千金藤碱抑制非小细胞肺癌A549细胞生长和转移以及对血红素加氧酶一1和表皮生长因子受体基因表达的影响

Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ＣＦＩ　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｒｎ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭＣ／）ＬＬＥＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２０１３　５７　千金藤碱抑制非小细胞肺癌Ａ５４９细胞生长和转移以及　对血红素加氧酶一１和表皮生长因子受体基因表达的影响　马克龙　，汪远金　，周　会　，李　璐　，张腾跃　，罗晓莹。　（１．安徽中医学院中西医结合临床学院，安徽合肥　２３００３８；２．安徽省立医院，　安徽合肥　２３００３２；３．上海交通大学医学院上海市肿瘤研究所，上海　２０００３２）　［摘要］目的　探讨千金藤碱抑制肺癌细胞Ａ５４９生长、迁移和侵袭的作用以及对血红素加氧酶一１（ｈｅｍｅ　ｏｘｙ—　ｇｅｎａｓｅ一１，ＨＯ－１）和表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）基因表达的影响。　方法　甲基噻唑基四唑（ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）比色法检测千金藤碱对肺癌细胞的细胞毒性，　观察其对Ａ５４９细胞生长的抑制作用，并用倒置显微镜观察千金藤碱处理不同时间内Ａ５４９细胞的形态变　化；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ和侵袭实验检测Ａ５４９细胞迁移和侵袭能力；ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法分别检测Ａ５４９细胞　内ＨＯ一１和ＥＧＦＲ基因的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平。结果　千金藤碱能够抑制肺癌细胞Ａ５４９细胞的生长，　细胞活力随着作用浓度的增加和时间的延长明显降低；１０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理２４　ｈ后，Ａ５４９细胞发生体积　变小、皱缩变圆和染色体固缩等现象；与对照组相比，千金藤碱（＞５．０　ｇ／ｍ１）可使穿过隔膜和穿过基质胶的　Ａ５４９细胞数明显减少（Ｐ＜０．０５）。１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱明显降低Ａ５４９细胞中ＨＯ一１和ＥＧＦＲ基因的ｍＲ—　ＮＡ和蛋白表达水平（Ｐ＜０．０５）。结论　千金藤碱可抑制肺癌细胞的增殖，降低Ａ５４９细胞的迁移和侵袭能　力，下调Ａ５４９细胞的ＨＯ一１和ＥＧＦＲ基因的表达水平，且作用效果具有一定的时间和浓度依赖性。　［关键词］千金藤碱；非小细胞肺癌；Ａ５４９．细胞；血红素加氧酶一１；表皮生长因子受体　［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标志码］Ａ　ＦＤＯＩ￣１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—２２１９．２０１３．０２．０１８　非小细胞肺癌（ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，　（ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　Ｅ２一ｒａｌａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２，Ｎｒｆ２）表达并使　其在核内大量积聚［４］，进而激活下游基因（血红素加　氧酶一１（ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１，ＨＯ一１）、烟酰胺腺嘌呤　二核苷酸脱氢酶，醌一１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，　ｑｕｉｎｏｎｅ　１，ＮＱＯ１）和谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，　ＮＳＣＬＣ）是我国最常见的恶性肿瘤，其发病率和病　死率位于各种肿瘤的第一位口　］。肺癌的演化和进　展与肿瘤细胞内氧稳态失衡密切相关ｌ３］。ＮＳＣＬＣ　细胞内严重氧化应激状态和活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）负荷会诱导核因子Ｅ　相关因子２　ＧＳＨ））的表达＿５］，不仅导致细胞增殖和凋亡能力的　改变，还可影响肿瘤细胞的微环境，提高肿瘤细胞的　基金项目：国家自然科学基金项目（８１２０１５７６）；上海市肿瘤　研究所青年学者资助项目（ＳＢ０９０８）；安徽省高等学校　省级自然科学研究项目（ＫＪ２０１３Ｚ１８４）；安徽中医学院　自然科学研究基金项目（２０１２ｚｒ００８）　作者简介：马克龙（１９７９一），男，博士，讲师　侵袭性，促进肿瘤的转移＿６。］。因此，从氧化应激方　面研究ＮＳＣＬＣ侵袭和转移的分子机制，对于肺癌　的治疗研究具有重要的意义。　千金藤碱是一种天然的植物生物碱，主要来自　中药千金藤属植物千金藤和地不容。既往研究表明　ＡＥＤ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ａｎｄ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｓｉｄｅｎａｆｉｌ　（１０．５　ｍｇ／ｋｇ　ｄａｉｌｙ）ｇｒｏｕｐ，ｈｉｇｈ—ｄｏｓｅ　ＳＧＹＹ　Ｃａｐｓｕｌｅ（１　ｇ／ｋｇ　ｄａｉｌｙ）ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ｌｏｗ—ｄｏｓｅ　ＳＧＹＹ　Ｃａｐｓｕｌｅ　（０．５　ｇ／ｋｇ　ｄａｉｌｙ）ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　３Ｏ　ｄ．　Ｔｈｅ　ｓｅｘｕａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ（ＡＰＯ）ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｂｉｌａｔｅｒａｌ　ｔｅｓｔｅｓ　ａｎｄ　ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｓ，ｐｒｏｓｔａｔｅ，ｓｅｍｉｎａｌ　ｖｅｓｉｃｌｅ，ａｎｄ　ｂｕｌｂｏｃａｖｅｒｎｏｓｕｓ　ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ；ｔｈｅ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｏｒｇａｎ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＡＰＯ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ　ａｎｄ　ｌｏｗ－ｄｏｓｅ　ＳＧＹＹ　Ｃａｐｓｕｌｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｍｏｒｅ　ｔｉｍｅｓ　ｏｆ　ｐｅｎｉｌｅ　ｅｒｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈｉｎ　３０　ｍｉｎ（Ｐ＜０．