重组生物酶制剂成果转化项目
结题验收报告
一、项目研究开发的内容、技术路线、考核目标及主要技术经济指标 1、项目研究开发的内容
重组生物酶制剂（D-氨基酸氧化酶） 2、技术路线
（a）菌种活化。将在低温保藏的菌种接种于活化斜面，在一定的温度下，培养一段时间，活化菌种。
（b）摇瓶培养。将活化好的菌种接种于摇瓶内，在一定条件下培养16h—20h,OD达到一定水平。
（c）种子培养。将摇瓶种子接种入一级种子罐，培养到一定OD值，后接入二级种子罐继续培养，达到一定水平后，接入发酵罐，进行发酵培养，积累目的产物。
（d）在一定温度，ph，通气条件下，进行发酵培养，当目的产物积累到一定程度，可以结束发酵，再经过一定的预处理。
（e）菌液分离。利用离心机，板框过滤，膜分离等技术将菌体和发酵清液分开。
（f）目的产物在菌体细胞内部。提取目的产物的流程，首先将细胞破碎，经过离心处理去掉破碎的细胞碎片，留上清液，经过提取纯化等工艺，再通过固定化等方法提取目的产物。 3、考核目标及主要技术经济指标
A、主要考核指标
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项目产品各项技术指标还未有国家的统一标准，只是在行业内对产品的各项性能指标进行规定，是满足客户使用需求的最低标准。该项目生产的产品各项指标均满足行业内规定，具体如下：
（1）发酵水平不低于10000单位/升 （2）总收率65+5%
（3）发酵时间：35--45小时 （4）生产菌：大肠杆菌基因工程菌
（5）产品外观呈现白色、黄色或棕色球状颗粒 （6）产品粒径(≥100μm)的达到95%以上 （7）产品含水率小于65%
（8）产品活力(25℃、湿品)大于等于50 u/g （9）产品保质期从生产之日起为六个月 B、主要技术经济指标 （1）经济效益
项目完成后可以达到年产3吨重组生物酶制剂D-氨基酸氧化酶的生产能力，按每千克3165元人民币计算，可以实现年销售收入950万元，净利润达到190万元，纳税达到101万元。
（2）项目产品达到国际先进水平，国内先进水平，完全替代国内进口同类产品，产品的价格和质量完全优于国外进口同类产品。
（3）可以提升我国重组生物酶制剂行业在国际市场上的竞争力。 （4）提升公司在生物技术行业的影响力，促进鹤壁市生物技术产业的发展。
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（5）解决劳动力就业问题
二、项目执行情况；实施解决的关键技术和主要创新点；项目完成后基础设施建设情况 1、项目执行情况
河南兴鹤电子有限公司与北京中科院微生物研究所联合申请的“重组生物酶制剂开发”项目获得省科学院审批通过后，公司为了项目的顺利实施，首先通过招聘的方式从大学院校接受本科生6名，充实加强研发团队，同时先后派遣两批次4名技术骨干赴北京进行为期6个月的专项技术培训。其次，公司通过优化组合为实验室和生产车间建成了700平米的防静电密闭式厂房，并且聘请专业团队设计和建设符合国家标准的实验室以及相关的小试、中试发酵设备。再次，对生产工艺从实验室到工业生产的过程转换进行了试运行（包括试验基地、中试线、生产线、示范点等）。第四，发酵小试、中试设备，多功能提取罐、恒温干燥箱、冷冰干燥机、高效液相色谱仪、细胞粉碎机、在线控制系统等研发试验生产设备已就绪。 2、实施解决的关键技术和主要创新点
（1）实施解决的关键技术
■通过现代蛋白质工程的方法提高D-氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达水平；
■建立一条高密度发酵生产技术线，使其发酵产酶量达到1-3克/升，达到10000 单位/升；
■构建一种新的蛋白质表达系统，D-氨基酸氧化酶可以在原核菌
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株大肠杆菌中进行高水平的表达，可溶性蛋白占细胞总蛋白的40%以上。
■采用板式换热器连消灭菌的方法，以达到灭菌温度稳定，时间短，效果好，营养成分破坏小，既节省了原材料，还提高了菌体生长效率，符合最佳高密度细胞培养的要求。
■攻克膜分离技术，达到提高最终产品的质量和收率。 （2）主要创新点
（1）提取纯化，最终产品质量优于国内同行业产品，不低于世界同行业水平；
