杂交到变性的DNA模板上;③聚合酶延伸反应温 度多为72℃,反应时间随被扩增片段的长度而定,一般每合成1 000个碱基需要30~60秒和1单 位 Taq DNA聚合酶。如合成5kb片段,延伸反应时间应为5分钟,并使 用5单位 Taq DNA聚合酶(反应体积 为100μl)。有时PCR使用双温循环,即92～94℃变性→68℃退火和延伸。理论上,每循环一次 ,模板DNA量扩大一倍,所以模板DNA的量是按2为1,PCR循环25次后,模板数将增至2

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n指数幂进行扩增的,n代表PCR次数。如模板D NA数

,即33 554 432, 但在实际操作中,扩增效 率往往低于理论值。这是因为DNA引物经多

次循环后被消耗,在下一次循环时,没有足够浓度 的引物与模板退火杂交。此外,多次高温处理后, Taq DNA聚合酶活 性也会下降。即使这样,PCR也可在数小时之内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍,使其 在凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。这是PCR技术正逐步用于临床病毒检测的最重要原因。 另一方面,很高的合成效率使得PCR容易出现非特异性扩增,所以要获得预想的结果,必须选好 欲扩增片段在基因组上的位置,设计特异的引物序列,优化PCR反应的各种条件和选定适当的 循环参数。 计战略 引物设计

1、扩增片段的确定

(一) 诊断PCR技术的设

2、

为了获得特异的扩增,仅仅知道被检病毒的基因序列是不够的,必须选择病毒基因组上具有独特结构

的基因区域进行PCR扩增,这一 区域在序列组成或长度上,无论与较近亲缘关系还是较远亲缘关系的其他病毒应有明显的区别。

引物是影响PCR扩增效率和特异性的关键因素。作为诊断PCR,选择引物应遵循一些基本原则:①引物长度以15～30nt为宜;

②正义、反义二条引物链间的距离适中,一般使扩增出的片段在300～1 000bp之间,如果用反转录-PCR检测RNA病毒, 引物间距离控制在500bp左右最佳。片段过短则影响电泳结果判定,过长则不易扩增;③引物 碱基组成应随机分布,G+C含量在45%～55%左右为宜;④引物自身不形成二级结构,引物间不应 有互补序列(4个碱基以上);⑤引物序列必须是被检病毒特异的;⑥原则上引物3DNA一定要配对,此外310mmol/L Tris•HCl(pH8

末端碱基最好选T、C或G, 而不选A。3),1

5mm ol/L MgCl

3、PCR缓冲 液

2和100μg/ml明胶或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg 4、引物量

PCR反应中所用引物浓度通常在0

1～0

末端碱基与 模板2+浓度变化明显5 μmol/L之间。浓

5、dNTP

PCR反应标准缓冲液应含:50 mmol/L KCl,

影响反应的特异性和扩增效率。Mg效果,可先行预实验,以确定最佳Mg

2+过多则导致非特异扩增产物增加;Mg2+浓度。

2+不 足则扩增效率降低。为了取得最佳扩增

度 过 高将出现非特异片段的扩增,过低则不能扩增出足够的特异带,最佳用量可以通过系列浓度实 验来确定。dNTP(dATP,dTTP,dCTP和dGTP)溶液的pH值应调至7通常是2

7～25μg DNA),更 高浓度dNTP将导致错误掺入,从而影响扩增序列的真实性。

5单位。加酶 量过多将导致非特异性片段的扩增。 7 、变性剂

6、 Ta q DNA聚合酶

0 。在标准PCR反应中,每一种dNTP的使用浓度为50～200 μmol/L(足够产生

PCR反应中,该酶的用量,

反应中加入适量变性剂(如二甲亚砜、尿素、甲酰胺等)

可减少模板的二级 结构,提高反应的特异性。我们在用PCR扩增猪瘟病毒cDNA片段的反应中,加入5%甲酰胺,不但 提高了反应的特异性,而且目的cDNA片段的产量大大提高。 8、循环参数

用3种不同温度处理样品,使之变性,退火和延伸,就可进行PCR循环。PCR

操作可于三个不同温度的水浴锅内手动完成,或者于PCR循环仪上自动完成。变性是循环的第一步,变性不完全,扩 增明显受到影响,变性温度太高或时间太长, Taq DNA酶的寿命受到影 响,使得循环次数明显减少。绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间,时间通常控制在40秒左 右;退火是循环的第二步,退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性,是PCR 能否成功的关键因素。选择适当的退火温度,取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰 度。较高的退火温度可 提高引物与模板配对的特异性,从而提高反应的特异性。就含量和纯度较高的模板而论,对于 G+C含量在50%左右的约20nt长的引物,55℃是常用的退火温度。如果引物较短(12～15nt)退 火温度可降至40～45℃。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT PCR),在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明 显提高PCR的成功率。我们在猪瘟病毒和犬瘟热病毒基因组RT PCR扩增中,第一次