Ｏ１）ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔｅｓ，ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｓ，ａｎｄ　ｂｕｌｂｏｃａｖｅｒｎｏｓｕｓ　ｍｕｓｃｌｅ（Ｐ＜Ｏ．０５），ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＳＧＹＹ　Ｃａｐｓｕｌｅｓ　ｃａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｓｅｘｕａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔｅｓ　ａｎｄ　ａｕｘｉｌｉａｒｙ　ｓｅｘ　ｇｌａｎｄｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＥＤ．　［－Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｓｈｕｇａｎｙｉｙａｎｇ　Ｃａｐｓｕｌｅ；ｅｒｅｃｔｉｌｅ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｓｅｘｕａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｏｒｇａｎ　５８　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ　ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ＣＯＩＩＩ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭＣＯＬＬＥＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２０１３　其具有抗炎、抗氧化和免疫调节的作用　］。目前国　内外研究表明，它还具有诱导细胞凋亡ｌｇ。　，逆转肿　瘤细胞多药耐药的作用＿ｌ　，以及抑制血管生成和调　控细胞周期的作用ｌ１　。但是对肺癌细胞增殖、迁移　和侵袭的作用，目前尚未见报道。本研究探讨了千　金藤碱对Ａ５４９细胞生物学的影响。　１材料与方法　１．１　材料千金藤碱购自中国生物制品所（纯度≥　９８．０　；Ｎｏ．Ａ０６５３）；ＲＭＰＩ一１６４０培养液和胰蛋白　酶购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清（ｆａｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，　ＦＢＳ）购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；甲基噻唑基四唑（ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）和ｔ？－ａｃｔｉｎ抗体购自　Ｓｉｇｍａ公司；聚偏二氟乙烯（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｆｌｕｏｒ—　ｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜和ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ荧光定量ＰＣＲ试剂　盒购自Ｒｏｃｈｅ公司；增强化学发光（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍ—　ｉｃａｌ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）液购自ＰＩＥＲＣＥ公司；　ＨＯ一１和表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ　ｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）抗体购自Ａｂｇｅｎｔ公司；ＴＲ—　ｈｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；放射免疫沉淀测定　（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ，ＲＩＰＡ）裂解液购　自上海工硕生物技术有限公司；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　１Ｉ反　转录系统购自天根生物公司；其他试剂均为国产分　析纯或进口产品。　１．２　细胞培养　人ＮＳＣＬＣ细胞株Ａ５４９细胞　（ＴＣＨｕｌ５０）购自中科院上海细胞库，于含１０　ＦＢＳ的ＲＭＰＩ一１６４０的完全培养基，３７℃和５　ＣＯ　饱和湿度的培养箱中培养。用不含乙二胺四乙酸　（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　ｔｅｔｒａａｃｅｔｌ‘ｃ　ａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）的　０．２５　胰蛋白酶常规消化传代，选取对数生长期细　胞进行实验。　１．３倒置显微镜观察细胞形态变化　对数生长期　的Ａ５４９细胞接种于２４孔板（每孔１．０×１０　个细　胞），培养过夜。不同浓度千金藤碱（０、０．１６、０．８Ｏ、　４．（）（）、２０．００、１００．００　ｇ／ｍ１）处理细胞，于不同时间段　内（２４、４８、７２　ｈ）在倒置显微镜下观察细胞形态和生　长状态并拍照。　１．４　ＭＴＴ法检测细胞活力　Ａ５４９细胞用０．２５　胰酶消化，制成单细胞悬液后接种到９６孑Ｌ板（每孔　ｌＯＯ　１、２．０×ｌ０　个细胞），过夜，加入不同浓度的药　物（浓度设定同上，药物组和对照组均设３个复孔），　每日换液，分别于２４、４８、７２　ｈ后，每孔加入ＭＴＴ　溶液２０　ｌ，３７℃培养４　ｈ，离心，弃上清，加入二甲　亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ），每孔１００　ｔ，１，震　荡摇匀，用酶标仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ６８０）测定波长５７０　ｎｍ下　光密度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ａｔ　ａ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　５７０　ｎｍ，　ＯＤ　）值。细胞活力一用药组平均ＯＤ　。值／对照　组平均ＯＤ　。值×１００　Ａ０。