（2）在发酵罐系统中稳定生产，产量和质量水平稳定较高，工艺成熟，能尽快应用到规模化工业生产中；
（3）突破重组生物酶制剂D-氨基酸氧化酶成果转化，实现小批量生产规模。
三、产学研联合开展研究开发及成果推广应用情况。
河南兴鹤电子有限公司于2013年6月与中国科学院微生物研究所签订“重组生物酶制剂开发”技术开发合同。自签订合同之日起公司与微生物所组成研发团队，针对重组生物酶制剂—D氨基酸氧化酶进行技术攻关，并于2014年6月完成了对D-氨基酸氧化酶的研究，筛选获得具有高D-氨基酸氧化酶活力的微生物，通过基因克隆技术从中获得D-氨基酸氧化酶基因，构建基于大肠杆菌的高效异源表达系统，并且建立了D-氨基酸氧化酶活性测定方法。
D-氨基酸氧化酶用途有：
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■用于头孢类药物关键中间体7-ACA的酶法生产。7-ACA传统上以化学法生产为主。2011年6月初，国家发改委发布的 《产业结构调整指导目录（2011年本）》开始施行，其中将“化学法生产7-氨基头孢烷酸（7-ACA）”列为“限制类项目”。目前国内7-ACA的生产已经全面进入酶法生产时代。
■用于生产L-型氨基酸。L-型手性氨基酸在医药、食品、精细化学品方面具有广泛的用途。化学合成的氨基酸都是外消旋体，需进一步拆分将其中的D-型和L-型对映体分开，才能进一步使用。D-氨基酸氧化酶可用用于拆分DL-氨基酸制备L-型氨基酸。酶法拆分具有高效、环保、经济等特点。在新的产业政策的指导下，有望得到进一步的发展。
■用于制备α-酮酸。α-酮酸是重要的前手性化合物，也是重要的医药中间体。
■用于检验食品中是否有微生物污染。
四、项目实施的技术路线、课题设置、关键技术选择等的科学性和先进性
1、项目的技术路线如下：
（a）菌种活化。将在低温保藏的菌种接种于活化斜面，在一定的温度下，培养一段时间，活化菌种。
（b）摇瓶培养。将活化好的菌种接种于摇瓶内，在一定条件下培养16h—20h,OD达到一定水平。
（c）种子培养。将摇瓶种子接种入一级种子罐，培养到一定OD
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值，后接入二级种子罐继续培养，达到一定水平后，接入发酵罐，进行发酵培养，积累目的产物。
（d）在一定温度，ph，通气条件下，进行发酵培养，当目的产物积累到一定程度，可以结束发酵，再经过一定的预处理。
（e）菌液分离。利用离心机，板框过滤，膜分离等技术将菌体和发酵清液分开。
（f）目的产物在菌体细胞内部。提取目的产物的流程，首先将细胞破碎，经过离心处理去掉破碎的细胞碎片，留上清液，经过提取纯化等工艺，再通过固定化等方法提取目的产物。
具体如下图示：
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空气 空压机 菌种 斜面活化 除水除油 原材料 菌体处理 精过滤 预过滤 二级种子 一级种子 预处理 蒸汽 灭菌 发酵 发酵液预处理菌液分离 产品 纯化 菌体破碎 离心收集清液 酶固定化 冷冻干燥
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2、课题设置
（1）在实施项目中，我们筛选了获得具有高D-氨基酸氧化酶活力的微生物，然后通过基因克隆技术从中获得D-氨基酸氧化酶基因，构建基于大肠杆菌的高效异源表达系统。再通过现代蛋白质工程的方法提高D-氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达水平。经过我们不断的实验，提高了D-氨基酸氧化酶的单位活性，由原来的6000—8000单位/L,提高 到现在的10000-12000单位/L；
（2）在发酵培养中，需要精化培养的配方，进一步优化培养的工艺。通过新的高密度培养的方式，在保证单位酶活力不降低甚至有所提高的前提下，提高最终培养细胞密度，增加产量，提高经济效益；
（3）在发酵灭菌方式上，需要做出改进。原来用实消灭菌的方式，灭菌温度不稳定，时间长，这种方式虽然方便，但是它对培养基营养成分破坏大，导致菌体生长所需的营养不够，达不到最佳的高密度生产的要求；而且实消灭菌，破坏营养成分可以导致，原材料的浪费。项目中采用板框连消灭菌，灭菌温度稳定，时间短，效果好，营养成分破坏小，既节省了原材料，还提高了菌体生长效率，符合最佳高密度细胞培养的要求；
