嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖提取及其活性的初步研究

２００３年１０月中国比较医学杂志Ｏｃｔｅｍｂｅｒ，２００３第１３卷第５期ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＨＮＡＬＯＦＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥＭＥＤＩＣＩＮＥＶｄ１３Ｎｏ．５ｐ慵艚∞一‰§研究报告≮％㈣“ｒ嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖提取及其活性的初步研究张丽芳，刘星，李红（中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京１０００２１）【摘要】目的提取嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白（ＯＭＰ）和脂多糖（ＩＰＳ），测定其稳定性和抗原性，探讨其作为诊断抗原的可能性。方法选取具有代表性的嗜肺巴氏杆菌１５株及参考栋共１６株，提取ＯＭＰ、ＬＰＳ，通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ等方法狂稳定性、抗原性等方面与全菌抗原（ｗｃ）进行比较。结果１６株嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图谱基本一致，不同培养基成分、培养时间和不同体外传代次数的提取物均显示５条带，相对分子质量大约是（１７、２６、３１、３７、４１）×１０３。其中５株嗜肺巴氏杆菌的ＬＰＳ为光滑型和粗糙型ＬＰＳ的混合物，主带相对分子质量在１４４×１０３左右。外膜蛋白和脂寡糖提取物保持了其抗原反碰性和免疫原性。ＯＭＰ和ＩＳＳ具有种和型的特异性。ＯＭＰ的５条条带抗原性存在差异，相对分子质量（２６、３７）×１０３的蛋白不具有抗原性，相对分子质量１７×Ｉ旷的蛋白抗原为受试菌株的共同抗原，（３１、４１）Ｘ１０３抗原具有太鼠株和小鼠株的特异性。ＬＰＳ表现出较强的型的特异性。绪论本研究提取的ＯＭＰ和ＬＰＳ恬性稳定，并保持ｒ抗原性和免疫原性。【关键词】巴斯德氏菌病，肺；蛋白质类；脂多糖类【中图分类号】Ｒ３７２【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７１．７８５６（２００３】０５—０３００—０５ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＰａｓｔｅｕｒａｌｌａｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａＺＨＡＮＧＬｉ—ｆａｎｇ，ＬＩＵＸｉｎｇ．ＬＩｔｌｏｎｇ（’ＦｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩＪａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡＭＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｎａ）【ＡｂｓｔｒａｃｔｌＯｂｊｅｃｔｉｖｅＢｙｅｘｔｒａｃｔｉｎｇＯｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）ａｎｄＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｅｈａｒｉｄｅ（ＬＰｓ）ｏｆＰａｓｔｅｕｒａｌｌａｐｎｅｕ—ｍｏｔｒｏｐｉｃａｔ０ｓｔｕｄ）＇ｔｈｅｉｒａｎｔｉｇｅｎｉｅｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙＭｅｔｈｏｄｓＯＭＰａｎｄＬＰＳｏｆ１６Ｐｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａｓｔｒａｉｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１５ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ－ａｔｉｖｅａｎｄｏｎｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎ）ｗｅｒ『ｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｗｉｔｈｔｈｅｉｒａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｓｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｈｏｌｅｃｅｌｌ（ＷＣ）ｖｌａＥＬＩＳＡ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｍｅｔｈｏｄｓＲｅｓｕｌｌｓＯＭＰｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ１６ｓｌｒａｉｎｓｏｆＰｐｎｅｕｎｗｔｒｏｐｉｃａｓｈａｒｅｔｈｅｓａｍｅｒｏｓｕｌｔｏｆＳＤＳ—ＰＡＧＥＴｈｅｒｅ’ｒｅｆｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄｓｌｏｃａｔｉｎｇａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｔｇｈｔ（１７．２６，３１．３７，４１）×１０３，ｗｈｉｃｈａＩｅｌｌｏｔａｅｃｅｓｓｉｂｋｔｏｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅａｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄＬＰＳｏｆｆｉｖｅＰｐｒｔｅｕｍｏｔｒｏｐｉｅａｓｔｒａｉｎｓａｒ『ｅａｌｌｔｈｅｍ“ｇｈａｎｄｓｍｏｏｔｈｍｉｘｔｕｒｅ，ｗｈｏｓｅｍａｊｏｒｂａｎｄｌｏｃａｔｅｓａｔｍｏｌｅｃｕｌｅｗｅｌｇｈｔ１４ｘ１矿ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ．ａｎｄｂｏｔｈａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｏｆＯＭＰａｎｄ吣ｍａｉｎｔａｉｎＯＭＰａｎｄＬＰＳｈａｖｅｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＴｈｅｒｅ’ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｆｉｖｅｐｒｏ—ｔｅｉｎｈａｎｄｓｏｆＯＭＰａｎｄｔｈｅｂａｎｄａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ（２６．３７）×１０３ｄｏｅｓｎ’ｔｓｈｏｗａｎｔｉｇｅｎｉｅｉｔｙ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎａｎｔｉｇｅｎｏｆｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｌｏｃａｔｅｓａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｔ‘ｇｈｔ１７×１０３，ａⅡｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｈｉｃｈｌｏｃａｔｅａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ（３１，４１）×１０’ｈａｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｎｌｏｕｓｅｓｔｒａｉｎａｎｄｒａｔｓｔｒａｉｎ．ＬＰＳｓｈｏｗｓｓｔｒｏｎｇｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ＣｏｎｅｌｕｓｌｏｎＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＯＭＰａｎｄＬＰＳｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ＆ｒｅｓｔａｂｌｅｉｎａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｍａｉｎｔａｉｎ１Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐａｓｔｅｕｒａｌｌｏｓ￡’ｐｒｔｅｕｍｏｎｉｃ；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｆｉｄｅｓｆ基金项目］本课题受北京市科委实验动物科学专项基金资助嗜肺巴氏杆菌是ＳＰＦ实验动物最常见的污染菌（９５３９９１２００）【作者简介１张丽芳．