以药物浓度为横坐标，细　胞活力为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验至少重复　３次。　１．５　细胞迁移和侵袭能力检测　取对数期生长　Ａ５４９细胞，用０．１　ＦＢＳ　ＲＭＰＩ一１６４０培养基重悬。　实验分为４组：对照组：加磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）；千金藤碱低剂量（２．５　ｇ／ｍ１）、　中剂量（５．０　ｇ／ｍ１）和高剂量（１０．０　ｇ／ｍ１）组。每组　各吸取１００　ｌ上ｌ（每组细胞数为１×１０　）的细胞悬液加　入上室中，各组小室下层均加人含１０　ＦＢＳ的　ＲＭＰＩ一１６４０培养基。于３７℃、５　ＣＯ　条件下培养　２４　ｈ，取出Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室，用棉签轻轻擦去滤膜上　室面的细胞，ＰＢＳ清洗，滤膜下室面的细胞用０．１　结晶紫染色２０　ｍｉｎ，镜下观察，随机取３个视野，计　数每个视野内的细胞数，取平均值。侵袭能力检测　时小室预先铺浓度为０．３　ｍｇ／ｍｌ的Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶，分　组及处理方式同上。实验重复至少３次。　１．６　ＲＮＡ抽提及目的基因ｍＲＮＡ表达检测　细　胞接种于６　ｃｍ板（每孑Ｌ　５．０×１０　个细胞），千金藤　碱处理，分组同上。细胞培养４８　ｈ后（千金藤碱高　剂量组分别培养２４、４８、７２　ｈ），取细胞总ＲＮＡ　５．０　ｇ和１００　ｍｍｏｌ／Ｉ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１　ｌ、１０　ｍｍｏｌ／Ｉ　ｄＮＴＰｓ　１“ｌ混合，６５℃加热５　ｍｉｎ后，立刻置于冰　上２　ｍｉｎ；加人反转录混合液（５×反转录缓冲液４　／，１，０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）　２　ｌ，核糖核酸酶抑制剂１０　Ｕ和Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　１１　”　反转录酶５０　Ｕ），４２℃反应５０　ｍｉｎ合成ｃＤＮＡ，７０　℃加热１０　ｍｉｎ后反应终止。Ｐｒｉｍｅｒ　３．０软件设计　目的基因引物（ＨＯ一１：上游为ＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧ　ＧＡＧＡＴＧＡＣＴＣ，下游为ＧＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧ—　ＣＡＧＣＴＣ，１１８　ｂｐ；ＥＧＦＲ：上游为ＧＣＣＴＴＧＡＣＴ—　ＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴ，下游为ＧＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴ—　ＧＡＴＴＧＴＧ，１２５　ｂｐ；ＧＡＰＤＨ：上游为ＡＧＧＧＣＴ—　ＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ，下游为ＧＧＧＴＧＧＡＡＴ—　ＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡ，１００　ｂｐ）。梯度ＰＣＲ检测各引　物的退火温度后进行ＲＴ—ＰＣＲ实验，反应体系为２Ｏ　ｌ，扩增结束后，取１０　ｌ　ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶　上电泳，用Ｓｍａｒｔｖｉｅｗ的凝胶成像系统（ＦＲ—Ｓｍａｒｔ—　ｖｉｅｗ　２０００，上海复日科技）进行凝胶成像。选择表　达有变化特异性好的引物进行ＳＹＢＲ＠实时ＰＣＲ　（Ｇｅｎｅ、ＴＭ６０００，Ｑｉａｇｅｎ）对目的基因的ｍＲＮＡ的　水平进行检测。　１．７　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验　细胞接种于６　ｃｍ板（每　孔５．０×１０　个细胞），分组同上。药物处理后收细　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ　ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｍ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡＩ　ＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭＣＯＩ　Ｉ　ＥＧＥ、　１．３２№．２　Ａ　２０１３　胞，用ＲＩＰＡ裂解液（含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟　（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＭＳＦ））裂解３０　ｍｉｎ，低温离心后取上清。以牛血清清蛋白（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）为标准品对蛋白质进行定量。　十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏ—　ｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏＤｈｏｒｅｓｉｓ，　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）分离蛋白后转至ＰＶＤＦ膜，５　脱脂奶　粉封闭１　ｈ后加入蛋白抗体（Ｊ３一ａｃｔｉｎ为１：１０　０００，　ＥＧＦＲ和ＨＯ一１各为１：１　０００），４℃孵育过夜，磷酸　盐缓冲液吐温２０（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ　Ｔｗｅｅｎ一２０，ＰＢＳＴ）洗涤４次（每次１５　ｍｉｎ），加二抗　（１：５　０００）温育２　ｈ，ＰＢＳＴ洗涤后加ＥＣＩ　，暗房中Ｘ　线下显影并摄片。　１．８统计学方法　连续型变量以“均数±标准差　（　±Ｓ）”进行统计学描述，采用Ｐｒｉｓｍ　５．０软件　（Ｇｒａｐｈ　Ｐａｄ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）进行单因素　方差分析（图５、图７、图９、图１Ｏ、图１２、图１４数据）　和双因素方差分析（图１、图２数据）。Ｐ＜０．０５为　差异有统计学意义。　２　结果　２．１　千金藤碱抑制Ａ５４９细胞的生长　Ａ５４９细胞　在不同浓度的千金藤碱处理不同时间后，使用　ＭＴＴ技术对其细胞毒性进行判定，并用倒置显微　镜观察细胞的形态变化。结果显示，千金藤碱处理　细胞后，细胞活力随着作用浓度的升高以及作用时　间的延长而明显降低，７２　ｈ的半数抑制浓度（ｍｅｄｉ—　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＩＣ５ｏ）为（１１．３５－０．８９）　ｇ／ｍＬ（图１）。根据其毒性设置的３个不同剂量千　金藤碱（２．５、５．０、１０．０　ｇ／ｍ１）处理细胞后发现，千金　藤碱（＞５．