（4）在后处理方面，我们对菌液分离技术做出改进。开始的菌液分离，主要采用板框过滤技术，这种技术易操作，但是劳动强度大，而且板框过滤分离菌体时，原液过滤难度非常大，因为本项目是要求细胞活性，又不能对发酵原液进行相应的处理，导致板框过滤技术不适合用于本项目的生产。我们先采用离心的方式进行菌液分离，效果
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不错，操作也简单，但是由于是高速离心，过程比较剧烈，会产生温度的变化从而影响细胞活性，最终影响产品的质量和收率。最后我们选择膜分离技术，这种技术是一种最新型的分离技术，技术要求高，设备精密，对人员素质的要求较高，但是膜分离技术操作较简单，分离效果极佳，而且操作过程反应温和，几乎不会对细胞活性造成影响，提高了最终产品的质量和收率，增加经济效益。 3、关键技术选择的科学性和先进性
（1）提取纯化，最终产品质量优于国内同行业产品，不低于世界同行业水平；
（2）在发酵罐系统中稳定生产，产量和质量水平稳定较高，工艺成熟，能尽快应用到规模化工业生产中；
（3）突破重组生物酶制剂D-氨基酸氧化酶成果转化，实现小批量生产规模。
五、项目实施后对产业结构调整、优化和对行业科技进步的推动作用及影响
①替代国外进口
D-氨基酸氧化酶的一个非常重要的用途就是用于生产7-ACA，然而我国7-ACA的主要生产厂家有8家，分别是中润药业、健康元、福州抗生素集团、山西威齐达、哈药集团、石药集团、鲁抗集团、联邦制药。除健康元、石药集团和联邦制药生产7-ACA所用的酶为自产外，其它企业所需的D-氨基酸氧化酶都需要向酶制剂企业购买。该项目完成后生成的产品完全可以替代进口，产品的价格和质量完全优于国
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外进口同类产品，项目产品达到国际先进水平。
②提升我国重组生物酶制剂国际竞争力
项目产品D-氨基酸氧化酶是服务于7-ACA（7-氨基头孢烷酸简称）生产的医药中间体，7-ACA是合成头孢类抗生素的重要母核之一，占头孢类抗生素中间体整体占比75%以上。采用两步酶法合成法在当前应用已经取代了化学法生产7--氨基头孢烷酸(7-ACA)。近两年因为两步酶法的生产技术，即通过D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶两步酶法制备7-ACA的技术，存在酶解线路长，氧化条件控制难度大，设备条件要求高的缺点。但是一步酶法只需一次就能将头孢菌素C（CPC）转化为7--氨基头孢烷酸(7-ACA)，大大提高了转化效率和产品的质量，同时相比两步酶法还减少了工艺流程，降低了成本。由此可见，该项目的实施可以提升我国重组生物酶制剂行业在国际市场上的竞争力。
③迎合国家“十二五”发展需求
项目D-氨基酸氧化酶产品是服务于7-ACA生产的中间体，《医药工业“十二五”发展规划》、《生物医药产业发展“十二五”规划》等政策措施均鼓励本类产品或技术快速发展，以加快医药工业结构调整和转型升级，培育发展生物医药产业，促进医药工业由大变强。
④提升企业核心竞争力
通过该项目的实施，提升公司在生物技术行业的影响力，增强公司在生物技术方面的市场竞争力，同时促进鹤壁市生物技术产业的发展。
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六、项目的组织方式、协调管理、经费使用和经费决算情况 1、项目的组织方式和协调管理
本项目采用项目组合作分工的方式，即河南兴鹤电子有限公司主要分工是保证项目实施的资金、设备、车间等配套设备的顺利实施，配合中国科学院微生物研究所共同攻克关键技术；
中国科学院微生物研究所主要分工是攻克项目关键技术，保证项目实施过程中技术方面的顺利实施。
项目负责人秦秀宾董事长主要负责项目的总协调，保证项目按计划实施；
项目技术负责人吴胜，主要负责项目技术进度按计划实施、培训兴鹤电子公司相关试验和技术人员、委派相关高技术人员到公司进行技术指导；