循 环的退火温度用37℃,从第二次循环开始改为50℃退火,成功地扩增出了常规退火温度下没 能扩增出的特异cDNA片段。无论什么样的退火温度,时间通常控制在50秒左右。循环的最后 一步是延伸,由于 Taq DNA聚合酶只有在高温下才能发挥最大活性, 所以延伸在70～75℃温度下 (通常在72℃)进行,但延伸反应的时间随欲扩增片段长度的增加而适当延长。一般来说,每扩 增1kb 的片段,用1分钟时间是足够的。温度及时间确定以后,PCR循环次数主要取决于模板量。但循 环次数通常选定在25～30次,经过这些次数循环后,PCR产物的累积即可达到电泳后肉眼可见程度。除非模板浓度极低,如只含一个拷贝,循环可增加至40次。了反应的特异性。

( 二) PCR反应的一般程序

①按以下程序,将各成份依次加入0

目前双温PCR正逐渐 被采用,

10倍标准PCR缓

5μg左 右 被③置选定的退火

其特点是退火与延伸在一个温度下进行,这一温度通常在68℃左右。双温PCR大大简 化了操作程序，缩短了操作时间，同时明显提高

5ml PCR反应管：

冲液 10μl 4种dNTP混合物,每种浓度为1温度，加入2

25 mmol/ L 16μl 正向引物 100pmol或0

5μg左右 反向引物 100pmol或0

②92～94℃变性5分钟;

检DNA样品取决于靶序列含量,可达2μg 加灭菌去离子水 至终体积100μl 石蜡油 20μl 最终导致非特异带扩增);延伸温度保温5～10分钟;KCl,

5单位 Taq DNA聚合酶(置退火温度以下,引物与模板可能出现许多非特异杂交,此时加入酶就可能有非 特异链的合成,

④置PCR仪或水浴锅,用选定的变性、退火和延伸温度及时间,进行25～40次自动或手动循环反应,最后一个⑤ 取5～10μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳、观察、拍照和记录。 10倍标准PCR缓冲液 : 500mmol/L

3,室温),3%～0

15mmol/L MgCl

2,

0

1％明胶或乙酰化BSA 末端向3

由于不同的反应条件,PCR合成 的

末 端向5

末端 (三)

5％的误差,因此,如果需要克隆PCR片段,制备点突变或缺失突变株时,最好使用 Vent DNA

末端合成DNA,也可以从3

100mmol/L Tris•HCl(pH8

DNA片段中碱基序列可能会有0

聚合酶。该酶具有校对错误 碱基的功能(proof reading activity),它可以从5PCR用于DNA病毒的检测

校对并水解掉错配的碱基,因此合成误差比 Taq DNA聚 合酶小得多。不过,在诊断上,这样的误差一般不会影响最终结果。

无论单链或双链病毒DNA，均可用PCR进行检测。检测样品可以是纯化DNA,也可以是细胞 、组织

3～1kb之间最佳。如果扩增片段达2～5kb,PCR

2、引物加长

及任何可能含有病毒的样品。一般无需提取DNA,可直接取少量样品(少于10μl),煮沸 变性10分钟后进行PCR测定。如前所述,PCR检测需要两个特异的DNA引物,引物之间的距离(决 定扩增DNA片段的长度)控制在0PCR的非特异反应,可进行如下调整。后,提高退火温度,增加反应的特异性;检测

反应产物在 随后的电泳中,可能出现多条DNA带,这时往往需要用Southern 转移杂交来鉴定哪一条是病毒 特异的带。为了尽量减少

1、增加DNA引物的长度。一般引物长15～20碱基,但可以增加到25～30碱基;3、选择其它DNA序列重新合成特异的DNA引物;

4、如果病毒的序列来源于cDNA ,则应考

(四) PCR用于RNA病毒的

虑到某些病毒DNA上含有内含子,可能使被扩增的片段远远大于原设计,甚至无法 得到这样大的片段。

由于 Taq 或 Vent DNA聚合酶不能以RNA为模板合成 cDNA,所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR。首先必需提取病