０　ｇ／ｍ１）明显抑制Ａ５４９细胞的增殖（图　２），且在镜下观察发现１０．０　ｇ／ｍｌ（约为千金藤碱的　ＩＣ　。量）干金藤碱处理细胞２４　ｈ后，细胞皱缩变圆，　体积变小，尤其在７２　ｈ后多数Ａ５４９细胞皱缩，贴壁　不牢，细胞数目减少（图３）。说明千金藤碱抑制　Ａ５４９细胞生长，抑制的程度与其作用的浓度和时间　成正相关。　１　１．　０　螺。　薰０　０　ｏ．Ｏｌ　ｏ．１Ｏ　ｔ．ｏｏ　ｌＯ．００　１００．００　千金藤碱浓度／（ｕ　ｇ／ｍ１）　图１　千金藤碱对Ａ５４９细胞的毒性（　一３）　１．５０　１．２５　１．００　恤０．７５　薰ｏ．５０　０．２５　０　０　ｌ２　２４　４８　７２　时间／ｈ　注：与对照组比较，＊Ｐ％０．０５。　图２　千金藤碱抑制Ａ５４９细胞增殖的作用（　一３）　一　一　注：Ａ．对照组；Ｂ．干金藤碱高剂量作用２４　ｈ；Ｃ．千金藤　一　碱高剂量作用４８　ｈ；Ｄ．千金藤碱高剂量作用７２　ｈ；绿色箭头　示正常Ａ５４９细胞，红色箭头示凋亡的Ａ５４９细胞。　图３　倒置显微镜下各组Ａ５４９细胞形态　２．２　千金藤碱对Ａ５４９细胞的迁移和侵袭的抑制　作用　５．０　ｇ／ｍｌ和１０．０　ｇ／ｒＩ１ｌ的千金藤碱处理２４　ｈ　后，细胞穿过隔膜的数目较对照组分别降低了２５．６　（ＰｄＯ．０５）和４６．５　（Ｐ％０．０１，图４和图５）。而在有　Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的侵袭能力检测实验中，与对照组相比，　５．０、１０．０　ｇ／ｍｌ的千金藤碱组穿过Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的Ａ５４９　细胞分别降低了２４．４￣／ｏ和５３．０　（Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ，图６和图　７），表明千金藤碱能显著降低Ａ５４９细胞的迁移和侵袭　能力，且作用的浓度越高，抑制的效果越明显。　２．３　千金藤碱对Ａ５４９细胞ＨＯ一１和ＥＧＦＲ　ｍＲ—　ＮＡ表达水平的影响　肿瘤细胞氧化还原平衡失调　与肺癌血管的生成及转移密切相关。不同浓度的千　金藤碱处理Ａ５４９细胞后，ＲＴ—ＰＣＲ分析细胞内的　ＨＯ一１和ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ的表达水平。结果显示，　Ｈｏ一１和ＥＧＦＲ的ｍＲＮＡ水平明显低于对照组（图　８）。进一步对不同浓度千金藤碱作用不同时间的　Ａ５４９细胞的Ｈｏ一１和ＥＧＦＲ进行实时定量ＰＣＲ分　析。与对照组相比，５．０、１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理　后，ＨＯ一１的ｍＲＮＡ水平分别下调了３７．０　和　４６．５　（Ｐ＜０．０５），而ＥＧＦＲ的ｍＲＮＡ表达分别　下降了２９．６　和４０．３　（Ｐ＜０．０５）（图９）。而且　６０　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｒｎ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭＣＯＩ　ＬＥＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２０１３　１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理４８、７２　ｈ后，Ｈ０—１的　ｍＲＮＡ水平分别下调了４４．３　（Ｐ＜Ｏ．０５）和　５Ｏ．８　（Ｐ＜０．０１），ＥＧＦＲ的ｍＲＮＡ表达分别下降　了３５．０　和４３．１　（Ｐ＜０．０５）（图１０）。表明千金　藤碱可抑制Ａ５４９细胞中ＨＯ一１和ＥＧＦＲ的ｍＲＮＡ　表达，且作用效果具有一定的时间和剂量依赖性。　注：Ａ．正常对照组；Ｂ．千金藤碱低剂量组；Ｃ．千金藤碱　中剂量组；Ｄ．千金藤碱高剂量组。　图４　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测千金藤碱处理后Ａ５４９的迁移能力　愚　鼠　疑　组别　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；　３．千金藤碱中剂量组；４．千金藤碱高剂量组；　与对照组比较，＊Ｐ＜Ｏ．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。　图５　千金藤碱对Ａ５４９细胞迁移能力的影响（　一３）　注：Ａ．对照组；Ｂ．千金藤碱低剂量组；Ｃ．千金藤碱中剂　量组；Ｄ．千金藤碱高剂量组。　图６铺Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测　千金藤碱处理后Ａ５４９的侵袭能力　籁　墓　器　ｊ审．　组别　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；３．千金藤碱中剂量　组；４．千金藤碱高剂量组；与对照组比较，＊＊Ｐ＜０．０１。　图７千金藤碱对Ａ５４９细胞的侵袭能力的影响（　一３）　Ｇ　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；３．千金藤碱中剂量　组；４．千金藤碱高剂量组。　图８　ＲＴ　ＰＣＲ检测ＨＯ－１和ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ的表达水平　１０．０　７．５　５．０　懈　鏖２．５　０　组别　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；３．千金藤碱中剂量　组；４．千金藤碱高剂量组；与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５。　图９　ｑＲＴ－ＰＣＲ检测不同浓度千金藤碱处理后　Ｈ０—１和ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ表达水平（”一３）　１０　７　土ｉ里　５　２　组别　注：与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。　图１０　ｑＲＴ—ＰＣＲ检测１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理不同时间后　ＨＯ一１和ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ表达水平（”一３）　２．４　千金藤碱对Ａ５４９细胞ＨＯ一１和ＥＧＦＲ蛋白　表达水平的调控　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测Ｈ（）一１和　ＥＧＦＲ基因在肺癌细胞中的蛋白表达水平。千金藤　碱处理后，ＨＯ一１和ＥＧＦＲ蛋白的表达水平明显降　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｍ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡＩ　（　ＡＮＨＵＩ　ＴＣＭ　ＣＯＩ　ＬＥＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｔ．２０１３　低（图１１）。５．０、１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理后，Ｈ（）一１　蛋白表达水平分别降低了５１．４　（Ｐ＜０．０５）和　３　讨论　ＮＳＣＩ　Ｃ约占肺癌的８Ｏ　以上，侵袭和转移是　导致ＮＳＣＩ　Ｃ患者复发和死亡的重要原因之一＿】　。　肿瘤的浸润和迁移与细胞的黏附能力、周围基质的　４２．２　（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦＲ蛋白表达水平分别降低　了ｌ１．２　和３４．３　（Ｐ＜０．０５）（图】２）。此外］０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理后，Ａ５４９细胞中Ｉ　）一１和ＥＧＦＲ　降解、细胞的增殖迁移和血管的生成等多种因素相　关＿１　。氧化应激是体内许多疾病发生发展的始发　或关键因素。氧化应激条件下，核转录因子Ｎｒｆ２结　合抗氧化反应元件（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ，　ＡＲＥ）后启动下游基因（如Ｈ０—１、ＧＳＨ、ＮＱＯ１）的　的蛋白水平随时间的增加浓度逐渐降低（网１３）。　与对照组相比，处理４８、７２　ｈ后，Ｈｏ～１蛋白水平分　别下降了４６．１　和５２．９　（Ｐ％０．０５），ＥＧＦＲ的蛋　白表达下降了２６．７　和５８．０　（Ｐ＜０．０１）（图１４）。　说明千金藤碱可明显降低Ａ５４９细胞中ＨＯ一１和　ＥＧＦＲ蛋白的表达水平，抑制效果与作用时间和作　用浓度成正相关。　１　２　３　４　ＨＯ一　ＥＧＦＲ　阳ｃｔｉｎ——　—　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；３．千金藤碱中剂量　组；４．千金藤碱高剂量组。　图１１　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测各组Ａ５４９细胞中　Ｈ０　１和ＥＧＦＲ蛋白表达水平　１　１　安０　组别　注：１．对照组；２．千金藤碱低剂量组；３．千金藤碱中剂量　组；４．千金藤碱高剂量组；与对照组比较，＊Ｐ＜Ｏ．０５。　图１２　各组Ａ５４９细胞中ＨＯ　１和ＥＧＦＲ蛋白的　相对表达水平（　一３）　对照　２４ｈ　４８ｈ　７２ｈ　ＥＧＦ：　Ｉ￣－ａｃｔｉ　图１３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测１０．０　ｇ／ｎ１１千金藤碱处理Ａ５４９细胞　不同时间后ＨＯ　１和ＥＧＦＲ蛋白表达水平　ｌ　羹　鬈０　至　组别　注：与对照组比较，＊Ｐ％０．０５，＊Ｐ％０．０１。　图１４　１０．０　ｇ／ｍｌ千金藤碱处理不同时间后Ａ５４９细胞中　ＨＯ—ｌ和ＥＧＦＲ蛋白的相对表达水平（　一３）　表达，从而改变细胞内氧化还原状态［１　。Ｈ０—１也　称为热休克蛋白一３２（ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３２，　ＨＳＰ３２），作为Ｎｒｆ２的下游调控基因是最易被诱导　的抗氧化应激的重要酶，具有维持细胞稳态，调节细　胞的炎性反应和细胞生长的作用。最近研究表明，　Ｈｏ一１的表达与肺癌的增殖和转移相关。Ｄｅｇｅｓｅ　ＭＳ等口。　发现ＨＯ一１在肺癌组织中的表达水平明显　高于癌旁组织，且其在晚期转移的肺癌组织中尤为　明显。Ｔｓａｉ　ＪＲ等　研究发现，ＨＯ一１的表达可以促　进Ａ５４９细胞的侵袭和转移能力。ＨＯ一１参与癌症　转移的机制尚不清楚，目前发现ＨＯ一１参与调控　ＥＧＦＲ、白细胞分化抗原１４７（ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ—　ｔｉｏｎ，ＣＤ１４７）和基质金属蛋白酶９（ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏ—　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ一９，ＭＭＰ一９）基因的表达而调节细胞的增　殖、迁移和转移ｌ＿１。删。ＥＧＦＲ是一种跨膜的糖蛋白，　可以启动多种信号转导途径来调节细胞的增殖和分　化。在肺组织中，Ｎｒｆ２　ＡＲＥ信号通路可以与ＥＧ　ＦＲ作用来调节肺上皮细胞对氧化应激的反应＿２。］，　同时ＥＧＦＲ也是Ｎｒｆ２的下游调控基因，Ｙａｍａｄｏｒｉ　Ｔ等　发现Ｎｒｆ２可通过与ＥＧＦＲ双向调控作用来　影响ＮＳＣＬＣ的增殖。　千金藤碱是从千金藤属中药中分离出来的一种　生物碱单体，除了具有稳定生物膜、清除自由基、免　疫调节和逆转多药耐药等作用外　，还可抑制细胞　增殖［２。　和促进肿瘤凋亡　。最近研究发现，千金藤　碱可抑制肿瘤血管的生成来阻止肿瘤的转移。例如　Ｈａｒａｄａ　Ｋ等　。　研究表明，千金藤碱可通过下调血　管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ—　ｔｏｒ，ＶＥＧＦ）和白细胞介素一８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一８，ＩＬ一８）　的表达而抑制口腔鳞状细胞癌的成瘤性和血管的生　成。千金藤碱对ＮＳＣＩ　Ｃ耐药性有一定的调控作　用。Ｉｋｅｄａ　Ｒ等［２　研究显示，千金藤碱可以抑制多　药耐药蛋白７（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　７，　ＭＲＰ７）的表达而降低Ａ５４９对吉西他滨的耐药性。　但是，千金藤碱对ＮＳＣＩ　Ｃ的增殖、侵袭及转移鲜有　报道。　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　６２　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠ｌ６３．ｃｏｒｎ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月ＪＯＵＲＮＡｌ　ＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭ　）Ｉ　Ｉ￣Ｆ．ＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２０１３　为了探讨千金藤碱对ＮＳＣＩ　Ｃ的抗肿瘤生物学　作用，笔者首先观察千金藤碱对肺癌Ａ５４９细胞的　毒性，发现千金藤碱可抑制Ａ５４９细胞的生长，且抑　制的效果有浓度和时间的依赖性，这与既往关于千　金藤碱的抗肿瘤作用的结果相似　。研究还发现　千金藤碱可以抑制Ａ５４９细胞的增殖的侵袭和迁　移。由于千金藤碱具有抗氧化和抑制血管生成的作　用，故从氧化应激和肿瘤转移相关因子探讨其可能　的作用机制。ｑＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测发现　千金藤碱处理后，Ｎｒｆ２的下游基因ＨＯ一１和ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低，提示千金藤碱对　Ａ５４９细胞的作用与其调节ＨＯ一１和ＥＧＦＲ的表达　水平相关。　抑制肺癌的侵袭和转移是延长肺癌患者生存时　间，提高治疗效果的方式之一，也是抗肿瘤药物作用　和研制的出发点。