基于电化学还原氧化石墨烯的电化学DNA生物传感器

DOI：10．13873/J．1000—9787（2019）06—0075—04

基于电化学还原氧化石墨烯的电化学DNA生物传感器

1，333323

朱济锋，黎学思，周大明，于乐泳，王国东，ChakerTlili

（1．河南理工大学电气工程与自动化学院，河南焦作454150；2．河南理工大学物理与电子信息学院，河南焦作454150；

3．中国科学院重庆绿色智能技术研究院精准医疗单分子诊断中心，重庆400700）

摘

要：使用还原氧化石墨烯（rGO）制备一种简单、快速和可重复方法构建DNA生物传感器。将带负电

的氧化石墨烯（GO）与半胱氨酸上带正电的氨基基团通过静电作用相互吸附，用线性扫描伏安法（LSV）电DNA）探针固定到rGO表面，化学还原电极表面吸附的GO。将二茂铁标记的DNA（Fc-成功构建DNA传感器。传感器的制备过程使用循环伏安法和拉曼光谱表征。通过杂化前后DNA传感器所展现出方波信

－13

～1．0×号峰电流的差异，实现对目标DNA的定量检测。实验结果表明：目标DNA浓度在1．0×10

10－6mol/L范围内，峰电流变化与目标DNA浓度呈线性关系，线性相关系数为0．981，检测限是2．0×

10－13mol/L（S/N=3）。

关键词：还原氧化石墨烯；氨基基团；π-π键；DNA生物传感器中图分类号：TP391；TP212

文献标识码：A

文章编号：1000—9787（2019）06—0075—04

ElectrochemicalDNAbiosensorsbasedon

electrochemicalreducedgrapheneoxide

3

ZHUJifeng1，，LIXuesi3，ZHOUDaming3，YULeyong3，WANGGuodong2，ChakerTlili3

（1．SchoolofElectricalEngineeringandAutomation，HenanPolytechnicUniversity，Jiaozuo454150；2．SchoolofPhysicsandElectronicInformationEngineering，HenanPolytechnicUniversity，Jiaozuo454150；

3．ＲesearchCenterforPrecisionMedicineandSingleMoleculeDiagnostics，ChongqingInstitute

ofGreenandIntelligentTechnology，ChineseAcademyofSciences，Chongqing400700）

Abstract：Asimple，facileandreproducibleapproachisusedforfabricationofDNAbiosensorsbasedonreducedmodifiedgoldgrapheneoxide（rGO）．Thegrapheneoxide（GO）nanosheetsareassembledontocysteamine-electrodesviaelectrostaticinteractionbetweenthepositivelychargedaminogroupofcysteamineandthenegativelychargedgroupspresentinGO，followedbyelectro-reductionthroughlinearsweepvoltammetry（LSV）andfunctionalizationwithferrocene-labeledDNAprobe．ThestepwiseassemblyoftheDNA（Fc-DNA）biosensorischaracterizedwithcyclicvoltammetryandＲamanspectroscopy．ThetargetDNAcanbequantitativelydetectedbasedonthevariationofsquarewavevoltammetry（SWV）signalofthebiosensorbeforeandafterhybridizationwithtargetDNA．ThepeakcurrentvariationhasalinearrelationshipwiththetargetDNAconcentrationintherangeof1．0×10－13～1．0×10－6M，withlinearlydependentcoefficientof0．981andthedetectionlimit（LOD）is2．0×10－13mol/L（S/N=3）．

Keywords：reducedgrapheneoxide；aminogroup；π-πstacking；DNAbiosensors

0

引

言

展

［4］

。然而，这些方法检测过程耗时、标记步骤复杂、昂贵

随着基因时代的来临，进行基因诊断已经逐渐成为分发展快速、敏感、经济、有子生物学和生物技术的重要领域，

DNA）效的临床检测脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，传感装置需求越来越高物传感器

［3］

［1］

电的成本使其无法在临床检测当中展开应用。相比之下，如灵敏化学生物传感器是公认的有前景的快速检测装置，选择性、检测极限的提高，低成本和装置的小型化。然度、

传统的电极表面探针的可固定量有限，所以，电化学而，

DNA生物传感器的灵敏度通常受到限制。

由于石墨烯突出的电特性，与传统的电极相比拥有显

。在过去的几十年里，各种技

［2］

术，如表面等离子体共振DNA生物传感器，压电DNA生

，和比色测定都在向检测特异性DNA方面发

收稿日期：2018—03—26

76传感器与微系统第38卷

著提高的电导率、

稳定的电压范围和生物相容性，石墨烯成为最有潜力的发展下一代电化学生物传感器的材料

［5］

。

目前，从过去的研究中可以知道：氧化石墨烯（grapheneoxide，

GO）和还原氧化石墨烯（reducedgrapheneoxide，rGO）可以通过芳香键、氢键、疏水作用、范德瓦尔力、π-π键吸附单链DNA，但是杂化过后的双链DNA与石墨烯之间的作用力却很小