女（１９７１一），助理研究员，研究方向：实验动之一，对嗜肺巴氏杆菌的检测一直沿用分离培养法，物学微生钫专业。由于细菌抗原成分复杂，部分菌种甚至菌属之问存【通讯作者］李红在共同抗原而引起的血清学交叉反应，阻碍了血清万方数据中国比较医学杂志２０（１３年Ｉｏ月第１３卷第５期ＣｈｉｎＪＣｏｍｐＭｅｄ，Ｏｃｔｅｍｂｅｒ２００３，Ｖｏｌ１３Ｎｏ５３０１学诊断法在实验动物细菌学监测中的运用。外膜蛋白和脂多糖是细菌表面主要的抗原物质，具有型和种的特异性，已广泛用于血清学方法的诊断抗原。已有研究显示，嗜肺巴氏杆菌的脂多糖具有型的特异性，受该菌感染的动物能产生抗高效价的脂寡糖（ＬＯＳ）Ｉ蜘抗体”。”，对嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ的研究国内外尚未见报道。先前的研究表明，相对分子质量（１７、３ｌ、４０）×１０３的蛋白是嗜肺巴氏杆菌种的共同的特异性抗原，相对分子质量（２０、２８）×１０３的蛋白可能是型的特异性抗原”１。由于对嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ缺乏了解，尚不知全菌抗原图谱巾表现出的特异性抗原是否与ＯＭＰ和ＬＰＳ有关。故本研究用常规方法提取了有代表性的嗜肺巴氏杆菌的ＯＭＰ和ＬＰＳ，并对其抗原性、稳定性进行初步观察，以期选择出数种特异性抗原用于实验动物嗜肺巴氏杆菌隐性感染的血清学检测。１材料和方法１．１材料１．１ｌ实验动物清洁级ＫＭ小鼠，体重１８～２２ｇ，购自中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：ＳＣＸＫｌｌ－００～００６。１．１．２受试菌株来自全国各地实验动物饲养单位的大鼠和小鼠群的嗜肺巴氏杆菌共Ｉ５株。１．１．３参考菌株嗜肺巴氏杆菌标准株５２９３０（３），由中国药品生物制品检定所提供。１．２试剂１２．１月桂酰基肌氨酸钠（ｓａｒｋｏｓｙＪ）鼎国生物技术发展中心提供。１．２．２重蒸酚鼎国生物技术发展中心提供。１．２．３酶标抗体辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠ＩｇＧ，北京生物制品研究所提供。辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠ｉｓＧ，鼎国生物技术发展中心提供。１．３仪器１．３．１超声波处理仪、电泳仪，ＡｎＡ日本。１３２转移电泳仪、酶标仪，ＢＩＯ—ＲＡＤ美国。１．３３紫外／可见分光光度计，ＰｈａｎｎａｃｌａＰＬＵＳ．Ｓ美国。ｌ３．４高速、超速冷冻离心机，真空冷冻干燥机，Ｂｅｃｋｍａｎ美国。１．４方法１．４．１外膜蛋白（ＯＭＰ）的提取参照文献［４］进行。万方数据１．４．２脂多糖（ＬＰＳ）的提取参照文献［５］进行。１．４．３ＳＤＳ．聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）参照文献［６ｊ进行。ｌ４．４蛋白质印迹分析（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）参照文献［６］进行。１．４．５酶联免疫吸附试验（ＥｌＪＳＡ）参照文献［７］进行。１４．６ＯＭＰ和Ｉ．Ｐｓ免疫血清的制备ＫＭ小鼠６０只，雌雄各半，随机分组，每组２０只，将抗原（ＯＭＰｌ５ｐｇ，只，ＬＰＳｌ０ｐｇ，只）与弗氏完全佐剂等体积混台，皮下多点注射。四周后加强免疫，注射弗氏不完全佐剂与等体积抗原混合物。三周后眼眶采血，ＥＬＩＳＡ测效价，抗体达到要求滴度即放血。对照组注射生理盐水。２结果２．１嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ的１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果见图１。Ｉ，３．５，７，９：Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，ＲＩ，Ｒ２分离株峭的沉淀２，４，６．