本实验探讨了千金藤碱抑制肺癌　细胞的生长、侵袭和迁移，其作用机制可能是通过抑　制Ｈｏ一１和ＥＧＦＲ基因的表达来实现的，但具体内　在的机制尚需要深入研究。希望本研究能为千金藤　碱用于ＮＳＣＩ　Ｃ的治疗研究提供实验和理论依据。　参考文献：　［１３　Ｊｅｍａｌ　Ａ，Ｂｒａｙ　Ｆ，Ｃｅｎｔｅｒ　ＭＭ，ｅｔ　ａ１．Ｇｌｏｂａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔａ—　ｔｉｓｔｉｃｓ［Ｊ］．ｃＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　Ｃｌｉｎ，２０１１，６１（２）：６９　９０．　［２］　陈万青，张思维，邹小农．中国肺癌发病死亡的估计和流　行趋势研究［Ｊ］．中国肺癌杂志，２０１０，１３（５）：４８８—４９２．　［３］　Ｍｏｌｉｎａ　Ｊ　Ｒ，Ｙａｎｇ　Ｐ，Ｃａｓｓｉｖｉ　ＳＤ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉｐ［Ｊ］．Ｍａｙｏ　Ｃｌｉｎ　Ｐｒｏｃ，２００８，８３（５）：５８４—５９４．　［４］　Ｅｓｍｅ　Ｈ，Ｃｅｍｅｋ　Ｍ，Ｓｅｚｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏｘｉ—　ｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ￣．　Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ，２００８，１３（１）：１１２　１１６．　［５］　Ｏｓｂｕｒｎ　ＷＯ，Ｋｅｎｓｌｅｒ　ＴＷ．Ｎｒｆ２　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ａｎ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｔｏｘｉｃ　ｉｎｓｕｌｔｓ［Ｊ］．Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ，２００８，６５９（１／２）：３１　３９．　［６］　Ｈｏｍｍａ　Ｓ，Ｉｓｈｉｉ　Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｎｒｆ２　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｄｒｕｇｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００９，１５（１０）：　３４２３～３４３２．　［７］　Ｈｅｉｎｒｉｃｈ　ＥＬ，Ｗａｌｓｅｒ　ＴＣ，Ｋｒｙｓａｎ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍ—　ｍａｔｏｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｍｅｓｅｎｃｈｙ　ｍａｌ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｉ—　ｅｒｏｅｎｖｉｒｏｎ，２０１１，５（１）：５　１８．　［８］　Ｋｕｄｏ　Ｋ，Ｈａｇｉｗａｒａ　Ｓ，Ｈａｓｅｇａｗａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｐｈａｒａｎ　ｔｈｉｎｅ　ｅｘｅｒｔｓ　ａｎｔｉ——ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｖｉａ　ＮＦ　—ｋａｐｐａ　Ｂ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　Ｉ　ＰＳ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｎ　ｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，２０１０，１７１（１）：１９９　２０４．　［９］　李素芳，林森，张幼仪，等．ｐ３８ＭＡＰＫ参与千金藤素诱　导心肌细胞凋亡［Ｊ］．中网病理生理杂志，２ｏｌ１，２７（４）：　６３８—６４２．　［１Ｏ］Ｋｉｋｕｋａｗａ　Ｙ，Ｏｋｕｎｏ　Ｙ，Ｔａｔｅｔｓｕ　Ｈ．ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ，ａ　ｂｉｓｃｏｃｌａｕｒｉｎｅ　ａｌｋａｌｏｉｄ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎ—　ｃｏ１，２００８，３３（４）：８０７　８ｌ４．　［１　１１　Ｚａｈｅｄｉ　Ｐ，Ｄｅ　Ｓｏｕｚａ　Ｒ，Ｈｕｙｎｈ　Ｉ　，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｍ－ｍｎｔ　ｏｆ　ｍｕｈｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ￣．Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍ，２０１０，８（１）：　２６Ｏ　２６９．　［１２］Ｈａｒａｄａ　Ｋ，Ｆｅｒｄｏｕｓ　Ｔ，Ｉｔａｓｈｉｋｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｐｈａｒａｎ　ｔｈｉｎｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｅｘ　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｉｎ—　ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２００９，３５（５）：１０２５　１０３５．　［１３］Ｂａｂａ　Ｔ，Ｕｒａｍｏｔｏ　Ｈ，Ｔａｋｅｎａｋａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｒｅｓｅｃｔｅｄ　ｎｏｎ—　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｒｅｓｐｉｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，２０１　２，５０　（４）：ｌ５１—１　５６．　ｒ１４］Ｍａｒｅｅｌ　Ｍ，Ｍａｄａｎｉ　Ｉ．Ｔｕｍｏｕｒ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ　ａｔ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｃｈｉｒ　Ｂｅｌｇ，２００６，１０６（６）：６３５—６４０．　［１５］潘灏，王汉东．Ｎｒｆ２对肿瘤的双重作用［Ｊ］．医学研究　生学报，２Ｏｌ２，２５（５）：５４９—５５１．　