［6］

。因此近年来，利用石墨烯修饰的电极来检

测DNA引起了广泛的注意力。

本文使用还原氧化石墨烯制备一种简单、快速和可重复方法构建DNA生物传感器，实验结果表明传感器性能优越。1

基本原理

使用线性扫描伏安法在修饰有半胱氨酸的金电极表面修饰一层稳定的rGO薄膜，

设计了一种快速、高效和环保的技术。为了检测所制备的生物传感器的性能，使用方波伏安法（squarewavevoltammetry，

SWV）来检测固定到rGO表面二茂铁标记的DNA（ferrocene-labeledDNA，Fc-DNA）探针信号。当固定有Fc-DNA探针的电化学生物传感器与DNA互补链在反应溶液中杂化过后，石墨烯表面的探针与互补链杂化形成双链螺旋结构减弱了DNA与石墨烯之间的吸附作用，从石墨烯表面脱落。因此，方波信号检测到的峰电流将变小

［7］

。图1表明了传感器的制备过程：（A）半

胱氨酸在金电极上自组装反应；（B）氧化石墨被吸附在氨基基团上；（C）电化学还原氧化石墨烯；（D）固定探Fc-DNA针；（E）捕获目标DNA；（F）杂化后的DNA双链从石墨烯表面释放。

图1

生物传感器原理

2实验部分

2．1仪器与试剂

电化学实验均采用三电极系统：工作电极为金电

极（直径为2．0mm），

铂丝为辅助电极，饱和Ag/AgCl作为参比电极。循环伏安（cyclicvoltammetry，

CV）法、线性扫描伏安（linearsweepvoltammetry，

LSV）法和SWV均使用CHI760E电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司）；拉曼光谱仪（inviaＲeflex，

英国）；实验中所设计的不同序列DNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：探针：Fc-DNA（5'-Fc-CAC-AAA-TTC-GGT-TCT-ACA-GGG-TA-3'）；完全互补链：DNA（5'-TA-CCC-TGT-AGA-ACC-GAA-TTT-GTG-3'）；完全不补链：DNA（5'-AT-AAT-CTC-GTG-TAT-ACC-AAA-TGT-3'）。

氧化石墨烯（2mg/mL，购自XFNANO材料科技有限公

司，

南京）；半胱氨酸（Cysteine，购自Sigma-Aldrich，上海）；过氧化氢（H2O2）、浓硫酸（H2SO4）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、

二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、

氯化钠（NaCl）、铁氰化钾（K3Fe（CN）6）和亚铁氰化钾（K4Fe（CN）6）（均购自科试，成都）；无水乙醇（damas-beta，上海）；各种缓冲液如下：DNA探针固定溶液为Tris缓冲液（10mMTris-HCl，pH7．4；150mmol/LNaCl）；DNA杂化溶液为Tris缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7．4；150mmol/LNaCl；）；SWV的测试溶液为磷酸缓冲溶液（10mmol/LPBS，

pH7．4）；循环伏安法的检测溶液为探针溶液（5mmol/L［

Fe（CN）3－/4－

6］，10mmol/LPB，

pH7．4；150mmol/LNaCl）；超纯水是由Molecular水净化系统制备用于所有缓冲液制备。

2．2金电极预处理

首先将金电极用砂纸打磨，然后分别使用1，

0．3，0．5μm的氧化铝粉末对金电极进行抛光，直到电极表面光滑如镜，

并分别使用超纯水和乙醇超声清洗残留的氧化铝。然后在食人鱼溶液（V（H2SO4）︰V（H2O2）=7︰3。注意：强危险性化学品）中超声清洗5min后再用超纯水超声清洗。将清洗后的电极放入0．1mol/L硫酸溶液中使用电化学工作站在－0．2～2V的电压范围内以100mV/s的速率连续扫描直到曲线稳定。最后，使用超纯水超声清洗干净，并用高纯氮气吹干备用。