PCR同样具有 10倍标准PCR

毒RNA,加入反转录酶合成cDNA, 然后才能进行PCR扩增。因此必需进行两步反应(反转录酶不耐热)。这就是所谓的反转录-PC R(RT PCR)。病毒RNA可以从各种适合的组织 器官、排泄物、分泌物或细胞培养物中提取,这取决于被检病毒的种类。RT片段。 第一步： 反转录合成第一链cDNA:缓冲液 5μl

2

5mmol/L dNTP 5μl

离子水 至终体积50μl观察、拍照和记录。

①取一反应管，分别加入：病毒RNA（或感染细胞总RNA） 适量

5μg

反向引物 0

5μg

很高的敏感性。作者从100μl猪瘟兔化弱毒的犊牛睾丸细胞培养物中提取了病毒RNA,用 下述RT PCR方法,从中扩增出了特异cDNA

正向引物 0

RNasin 40单位 反转录酶(AMV) 10单位 去

②42℃水浴1小时。 第二步： PCR扩增:③将上述反应物煮沸变性5分钟，立即冰浴；④加Taq DNA

聚合酶2单位；⑤置PCR仪,用选定的变性、退火和延伸温度及时间，进行30～40次循环反应；⑥取5～10μl反应产物,进行电泳、

反转录反应中，用PCR缓冲液代替反转录缓冲液，同时加入正、反向引物,既简化操作步骤 ，又不影响反应效

1990

率。应用该方法，我们还成功地从感染细胞总RNA中扩增出了牛病毒 性腹泻病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒的特异cDNA片段。的工作时间及温度,则可直接得到PCR扩增的cDNA片段。目前已有市售的RT PCR试 剂盒供使用。研究

年人们发现了一种极其耐热的反转 录酶,可以将两步反应合并在一起,前半部为反转录酶合成cDNA,后半部为PCR,只需适当调整P CR

(五) PCR用于分子流行病学

病毒在自然 界中产生自发突变株是长期困扰病毒学工作者的棘手问题。例如流感病毒、牛病毒性腹泻病 毒、脊髓灰质炎病毒、

口蹄疫病毒等都会因地理或生态环境，动物体的内环境(如易感性、 免疫压力等)，气侯和时间因素等的变化而自发产生基因突变的变异株,使人或动物的免疫系 统无法正确识别,导致原有的疫苗接种失败,造成病毒大量传播。就其本质来说,病毒发生 突变是指病毒基因的缺失、插入、交换和基因点突变等。PCR技术的出现,使人们 有可能大规模、且十分精细地研究病毒突变的规律及突变位点,迅速地鉴定突变株,从分子水 平上阐述病毒病的流行规律,这是目前分子流行病学的主要研究内容之一。在可能发生缺 失 的病毒基因两侧合成DNA引物,进行PCR或RT PCR,通过电泳即可清楚地看到被扩增的片段小于对照株;如果外源基因插入某个位点,用这个位点两侧的DNA引物进行PCR扩增,就可以发现扩增的片段大于对照株。

美国科学家用多种因素(化学、物理)处理脊髓灰质炎病毒 ,然后制备

cDNA。对混合的cDNA进行PCR,发现了多种不同的突变株。他们还使用PCR研究不同 口蹄疫毒株之间的重组。他们首先在两个毒株的核酸序列上寻找两个非同源序列,合成DNA引 物。引物Ⅰ只能与A株杂交,引物Ⅱ只能与B株杂交。因此,用这两个引物不能对A株或B株的cD NA进行扩增。将A、B两株在不同条件下混合感染单层培养细胞,提取病毒RNA制备cDNA,最后用引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR。如果电泳中发现特异的DNA带,同时此DNA带能与

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P标记的两 个DNA引物杂交,则说明A、B两株的基因组RNA在两个

DNA 引物中间的序列发生了基因重组。 用此方法可以迅速准确地测定试验室内病毒发生基因重组的条件。令人惊奇的是经PCR扩增 后,电泳中往往出现多条分子量不同的带,核酸序列分析说明A、B两株间有多个不同的重组位点。有人采用RT PCR技术,对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的基因突变进行了研究, 发现许多致细胞病变BVDV毒株的P80基因区有外源核酸序列的插入(大小约数百个碱基 ),而非

致细胞病变毒株则没有这种插入。当然,PCR结果还难以说明病毒遗传变异株的稳 定性、毒性、滴度、致病性等多项病毒学指标,然

而这些研究结果说明了病毒间基因重组的复杂性和重组的条件,使人们有可能着手研究病毒重组突变机理。