［１６１　Ｄｅｇｅｓｅ　ＭＳ，Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ　ＪＥ，Ｇａｎｄｉｎｉ　ＮＡ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｉｎｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　１　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＩ　Ｃ）ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｌｉｎｉｃａ１　ｄａｔａ　［Ｊ］．Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，７７（１）：１６８—１７５．　［１７］Ｔｓａｉ　ＪＲ，Ｗａｎｇ　ＨＭ，Ｌｉｕ　ＰＩ　，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｉｎｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　１　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｖａｓｉｖｅ一　ｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｐｏｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ｉｎ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｈｍｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｏｎｃｏｌ（Ｄｏｒｄｒ），２０１２，３５　（６）：４６１　４７１．　［１８］　王淑云，王玲，李栋，等．血红素加氧酶１在人肺癌细　胞中的表达及其对血管生成因子的影响［Ｊ］．山东大学　学报：医学版，２０１ｌ，４９（１２）：２１—２４．　［１９］　Ｓａｓａｋｉ　Ｈ，Ｙｕｋｉｕｅ　Ｈ，Ｍｉｚｕｎｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｓｅｒ　ｔｉｍ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｌｅｖｅｌ　ｉｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．１ｎｔ　Ｊ　ｃｌｉｎ　ｏｎｃｏ［，２００３，８（２）：７９—８２．　［２Ｏ］　Ｐａｐａｉａｈｇａｒｉ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｑ，Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ　ＳＲ，ｅｔ　ａ１．Ｈ　ｙ　ｐｅｒｏｘｉａ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ａｎ　Ｎｒｆ２～ＡＲＥ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ１　ｒｅ　ｓｐｏｎｓｅ　ｖｉａ　ＲＯＳ－ＥＧＦＲ　ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ／ＥＲＫ　ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｎｔｉｏｘｉｄ　Ｒｅｄｏｘ　Ｓｉｇｎａｌ，２００６，８（１／２）：４３　５２．　ｒ２１］Ｙａｍａｄｏｒｉ　Ｔ，Ｉｓｈｉｉ　Ｙ，Ｈｏｍｍａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｒｆ２一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏ　ｇｅｎｅ，２０１２，３１（４５）：４７６８—４７７７．　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｒｎ　安徽中医学院学报第３２卷第２期２０１３年４月Ｊ（）ＵＲＮＡＩ　ＯＦ　ＡＮＨＵＩ　ＴＣＭ　ＣＯＬＬＥＧＥ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．２　Ａｐｒ．２０１３　Ｅ２２］Ｆｕｒｕｓａｗａ　Ｓ，ｗｕ　Ｊ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂｉｓｃｏｃｌａｕｒｉｎｅ　ａｌｋａ—　ｌｏｉｄ　ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ　ｏｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　２００１。８２（２）：２００　２１４．　６３　Ｅ２ｓ］Ｉｋｅｄａ　Ｒ，Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ　ＬＣ，Ｌａｕ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ一　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ，ｓｈｏｃｋ，ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓＥＪ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，２００７，８０（１２）：１０７３　１０７９．　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ＥＪ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，　２０１０，３８（２）：５１３－５ｌ９．　［２３］Ｓｅｕｂｗａｉ　Ｗ，Ｖａｅｔｅｅｗｏｏｔｔａｃｈａｒｎ　Ｋ，Ｈｉｙｏｓｈｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．　Ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ　ｅｘｅｒｔｓ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ｃｈｏｌａｎｇｉｏ　１－２６］　Ｈａｒａｄａ　Ｋ，Ｆｅｒｄｏｕｓ　Ｔ，Ｉｔａｓｈｉｋｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ　ａｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｏｐｙ—　ｒｉｍｉｄｉｎｅ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ａｇｅｎｔ，ｓ－ｌ。ｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＮＦ—ｋａｐｐａ　Ｂ　ＥＪ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ，　２Ｏ１０，１０１（７）：Ｉ５９０—１５９５．　