８＋１０：Ｍｌ，Ｍ２，Ｍ３，Ｒ１，Ｒ２分离株ＩＰＹ，的上请圈Ｉ嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ的１５％ＳＤｓ＿ＰＡＧＥ结果（银染）２，４，６．８，１０：ｓｕｐｅｍｔｖａｔ咖ｏｆＩＹＳｏｆ㈣ｌａｔ自Ｍｌ，Ｍ２，Ｍ３，Ｒ１，Ｒ２１，３．５，７．９：碚ｄｉｎｌｅｎｔｏｆＬＰＳｏｆｉｓｄａｌｅｓＭｌ，Ｍ２．Ｍ３．ＲＩ，Ｒ２Ｆｉｇ．１１５％ＳＤｓ．ＰＡＧＥｒｅｓｕｌｔｏｆＰｐｎｅｕｎｍｔｒｏｐｉｃａＬＰＳ，ｓｉｌｖｅｒ＊ｓｔａｉｎｄｅｄｇｅｌｓ如图１所示，５株嗜肺巴氏杆菌提取的ＬＰＳ上清和沉淀ＳＤＳ．ＰＡＧＥ显示无明显差别，在１４．４×１０３上下有大量的ＬＰＳ聚集条带，在较高相对分子质量处也有不等量的ＬＰＳ条带。２．２嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ１５％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ结果１６株嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ基本一致，有５条主带，相对分子质量大约为（１７、２６、３ｌ、３７、４１）×１０３．见图２。２．３ＯＭＰ的稳定性２．３．１不同培养基对ＯＭＰ的影响为评价营养成分对ＯＭＰ条带及抗原性的影响，将两株嗜肺巴氏杆菌分别接种于普通营养琼脂培养基、３％羊血营养琼脂培养基、脑心浸液营养琼脂培养基、胰胨豆胨琼脂中国比较医学杂志２００３年１０月第１３卷第５期ＣｈｉｎＪＣｏｍｐＭｅｄ．０ｃｋｍ【ｍｒ２００３，Ｖｃａ１３Ｎｏ５培养基、营养肉汤培养基。经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析ＯＭＰ在数量和浓度上无明显无变化。Ｒ２株ＬＰＳ提取物与Ｍ３株自然感染血清无相应的反应条带。ｒ述反应均与嗜肺巴氏杆菌全菌抗原与Ｍ３株自然感染血清的反应条带相吻合。２．５嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ与ＯＭＰ提取物的免疫原性２．５１免疫动物结果５株嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ和Ｔ．Ｐｓ提取物免疫动物后＋均可引起动物的免疫应答反应，加强免疫后３周，就可产生ＩｇＧ抗体，见表１。表１ＬＰｓ和ＯＭＰ免疫小鼠所产生的ＩｇＧ抗体滴度（ＥＬＩＳＡ）Ｔａｂ１ＳｅｒａｔｉｅｒｓｏｆｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈＴ．ＰＳａｔ■ＯＭＰｌ标准株；２～１４巾鼠分离株；１５城：＾鼠分离株图２嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ１５％的ＳＩＸＣ．，－ＰＡＧＥ结果（考马斯亮蓝染色）ｌｓｔａｎｄａｏｆ异ｌｒａｉｎ：２—１４ｉｓｏｌａＬｅＨｏｆｍｏｕｓｅ：１５．１６ｏｆＰｉｓｏｌａｋｓｏｆｒａｔＦ谴．２１５％ＳＵＳ—ＰＡＣＥｒｅｓｕｈｌｍｅＵｍｏｔｒｏｐｉａｇｅｌｓＯＭＰＣ００ｒｎａｓｓｉｅｂｌｕｅ—ｓｔａｉｎｄｅｄ２３．２不同培养时问对ＯＭＰ的影响收集两株嗜２５．２嗜肺巴氏杆菌不同菌株ＯＭＰ和ＬＰＳ的交叉受试茼株与相应的免疫血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎ肺巴氏杆菌１２、２４、３６、４８ｈ营养肉汤培养物提取的反应ｂｌｏｔ—ＯＭＰ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ显示ＯＭＰ条带无明显变化。２．３．３体外传代次数的影响将嗜肺巴氏杆菌两株在普通营养琼脂培养基连续传代至１５代。初代、第５代、第ｌｏ代、第１５代培养物制备ＯＭＰ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ屁示传代次数对该ＯＭＰ无明显影响。２．４嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ和ＯＭＰ提取物的活性５株嗜肺巴氏杆菌提取的ＯＭＰ和ＬＰＳ与Ｍ３株自然感染血清均发生反应。小鼠株Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３株ＯＭＰ提取物与Ｍ３株自然感染血清的反应条带在相对分子质量（】７、２６、３１、４１）×１０３处，大鼠株Ｒ１，Ｒ２株ＯＭＰ提取物的反应条带在相对分子质量（１７、３Ｊ、４１）×１ｔｉｒｔｇ交叉反应，结果如图３，４。