项目实施总经理王鹏飞，主要负责车间装修改造、设备购买和调试、聘请专业技术人才和招聘试验、生产员工等。
项目实施过程中遵循标准规范,项目资料编写规范和齐全。项目合作双方相互协调，按计划进度实施。在项目前期，微生物研究所积极进行技术攻关，兴鹤公司委派的技术人员应该配合其工作；项目实施后期微生物研究所负责培训兴鹤公司员工，并委派高技术人才积极配合项目产品的试生产。项目双方相互配合，主要以电话和邮件进行沟通，并在通知后三个工作日内给予对方答复。 2、项目经费决算表（单位：万元）
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经费来源 经费支出 预算数 （申报书） 300 178 实际 支出 285.55 89.9 37.3 57.34 24.12 18.93 17 1.07 9 其中省财政经费 60 —— 14.08 24.12 3.73 17 1.07 —— 项 目 项 目 一、费用小计 一、单位自筹 资金小计 240 1．研发设备费 1．单位自有 资金 240 购置设备费 试制设备费 设备改造与租赁费 2．材料费 3．测试化验 2．银行贷款 加工费 4．燃料动力费 5．差旅费 3．风险投资 6．会议费 7．国际合作与 4．其他资金 交流费 8．出版/文献/信息传二、中央财政专项拨款支持 播/知识产权事务费 9．劳务费 60 10．技术支持 合作费 11．管理费 二、其他支出 300 合 计 21 43 36 2 2 1 2 —— 三、省财政拨款 15 300 四、市县财政或部门支持 30.89 285.55 60 合 计
七、项目成果转化、产业化情况以及所取得的直接效益和间接效
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益（经济、社会和环境效益）。
1、公司通过优化组合为实验室和生产车间提供了
700平米的实
验生产产地，并聘请专业团队帮助设计和建设符合国际标准的实验室以及相关的中小试设备。对生产工艺从实验室到工业生产的过程转换进行试运行实验（如蒸汽供应和用量、工程菌的活化到高密度发酵控制实验等）。同时委托北京泛球生物科技公司对酶活力和成品半衰期进行了四次监测，均达到设计指标。
2、项目完成后可以达到年产3吨重组生物酶制剂D-氨基酸氧化酶的生产能力，按每千克3165元人民币计算，可以实现年销售收入950万元，净利润达到190万元，纳税达到101万元。
3、替代国外进口，提升我国重组生物酶制剂国际竞争力。现阶段国内企业所需70%的D-氨基酸氧化酶都需要进口。该项目完成后生成的产品完全可以替代进口，产品的价格和质量完全优于国外进口同类产品。
4、迎合国家“十二五”发展需求，《医药工业“十二五”发展规划》、《生物医药产业发展“十二五”规划》等政策措施均鼓励本类产品或技术快速发展，以加快医药工业结构调整和转型升级，培育发展生物医药产业，促进医药工业由大变强。同时响应河南省“十二五”战略性新兴产业发展规划“生物产业”--“生物制造”中“大力推进酶工程、发酵工程技术”的发展战略。
5、带动地方经济发展，推动地方产业转型升级，对鹤壁市高新技术新兴产业培育有重大带动作用；提升企业核心竞争力，增强企业
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在生物技术方面的影响力。
6、同时在一定程度上解决当地部分就业压力。 八、存在问题及改进计划
在项目的实施过程中，由于原公司董事长突然病故，导致我集团公司本项目推迟建设。虽然新任董事长秦秀宾同志接手后开始重启该项目，但仍然导致某些关键人才流失，某些接口对接因中期时间的停滞和资金的延迟到位而造成项目产品未能批量投产。
针对这种情况，我公司将加大力度，继续与中科院加强合作，争取使该项目批量生产。
九、项目实施过程由于受市场变化及技术发展等原因影响造成拖延等情况的必要说明。
在项目的实施过程中，由于原公司董事长突然病故，导致我集团公司本项目推迟建设。虽然新任董事长秦秀宾同志接手后开始重启该项目，但仍然导致某些关键人才流失，某些接口对接因中期时间的停滞和资金的延迟到位而造成项目产品未能批量投产。
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