Ｅ２４２　Ｗｕ　Ｊ，Ｓｕｚｕｋｉ　Ｈ，Ｚｈｏｕ　ＹＷ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ　ａｃｔｉ　ｖａｔｅｓ　ｃａｓｐａｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｊ　ｕｒｋａｔ　ａｎｄ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００９，２９（４）：１２６３　１２７０．　（收稿日期：２０１３　０３—０７）　Ｋ５６２　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　０ｆ　Ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　Ａ５　４　９　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｍｅ　Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－－１　ａｎｄ　Ｅｐｉｄｅｒ・－　ｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　Ａ５　４　９　Ｃｅｌｌｓ　Ａ　Ｋｅ—ｌｏｎｇ　，　～Ｇ　Ｙｕａｎ－ｊｉｎ　，ＺＨ０ＵＨ　，Ｌ，Ｌ　，ＺＨ＿ＡＮＧ　Ｔｅｎｇ—ｙｕｅ。，ＬＵ０　Ｘｉａｏ—ｙｉｎｇ。　（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｈｕｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ　’Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｈｕｉ　Ｈｅｆｅｉ　２３００３８，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｎｈｕｉ　Ｈｅ　ｆｅｉ　２３００３２，　Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏＪ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊ　ｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３２，Ｃｈｉｎａ）　ＥＡｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ（ＣＥＰ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ，ｍｉｇｒａ—　ｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｉｉｎｅ　Ａ５４９　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１（ＨＯ１）　ａｎｄ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｉｎ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＥＰ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ａｓｓａｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｏｉｎｔｓ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＣＥＰ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ａｎ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ——ｃｏａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　ｃｈａｍ——　ｂｅｒｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＨＯ一１　ａｎｄ　ＥＧＦＲ　ｉｎ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓ—　ｕｒｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＣＥＰ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＥＰ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ．Ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０　ｇ／ｍｌ　ＣＥＰ　ｆｏｒ　２４　ｈ，Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ｂｅｃａｍｅ　ｓｍａｌｌｅｒ，ｓｈｒｕｎｋｅｎ，ａｎｄ　ｒｏｕｎｄｅｄ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｆｅｗｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ｃｒｏｓｓｅｄ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎ—　ｓｗｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａ５　４　９　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＥＰ（＞５．０　ｇ／ｍ１）ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜　０．０５）．ＣＥＰ（１０．０　ｇ／ｍ１）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＨＯ一１　ａｎｄ　ＥＧ—　ＦＲ　ｉｎ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＣＥＰ　ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ一１　ａｎｄ　ＥＧＦＲ　ｉｎ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＥＰ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．　ＥＫｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ；ｎｏｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ；Ａ５４９　ｃｅｌｌ；ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ—ｌ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