ＬＰＳ除ｒ可与自身免疫血清发生较强的反应外，与其他型ＬＩｅＳ菌株的ＬＰＳ免疫血清也可产生一定的交叉反应，结果见图３。大鼠和小鼠株相对分子质量为１７×１０３的ＯＭＰ可以被所有受试菌株的抗血清识别，相对分子质量为（３ｌ、４１）×１０３抗原能和所有大鼠免疫血清反应，而大鼠的该相对分子质量抗原却不能与小鼠免疫血清反应。ＯＭＰ的５条带中，相对分子质量为３７×１０３的蛋白与所有受试菌株的抗血清未见明显反应带，相对分子质量为２６×１妒的蛋白仅与１株大鼠株抗ｍ清反应，见图４。０３处。ＭＩ、Ｍ３、Ｒ１株ＬＰＳ提取物与Ｍ３株自然感染血清的反应条带在相对分子质量Ｊ４４×１０３处，Ｍ２、１，２，３：小鼠分离株Ｍ１．Ｍ２，Ｍ３；４，５：鼠分离株Ｒ１，ｌｔ２图３１，２，３：ｉｓｏｌａｔ…ｏｆ…Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３；４，５：ｌ—ａｋ９０ｆｏｆＰ５株嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ与其免疫血清的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ｒａｔＲＩ，Ｒ２ｐｔｍｕｍｏｔｒｏｐｉｃａＬＰＳＦｉｇｔ３Ｗｅｓｔｅ丌１ｂｌｏｔＰｒｍｕⅢ７＂ＩｍＬＰＳｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｌｓｅｒａｏｆＰ万方数据中国比较医学杂志２００３年１０月第１３卷第５期ＣｈｉｎＪＣｏｍｐＭｅｄ．Ｏｃｔｅｍｂｅｒ２００３，Ｖｏｌ１３Ｎｏ５３０３ｌ，２．３：小鼠分离株Ｍ１．Ｍ２，Ｍ３；４，５：大鼠分离株Ｒ１．Ｒ２图４５株嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ与其免疫血清的Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ分析Ｉ．２．３：ｉⅢ，ｌａｔｅｓＦｉｇ．４ＷｅｓＷ，ｍｂｌｏｔｏｆＰ…ｃ…ＯＭＰｏｆ…ｓｅＭ１，Ｍ２，Ｍ３；４，５：ｉｓｏｌａｌ％ｏｆｗｉｔｈｒａｔＲ１，Ｒ２ＰｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａＯＭＰｄｉｆｆｅｒｅｎｔⅡｔｉｓｅｒａｏｆ３讨论ＯＭＰ和ＬＰＳ的提取方法有很多种，不同的提取方法对ＯＭＰ和ＬＰＳ的生物活性影响很大，进而影响其抗原性。因此，我们对所提取的ＯＭＰ和ＬＰＳ进行了稳定性、抗原性的观察。本研究中用月桂酰摹肌氨酸钠盐法提取了外膜蛋白，１６株嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ基本一致，有５条主带，相对分子质量大约是（１７、２６、３１、３７，４１）×１０３，这其中包括了嗜肺巴氏杆菌特异性抗原（１７、３１、４１）ｘ１０“…。有文献显示，ＯＭＰ的稳定性与培养基成分、培养时问和体外传代次数有关”…ｏ，但本研究显示，嗜肺巴氏杆菌的ＯＭＰｆ‘分稳定，上述三种困素对它几乎没有影响。用酚水法提取５株嗜肺巴氏杆菌的Ｔ．Ｉ）ｓ，水溶性较差，取沉淀和上清同时做ＳＤＳ—ＰＡＧＥ并银染观察，可见在１４．４Ｘ（１７、３１、４１）×１０３的抗原条带。ＬＦＳ与嗜肺自然感染血清的反应与全蔺抗原相似，证实本研究提取的外膜蛋白和脂寡糖保持其抗原反应性，ＯＭＰ和ＬＰＳ提取物均可引起动物的免疫应答反应，加强免疫后３周，均可产生ＩｇＧ抗体。证实其保留了免疫原性。相对分子质量１７×１０３的ＯＭＰ为受试菌的共同抗原，并表现出强烈的免疫反应性；（３１、４１）×ｌ护抗原能和所有大鼠免疫血清反应，而大鼠的该相对分子质量抗原却不能与小鼠免疫血清反应，这提示可以用小鼠的ＯＭＰ作为诊断抗原检测小鼠株和大鼠株产生的抗体；反之，大鼠株的ＯＭＰ则不宦作为渗断抗原。ＬＰＳ除了可与自身免疫血清发生反应外，与其他菌株的ＬＰＳ免疫血清也可产生少量的交叉反应，这与自然感染小鼠血清结果一致。ＬＰＳ表现出较强的型的特异性，３株小鼠株中只有２株ＴＪ）ｓ之间有交叉反应，２株大鼠株问ＬＰＳ无交叉反应。本研究中ＯＭＰ和ＬＰＳ抗原与抗血清的交叉反应不完全一致，大鼠株和小鼠株的交叉反应也不完全一致。