2．3传感器的制备

将预处理过的金电极浸没在准备好的1mmol/L的半

胱氨酸（Cys）溶液中放置12h形成自组装单层膜。然后使用乙醇和超纯水分别超声清洗3次，

每次5min去除没有稳固结合的半胱氨酸分子，

即得到Cys/Au［8］

。之后将Cys/Au浸没在0．1mg/mL的氧化石墨烯分散液中静置6h。将

电极取出来使用清水冲洗过后形成GO/Cys/Au电极，在0．1mol/L的氯化钠溶液中用LSV在0～－1．2V的范围内用100mV/s的扫描速率来电化学还原氧化石墨烯。形成rGO/Cys/Au，将（10μmol/L）10μL的Fc-DNA探针溶液滴到rGO/Cys/Au上4h，使用10mmol/LPBS冲洗3次电极，得到Fc-

DNA探针修饰的电极Fc-DNA/rGO/Cys/Au。2．4传感器的电化学测试和杂化反应

电化学DNA生物传感器的制备过程使用CV来表征，

扫描速率为100mV/s，扫描范围是－0．2～0．6V，在

5mmol/L的氧化还原探针［Fe（CN）3－/4－

6］溶液中来检测。

将Fc-DNA/rGO/Cys/Au浸到200μL的一定浓度的目标DNA分析液中，在室温条件下反应40min，用10mmol/LPBS冲洗除去非特异性吸附的DNA。峰电流信号由SWV在10mmol/LPBS（pH7．4）中进行，扫描范围－0．2～0．6V，脉冲幅度为50mV，扫描频率为25Hz。

第6期朱济锋，等：基于电化学还原氧化石墨烯的电化学DNA生物传感器

77

3

结果与讨论电化学

［9］

还原氧化石墨烯一般分为两种

［10，11］

方法，两

种方法都是主要用于在导电基底上制备石墨烯薄膜。然而这些用于制备石墨烯的方法有一定的局限性。石墨烯的薄膜厚度和均匀性难以控制以及表面的石墨烯容易脱落，会影响电极本身的稳定性和重复性。本文中通过氨基嫁接的方法连接石墨烯

［12］

。

3．1电化学还原氧化石墨烯

如图2所示，表示电化学制备rGO/Cys/Au电极只需

要2个步骤。首先通过化学吸收的方法在金电极表面自组装形成半胱氨酸单层膜。然后，

浸没在酸性的氧化石墨烯分散溶液中放置12h，

带负电的氧化石墨烯和半胱氨酸上带正电的氨基相互吸附形成GO/Cys/Au电极。使用线性扫描伏安法在0～－1．2V之间电化学还原氧化石墨烯中的含氧官能团羧基和羟基。和预料的一样，

在0～－1．2V之间以100mV/s的速率第一次扫描后在－1．05V处出现了还原峰，

这归于氧化石墨烯表面的含氧官能团电活性减少。在第二次线性扫描时还原峰完全消失，表示GO已经完全被还原成为rGO。

图2

还原氧化石墨烯过程的线性扫描伏安

3．2循环伏安法表征修饰电极表面

在电化学检测中，可逆的氧化还原探针［

Fe（CN）3－/4－

6］对电极表面化学反应是十分敏感的，电极表面修饰过程的CV表征曲线在含有5mmol/L的氧化还原探针［Fe（CN）6］

3－/4－

的溶液中来检测。如图3所示，

rGO修饰过后的电极在探针溶液为5mmol/L［Fe（CN）3－/4－

6］

，10mmol/LPB，pH7．4；150mmol/LNaCl。氧化还原探针

［Fe（CN）3－/4－

6］在裸金电极表面展现了可逆的行为，其峰

电压距是90mV。金电极表面自组装过半胱氨酸膜后，电流峰值略有增长，

峰电压距减小到80mV。这个结果是由于半胱氨酸氨基上的正电荷与［Fe（CN）3－/4－

6］

还原探针的负电荷之间的静电作用所导致的［8，13］

。在电化学还原

GO后电流峰值显著增加，峰电压间距增加。这是因为rGO的表面积大和优良的导电性增加了电化学活性位点。

3．3拉曼表征

［14］

GO和电化学rGO通过532nm的激光来检测。如图4所示：可以观察到两个分别为D带和G带拉曼峰值在1345cm－1和1600cm－1。一般来说，D带与石墨烯的结构