ＬＰＳ结构的异质性通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ已有所ｒ解，大鼠株和小鼠株的ＯＭＰ相对分子质量虽然相１一上下有大量的ＬＰＳ聚集条带，在较高相对分子质量处也有不等量的Ｉ．Ｐｓ条带。酚水法提取的ＬＰＳ为粗糙型脂多糖（Ｒ—ＬＰＳ）和光滑型脂多糖（Ｓ－ＬＰＳ）的混合物““。Ｐａｔｒｉｃｋ用蛋白酶Ｋ法的提取物为嗜肺巴氏杆菌脂寡糖（ＬＯＳ），相对分子质量为４．３×１驴左右，相对分子质量的差异可能与提取方法有关”１。本研究提取的嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ比Ｐａｔｒｉｃｋ提取的ＬＯＳ具有更多的重复寡糖单位，特异性更强，抗原谱更广。５株嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ相对分子质量的异质性提示嗜肺巴氏杆菌ＬＰＳ具有型或种特异性抗原的可能。本研究中ＯＭＰ和ＬＰＳ提取物与嗜肺自然感染血清均发生反应。ＯＭＰ的５条条带抗原性存在差异，相对分子质量为（２６、３７）×１０３的蛋白不具有抗原性，与嗜肺自然感染血清反应有相对分子质量为同，但ＯＭＰ免疫反应的异质性提示ＯＭＰ在结构上存在异质性。嗜肺巴氏杆菌ＯＭＰ抗原的异质性可以使鼠群在感染嗜肺巴氏杆菌产生初次免疫反应后再次感染不同型的嗜肺巴氏杆菌菌株，从而使嗜肺巴氏杆菌感染长期存在。先前的研究已经表明，嗜肺巴氏杆茼在大鼠和小鼠中传播没有宿主特异性，同一株嗜肺巴氏杆菌同时感染小鼠和大鼠，并能长期定植，而保持基因型不变“…；我国南北不同的３个城市来源的１７株嗜肺巴氏杆菌存在４个基因型，而本研究中的受试株就分属于不同的型。嗜肺巴氏万方数据中国比较医学杂志２００３年１０月第１３卷第５期０ｆｉｎＪＣｏｍｐＭｅｄ，Ｏｃｔｅｍｂｅｒ２００３．Ｖｏｌ１３Ｎｏ．５杆菌这种复杂的基因型和交互感染能力，不同菌株Ｈ严杰，罗海渡。陆德源，主编现代微生物学吏验技术及其应用问外膜蛋白和脂多糖抗原抗体反应的差异，使该菌［Ｍ］北京：人民卫生出舨社．１９９７，２４５—２４６血清学诊断变得更为复杂。所以，作为诊断抗原，必¨潘勘草，黄志成，余文炳，等．肠出血性大肠杆菌０１５７：１ｔ７脂多糖抗原的制备及鉴定ｆＪ］中国人兽共患病杂志．１９９９，１５须能尽可能代表不同株，即多价抗原，Ｐａｔｔｉｃｋ从１３（３）：５９—６１株嗜肺巴氏杆菌中挑选具有代表性的３株，将其¨金冬雁等译．分子克隆实验指南［Ｔ］，第２版，北京：科学出版ＬＯＳ混合制备成诊断抗原，此法显著提高了其诊断杜，１９９５．９８０—８８７，８８８—８９７的敏感性”－。＂杨廷彬，尹学念，生编实用免疫学［Ｍ］长春：蛀春｝【｝版社，综上所述，本研究中提取的ＯＭＰ和ＬＰＳ生物学１９９４，３６５—３７８，３５９—３６４¨ＭｍＷＫ．ＥｄｗａｒｄＯＭＪｒ．ＳｈｅｌｄｏｎＬＫ活性稳定，保持了其抗原性和免疫原性，并包括了嗜Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃｌｌｌａｒｋｅｒｓｙｓ・［ｅｍｆｏｒｃ‘ｎ曲口ｃ奸ｄＡＥｍ咄ｕｓｉｎｇｏｕｔｅＹｍｅｍｈａＩ”ｐｍｔｅｌａｐｒｏｆｉｌ嘴【Ｊ］肺巴氏杆菌特异性抗原，作为嗜肺巴氏杆菌诊断抗ＪＣｌｉｎＭｉｃｌｏｂｉ０１．１９８９，３０（２）：１７９３—１７９６原是有一定应用前景的，但这两种抗原做为诊断试¨ＹｌａｃｈｉＴａｇａｗａ．Ｈｉｔｏｓｈｉｔｓｈｉｋａｗａ．Ｎｏｈ，珊Ｙｕａ蛐Ｐｕｒｉｆｉｅａｔｉｏｎａｎｄ剂，其敏感性和特异性还有待于进一步研究。ｎｗｐｈｉｌ时删ｌＪｐａ．ＪａｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍⅢ０ｒｏｔｌ［ｅｒｒ腿ｎｒｂｒｍＪｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆ胁ｅＪＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｌ—ｕｎｉｔｙ，１９９３．２０（１）：９１参考文献９６ｍＴｌａｍｄｌｙＦＭ．＾ｄＭＢ．ＤｉａｎｅＭＤ．ｅｔｄＯｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｌ１ＪＰａ矗ｃｋＪＭ．Ｊｎ端Ｇ，ＤａｖｉｄＤ．ｅｔａｌＥｎｚｙｍｅ．Ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏ鼬ｒｂｅｎ‘卸ｄｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｔⅢｌｄｍＭｄｌｅⅢ，ｓａｙａｎｄｉ—ｕｎｏｂｌｏｔｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｅｃｈａｒｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ删ｒｅｄａＩｌａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｎｍｕｎｏｄｏｂｕｌｉｎＧｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｅⅡｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｏｔｉｆｉｓｍｅｄｉａｄｕｅｔｏｎｏｎｔｙｐａｂｌｅｍ㈣“ｋＩ讲Ｗｍｅ：ｗｂｏｌ÷ｃｅＩｌａｎｄｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｅｃｈａｒｌｄｅａｎｔｉｇｅｎｓｏｆ‰ｋｕｍ口口㈣一ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｅａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｏｂ—ａｔｉｏｍｌＪ］ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，ｔｒｏｐｉｃａｉｎｌａｂｏｍｌｏｒｙｍｉｅｅＷｉｔｈｌａｔｅｎｔＰａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ［Ｊ］ＪＪＣｆｉｎＭ—１９８７：１５６（５）７２３—７３０ｂｉａｌ，１９８９，２７（１）：２１９０—２１９４…【２ＪＰａｔｒｉｅｋＪＭ，ＤａｖｉｄＤ，ＲｏｌａｎｄＧ，ｅｔａｌＡｎｅｌｍｙ—ｌｉｎｋｅｄ｛Ⅻｎｍｎ∞ｍ‰焦丙华，主编分子内毒素学［Ｍ］．上海：Ｌ海科学技术文献出版社，１９９５．２１３—２５４ａ％ａｖｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｍｒｆｉｃｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌＰａｓｔｅｕｒｄ／ａｐ㈣ｍｐ／ｃｌＴ‰一ｍ石朝辉，李红．张丽芳，等，嗜肺巴氏德杆菌基因分型及在分子流ｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅＥＪ］ＩｚｈＡｎｉｍＳｃｉ，１９９１．４１（２）：１６２—１６５行病学中的意义［Ｊ］中国实验动物学报，２。００，８（２）：６５—６９［３］李红，刘星，张丽芳，等嗜肺巴氏杆菌蛋白及抗原图谱初步分析［Ｊ］中国宴验动物学报，２０００，８（１）：７一Ｉｌ收藕日期］２００２．０９－２７６ｄ∞镕∞｛、§论著摘要￥＆㈣一∞｛；渺大鼠隐静脉注射方法探讨李培建，果海红，王玉乾眺ｐ（解放军第２５２医院动物实验中心，保定０７１０００）大小鼠静脉注射多采用尾静脉。小鼠采用此法较易，大轻推动即见到药液缓缓流人血管。鼠较困难，成功率较低，反复多次注射就更加困难。常常因④注射完毕，拔出针头，干棉球压迫穿刺部位２—３ｒａｉｎ止血。为给药困难使实验陷于困境。我们摸索出一种隐静脉注射方法，此方法操作简单可靠，成功率岛，可达到无菌注射要２注意事项求，能反复多次静脉注射，是・种比较理想的穿刺方法或尾①从后肢较远端开始穿刺，加上使用双侧隐静睐，可以连续静脉穿刺失败的补救方法。现介绍给同仁参考。多次穿刺给药。１注射方法③针头需锐利。注射针头以４，４５号较好，针头越小损伤越小，对下次穿刺影响就越小。①将大鼠麻醉（乙醚或氯胺酮），仰卧固定，暴露后肢内侧．剪③注射完毕后压迫时间应不少于２ｍｉｎ，若止血效果差，必须去局部鼠毛．酒精、碘酒常规消毒皮肤。增加压迫时间，以防血液外渗形成淤斑，影响下次穿刺。＠沿后肢内侧中线切开皮肤约０５—１０ｃｍ，由于张力作用．④隐静脉穿刺还可用于豚鼠、地鼠、大小鼠的采血及静脉注自然裂开切１３能见到一条深红色血管即大鼠隐静脉。射，只是采血时应选用５．５—６号针头，针头太小易凝血堵针③以左手固定大鼠后肢，右手握注射器将针头刺人ｍ管．轻头，针头太大损伤较大不易止血。（ｑｔ疆日期】２００３－０７－２８万方数据