图3金电极修饰的不同阶段循环伏安表征

缺陷有关，而G带与sp2碳原子2维六角形晶格有关。D带与G带的相对强度比（r=ID/IG）通常用来表征石墨烯的缺陷程度。氧化石墨烯的D带与G带的相对强度比ID/IG=0．99，电化学还原的氧化石墨烯的D带与G带的相对强度比ID/IG=1．58。由此可以推断：在电化学rGO相对GO形成更多的sp2和结构缺陷［14］。此外，电化学还原氧化石墨烯以后G带从1604cm

－1

偏移到1598cm

－1

，这个在

化学和热还原氧化石墨烯中也被报道过。这些结论有效证实了氧化石墨烯的电化学还原过程。

图4氧化石墨和电化学还原过的还原氧化石墨烯的拉曼光谱

3．4DNA传感器的特异性

SWV作为一种非常灵敏的电化学技术用来分析电化

学DNA生物传感器的敏感性，

在最佳条件下，使用制备的生物传感器Fc-DNA/rGO/Cys/Au与不同浓度的目标DNA反应，目标DNA浓度范围为1．0×10

－13

～1．0×10－6mol/L。

可以观察到：随着目标DNA浓度的增加，

SWV的信号峰电流逐渐在减小。这可以解释为：Fc-DNA探针与目标DNA杂化形成双链以后从还原氧化石墨烯表面解离，使电极表面的Fc-DNA探针减少，与之前报告的荧光和电化学阻抗谱方法一样

［15］

。为了比较DNA生物传感器和最小值的关系，将

Fc-DNA探针产生的峰电流信号标准化，标准式ΔI（%）=［（IFc-DNA－IcDNA）/IFc-DNA］×100，IFc-DNA和IcDNA分别是固定过Fc-DNA探针后的峰电流信号和探针与不同浓度目标DNA浓度杂化反应过后的峰电流，其峰电流值与目标DNA浓度的对数呈线性关系，所得线性回归方程为线性回归方程为：ΔI（%）=5．238log（CcDNA）－9．424，

CcDNA为目标DNA的浓度，线性相关系数为Ｒ2

=0．981。DNA生物传感

器检测极限（limitationofdetection，

LoD）大约为2．0×10－13mol/L，比之前报道的DNA功能化的聚吡咯膜的检测

极限高了3个量级［16］

。相对标准偏差（relativestandard

deviation，ＲSD）为1．35%，表示DNA传感器的良好再生性。LoD是用一个等式估算，

LoD=3SD/m，m为线性部分78

传感器与微系统

第38卷

的斜率，

SD为空白的标准偏差量［17］

。

3．5DNA传感器的选择性

利用制备的DNA生物传感器Fc-

DNA/rGO/Cys/Au分别在最佳条件下与以下3种不同的溶液反应，

不含DNA的阴极对照溶液（NC）、完全不互补的DNA序列（nc-DNA）、完全互补的DNA序列（c-DNA）。在阴极对照溶液中未与目标DNA反应时，峰电流信号几乎不变，标准差约为2．5%±0．3%。表现出了良好的稳定性是因为Fc-DNA探针与氧化还原石墨烯之间很强的吸附力。为了验证提出的选择性，

将Fc-DNA/rGO/Cys/Au与100nmol/L的nc-DNA在最佳条件下反应，峰电流信号降低了12%±0．4%。然后将Fc-DNA/rGO/Cys/Au与100nmol/L的c-DNA在相同条件下反应，

像预期的一样，峰电流信号相对nc-DNA的信号降低了3倍。表明了DNA生物传感器良好的选择性。4

结

论

这种利用半胱氨酸在金电极上构建rGO的电化学方法，

可以制备快速、简单、稳定的基于rGO的电化学生物传感器来检测特异性DNA。通过对特异性DNA的检测进一步验证了rGO在生物传感器发展上的应用。此外，设计的Fc-DNA探针通过π-π键吸附到还原氧化石墨烯表面，然后和完全互补链杂化后从石墨烯表面解离，使探针的固定和杂化过程得简单、

快速和方便。因此，这种构建rGO的电化学方法是非常有前景的，在将来有望应用到临床快速检测装置上。参考文献：

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作者简介：

朱济锋（1990－），男，硕士研究生，研究方向为电化学生物传感器的研究，

E—mail：476321658@qq．com。王国东（1979－），男，通讯作者，博士，副教授，研究领域为微电子学与固体电子学，

E—mail：wgd@hpu．edu．cn。ChakerTlili（1976－），男，通讯作者，博士，副教授，研究领域为新型电化学纳米装置，

E—mail：chakertlili@cigit．ac．cn。